اصل عملیات HPLC کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا آماده شدن برای عزم

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا آلاینده ها در آب های طبیعی و پساب

معرفی

فصل 1. مفاهیم اساسی و طبقه بندی روش های کروماتوگرافی مایع

1.1 تجهیزات کروماتوگرافی مایع

فصل 2. ماهیت HPLC

2.1 کاربرد

فصل 3. نمونه هایی از استفاده از HPLC در تجزیه و تحلیل اشیاء محیطی

فصل 4. تجهیزات HPLC

ادبیات

کاربرد

معرفی

روش های کروماتوگرافیاغلب برای شناسایی و تعیین کمیت مواد آلی با ساختارهای مشابه ضروری است. با این حال، کروماتوگرافی گازی و کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا بیشترین کاربرد را برای تجزیه و تحلیل معمول آلاینده های محیطی دارند. تجزیه و تحلیل کروماتوگرافی گازی آلاینده های آلی در آب آشامیدنی و فاضلاب در ابتدا بر اساس استفاده از ستون های بسته بندی شده بود و بعداً ستون های مویرگی کوارتز گسترده شد. قطر داخلی ستون های مویین معمولاً 0.20-0.75 میلی متر، طول - 30-105 متر است. نتایج بهینه هنگام تجزیه و تحلیل آلاینده ها در آب اغلب در هنگام استفاده از ستون های مویین با ضخامت فیلم های مختلف سیلیکون های متیل فنیل با محتوای گروه فنیل 5 به دست می آید. و 50 درصد نقطه ضعف تکنیک های کروماتوگرافی با استفاده از ستون های مویرگی اغلب سیستم معرفی نمونه است. سیستم های معرفی نمونه را می توان به دو گروه تقسیم کرد: جهانی و انتخابی. انواع جهانی شامل سیستم های تزریق اسپلیت و بدون تقسیم، تزریق "سرد" به ستون و تبخیر با برنامه ریزی دما است. هنگامی که از ورودی انتخابی استفاده می شود، پاکسازی با ضبط متوسط ​​در یک تله، تجزیه و تحلیل فضای سر و غیره. هنگام استفاده از سیستم های تزریق جهانی، کل نمونه وارد ستون می شود؛ با تزریق انتخابی، تنها یک کسر مشخص معرفی می شود. نتایج به‌دست‌آمده با تزریق انتخابی به طور قابل‌توجهی دقیق‌تر هستند، زیرا کسر ورودی به ستون فقط حاوی مواد فرار است و این تکنیک می‌تواند کاملاً خودکار باشد.

آشکارسازهای کروماتوگرافی گازی مورد استفاده در پایش آلاینده ها اغلب به جهانی تقسیم می شوند که به هر جزء در فاز متحرک پاسخ می دهند و انتخابی که به حضور گروه خاصی از مواد با ویژگی های شیمیایی مشابه در فاز متحرک پاسخ می دهد. آشکارسازهای جهانی شامل یونیزاسیون شعله، انتشار اتمی، آشکارسازهای طیف سنجی جرمی و طیف سنجی مادون قرمز است. آشکارسازهای انتخابی مورد استفاده در تجزیه و تحلیل آب عبارتند از: جذب الکترون (انتخابی به مواد حاوی اتم های هالوژن)، ترمیونیک (انتخابی به ترکیبات حاوی نیتروژن و فسفر)، فتویونیزاسیون (انتخابی به هیدروکربن های آروماتیک)، آشکارساز هدایت الکترولیتی (انتخابی به ترکیبات حاوی اتم های هالوژن). ، گوگرد و نیتروژن). حداقل مقادیر قابل تشخیص مواد از نانوگرم تا پیکوگرم در ثانیه متغیر است.

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا(HPLC) یک روش ایده آل برای تعیین تعداد زیادی از ترکیبات حساس به حرارت است که با کروماتوگرافی گازی قابل تجزیه و تحلیل نیستند. مواد شیمیایی کشاورزی مدرن، که شامل متیل کربنات ها و حشره کش های ارگانوفسفره و سایر مواد غیر فرار هستند، اغلب با استفاده از کروماتوگرافی مایع مورد تجزیه و تحلیل قرار می گیرند. کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا به طور فزاینده ای در میان روش های دیگر مورد استفاده در پایش محیطی رایج می شود، همچنین به این دلیل که چشم اندازهای درخشانی از نظر اتوماسیون آماده سازی نمونه دارد.

فصل 1. مفاهیم اساسی و طبقه بندی روش های کروماتوگرافی مایع

کروماتوگرافی مایع بسته به نوع حامل فاز ساکن به چندین کلاس تقسیم می شود. ابزار دقیق کاغذ و کروماتوگرافی لایه نازک منجر به استفاده گسترده از این روش ها در عمل تحلیلی شده است. با این حال، قابلیت‌های زیاد کروماتوگرافی مایع ستونی باعث بهبود تجهیزات این روش کلاسیک شد و منجر به معرفی سریع HPLC شد. عبور ماده شوینده از ستون تحت فشار بالا باعث شد تا به دلیل استفاده از جاذب ریز پراکنده، سرعت آنالیز به طور چشمگیری افزایش یابد و راندمان جداسازی به میزان قابل توجهی افزایش یابد. روش HPLC در حال حاضر امکان جداسازی، تجزیه و تحلیل کمی و کیفی مخلوط های پیچیده ترکیبات آلی را فراهم می کند.

بر اساس مکانیسم برهمکنش ماده در حال جداسازی (شستشو) با فاز ساکن، جذب، پارتیشن، تبادل یونی، حذف، جفت یون، تبادل لیگاند و کروماتوگرافی میل ترکیبی متمایز می شوند.

کروماتوگرافی جذبی. جداسازی با کروماتوگرافی جذبی در نتیجه برهمکنش ماده جدا شده با یک جاذب مانند اکسید آلومینیوم یا سیلیکاژل که مراکز قطبی فعال روی سطح دارد، انجام می شود. حلال (شوینده) مایعی غیر قطبی است. مکانیسم جذب شامل یک برهمکنش خاص بین سطح قطبی جاذب و بخش های قطبی (یا قابلیت پلاریزاسیون) مولکول های جزء تجزیه شده است (شکل 1).

برنج. 1. کروماتوگرافی مایع جذبی.

کروماتوگرافی پارتیشن. در نسخه توزیع کروماتوگرافی مایع، جداسازی مخلوطی از مواد به دلیل تفاوت در ضرایب توزیع آنها بین دو فاز غیر قابل امتزاج - شوینده (فاز متحرک) و فاز واقع در جاذب (فاز ثابت) انجام می شود.

در فاز عادیکروماتوگرافی مایع پارتیشن از یک شوینده غیرقطبی و گروه های قطبی پیوند شده بر روی سطح جاذب (اغلب سیلیکا ژل) استفاده می کند. آلکیل کلروسیلان های جایگزین حاوی گروه های قطبی مانند نیتریل، گروه آمینه و غیره به عنوان اصلاح کننده سطح سیلیکا ژل (فازهای پیوندی) استفاده می شوند (شکل 2). استفاده از فازهای پیوندی امکان کنترل دقیق خواص جذب سطح فاز ساکن و دستیابی به راندمان جداسازی بالا را فراهم می کند.

برنج. 2. کروماتوگرافی پارتیشن با فاز پیوندی (گزینه فاز نرمال).

فاز معکوسکروماتوگرافی مایع بر اساس توزیع اجزای مخلوط بین یک شوینده قطبی و گروه های غیر قطبی (زنجیره های بلند آلکیل) پیوند شده بر روی سطح جاذب است (شکل 3).

برنج. 3. کروماتوگرافی پارتیشن با فاز پیوندی (گزینه فاز معکوس).

یک نوع کم استفاده از کروماتوگرافی مایع فاز پشتیبانی شده، جایی است که یک فاز ساکن مایع روی یک تکیه گاه ثابت قرار می گیرد.

انحصاری (ژل نافذ)کروماتوگرافی نوعی از کروماتوگرافی مایع است که در آن جداسازی مواد به دلیل توزیع مولکول ها بین حلال واقع در منافذ جاذب و حلالی که بین ذرات آن جریان دارد، رخ می دهد.

افینکروماتوگرافی بر اساس برهمکنش‌های خاص پروتئین‌های جدا شده (آنتی بادی‌ها) با مواد (آنتی‌ژن‌ها) پیوند شده روی سطح جاذب (رزین مصنوعی) است که به طور انتخابی با پروتئین‌ها کمپلکس (کونژوگه) تشکیل می‌دهند.

کروماتوگرافی تبادل یونی، جفت یونی و تبادل لیگاند عمدتاً در تجزیه و تحلیل معدنی استفاده می شود.

پارامترهای اساسی جداسازی کروماتوگرافی

پارامترهای اصلی جداسازی کروماتوگرافی، حجم نگهداری و زمان ماند جزء مخلوط هستند (شکل 4).

زمان ماند tR زمان سپری شده از لحظه ورود نمونه به ستون تا آزاد شدن حداکثر پیک مربوطه است. با ضرب زمان ماند در سرعت حجمی مایع شوینده F، حجم احتباس VR را بدست می آوریم:

زمان ماند تصحیح شده زمان سپری شده از ظهور حداکثر پیک جزء جذب نشده تا پیک ترکیب مربوطه است:

tR" = tR - t0 ;

حجم حفظ نرمال شده یا اصلاح شده، حجم نگهداری اصلاح شده برای حجم مرده ستون V0 است، یعنی حجم نگهداری جزء جذب نشده:

VR" = VR - V0;

یکی از ویژگی های احتباس همچنین ضریب ظرفیت k است که به عنوان نسبت جرم یک ماده در فاز ساکن به جرم یک ماده در فاز متحرک تعریف می شود: k" = mn / mp.

مقدار k" را می توان به راحتی از کروماتوگرام تعیین کرد:

مهمترین پارامترهای جداسازی کروماتوگرافی، کارایی و گزینش پذیری آن است.

راندمان ستون که با ارتفاع صفحات نظری (HETP) و نسبت معکوس با تعداد آنها (N) اندازه‌گیری می‌شود، بیشتر است، هر چه پیک ماده آزاد شده در همان زمان ماند باریک‌تر باشد. مقدار کارایی را می توان از کروماتوگرام با استفاده از فرمول زیر محاسبه کرد:

N = 5.54. (tR / 1/2) 2،

جایی که tR- زمان ماندگاری،

w 1/2 - عرض قله در نیم ارتفاع

با دانستن تعداد صفحات نظری در هر ستون، طول ستون L و متوسط ​​قطر دانه جاذب dc، به راحتی می توان مقادیر ارتفاع معادل صفحه نظری (HETT) و ارتفاع کاهش یافته (RHETT) را بدست آورد:

HETT = L/N PVET = HETT/d c

این ویژگی ها امکان مقایسه کارایی انواع ستون ها، ارزیابی کیفیت جاذب و کیفیت پرکردن ستون ها را فراهم می کند.

گزینش پذیری برای جداسازی دو ماده با معادله تعیین می شود:

هنگام در نظر گرفتن جداسازی مخلوطی از دو جزء، درجه جداسازی RS نیز یک پارامتر مهم است:

;

اگر مقدار RS بزرگتر یا مساوی 1.5 باشد، پیک ها حل شده در نظر گرفته می شوند.

پارامترهای اصلی کروماتوگرافی با معادله زیر برای وضوح مرتبط هستند:

;

عوامل تعیین کننده گزینش پذیری جداسازی عبارتند از:

1) ماهیت شیمیایی جاذب؛

2) ترکیب حلال و اصلاح کننده های آن؛

3) ساختار شیمیایی و خواص اجزای مخلوط جدا شده.

4) دمای ستون

1.1 تجهیزات کروماتوگرافی مایع

در کروماتوگرافی مایع مدرن، ابزارهایی با درجات مختلف پیچیدگی استفاده می شود - از ساده ترین سیستم ها تا کروماتوگرافی های کلاس بالا مجهز به دستگاه های اضافی مختلف.

در شکل 4. یک نمودار بلوکی از کروماتوگرافی مایع ارائه شده است که حاوی حداقل مجموعه اجزای مورد نیاز، به یک شکل یا دیگری، موجود در هر سیستم کروماتوگرافی است.

برنج. 4. بلوک دیاگرام کروماتوگرافی مایع.

پمپ (2) برای ایجاد جریان ثابت حلال طراحی شده است. طراحی آن در درجه اول توسط فشار عملیاتی در سیستم تعیین می شود. برای کار در محدوده 10-500 مگاپاسکال از پمپ های پلانجری (سرنگی) یا پیستونی استفاده می شود. نقطه ضعف اولی نیاز به توقف های دوره ای برای پر شدن با شوینده است و دومی پیچیدگی بیشتر طراحی و در نتیجه قیمت بالا است. برای سیستم های ساده با فشارهای عملیاتی پایین 1-5 مگاپاسکال، پمپ های پریستالتیک ارزان قیمت با موفقیت مورد استفاده قرار می گیرند، اما از آنجایی که دستیابی به فشار و سرعت جریان ثابت دشوار است، استفاده از آنها به کارهای آماده سازی محدود می شود.

انژکتور (3) تضمین می کند که نمونه ای از مخلوطی از اجزای جدا شده با قابلیت تکرار نسبتاً بالا وارد ستون می شود. سیستم‌های ساده تزریق نمونه «توقف جریان» نیاز به توقف پمپ دارند و بنابراین راحت‌تر از پیپت‌های حلقه‌ای توسعه‌یافته توسط Reodyne هستند.

ستون های HPLC (4) لوله های فولادی ضد زنگ با دیواره ضخیم هستند که می توانند فشارهای بالا را تحمل کنند. تراکم و یکنواختی بسته بندی ستون با جاذب نقش مهمی دارد. ستون های شیشه ای دیواره ضخیم با موفقیت برای کروماتوگرافی مایع کم فشار استفاده می شوند. دمای ثابت توسط ترموستات (5) تضمین می شود.

آشکارسازهای (6) برای کروماتوگرافی مایع دارای یک سلول جریان هستند که در آن اندازه‌گیری مداوم برخی از ویژگی‌های مایع شوینده جریان دارد. محبوب ترین انواع آشکارسازهای عمومی عبارتند از: شکست سنج ها که ضریب شکست را اندازه گیری می کنند و آشکارسازهای اسپکتروفتومتری که جذب یک حلال را در طول موج ثابت (معمولا در ناحیه فرابنفش) اندازه گیری می کنند. از مزایای رفرکتومترها (و معایب اسپکتروفتومترها) می توان به حساسیت کم به نوع ترکیب تعیین شده اشاره کرد که ممکن است حاوی گروه های کروموفور نباشد. از سوی دیگر، استفاده از رفرکتومترها به سیستم های ایزوکراتیک (با ترکیب شوینده ثابت) محدود می شود، بنابراین استفاده از گرادیان حلال در این حالت غیرممکن است.

ستون‌های HPLC که اغلب در تجزیه و تحلیل آلاینده‌های محیطی استفاده می‌شوند، 25 سانتی‌متر طول و قطر داخلی 4.6 میلی‌متر دارند و با ذرات سیلیکاژل کروی 5 تا 10 میکرومتری که با گروه‌های اکتادسیلی پیوند شده‌اند، بسته‌بندی شده‌اند. در سال‌های اخیر، ستون‌هایی با قطر داخلی کوچک‌تر پر از ذرات کوچک‌تر در دسترس قرار گرفته‌اند. استفاده از چنین ستون هایی منجر به کاهش مصرف حلال و زمان تجزیه و تحلیل، افزایش حساسیت و راندمان جداسازی می شود و همچنین مشکل اتصال ستون ها به آشکارسازهای طیفی را ساده می کند. ستون هایی با قطر داخلی 3.1 میلی متر به کارتریج ایمنی (پیش ستون) برای افزایش عمر مفید و بهبود تکرارپذیری تحلیلی مجهز شده اند.

آشکارسازهای مورد استفاده در ابزارهای مدرن HPLC معمولاً یک آشکارساز آرایه دیود UV، یک آشکارساز فلورسنت و یک آشکارساز الکتروشیمیایی هستند.

باید در نظر داشت که در کار عملی، جداسازی اغلب نه از طریق یک، بلکه از طریق چندین مکانیسم به طور همزمان اتفاق می افتد. بنابراین، جداسازی حذف می‌تواند توسط اثرات جذب، جداسازی جذب توسط اثرات توزیع، و بالعکس پیچیده شود. علاوه بر این، هرچه تفاوت بین مواد موجود در نمونه از نظر درجه یونیزاسیون، بازی یا اسیدیته، وزن مولکولی، قطبش پذیری و سایر پارامترها بیشتر باشد، احتمال مکانیسم جداسازی متفاوت برای چنین موادی بیشتر است.

در عمل، گسترده ترین کروماتوگرافی «فاز معکوس» (توزیع) است که در آن فاز ثابت قطبی نیست، اما فاز متحرک قطبی است (یعنی برعکس کروماتوگرافی «فاز مستقیم»).

در اکثر آزمایشگاه‌های سراسر جهان، گروهی متشکل از 16 PAH اولویت‌دار توسط HPLC یا CMS آنالیز می‌شوند.

فصل 2. ذات HPLC

در کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)، ماهیت فرآیندهای رخ داده در ستون کروماتوگرافی به طور کلی با فرآیندهای کروماتوگرافی گازی یکسان است. تنها تفاوت در استفاده از مایع به عنوان یک فاز ثابت است. به دلیل چگالی بالای فازهای متحرک مایع و مقاومت بالای ستون ها، کروماتوگرافی گازی و مایع در ابزار دقیق تفاوت زیادی دارند.

در HPLC معمولاً از حلال های خالص یا مخلوط آنها به عنوان فازهای متحرک استفاده می شود.

برای ایجاد جریانی از حلال خالص (یا مخلوطی از حلال‌ها)، که در کروماتوگرافی مایع، شوینده نامیده می‌شود، از پمپ‌های موجود در سیستم هیدرولیک کروماتوگرافی استفاده می‌شود.

کروماتوگرافی جذب در نتیجه برهمکنش یک ماده با جاذب هایی مانند سیلیکاژل یا اکسید آلومینیوم که مراکز فعال روی سطح دارند، انجام می شود. تفاوت در توانایی برهمکنش با مراکز جذب مولکول های نمونه مختلف منجر به جدا شدن آنها به مناطق در حین حرکت با فاز متحرک در امتداد ستون می شود. تفکیک منطقه ای اجزای به دست آمده در این مورد به برهمکنش با حلال و جاذب بستگی دارد.

بیشترین کاربرد در HPLC جاذب های سیلیکاژل با حجم، سطح و قطر منافذ متفاوت است. اکسید آلومینیوم و سایر جاذب ها بسیار کمتر مورد استفاده قرار می گیرند. دلیل اصلی این امر:

استحکام مکانیکی ناکافی، که اجازه بسته بندی و استفاده در فشارهای بالا مشخصه HPLC را نمی دهد.

سیلیکاژل، در مقایسه با اکسید آلومینیوم، دارای طیف وسیع تری از تخلخل، سطح و قطر منافذ است. فعالیت کاتالیزوری به طور قابل توجهی بیشتر اکسید آلومینیوم منجر به اعوجاج نتایج تجزیه و تحلیل به دلیل تجزیه اجزای نمونه یا جذب شیمیایی برگشت ناپذیر آنها می شود.

آشکارسازهای HPLC

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) برای شناسایی مواد غیر فرار قطبی استفاده می شود که به دلایلی نمی توانند به شکل مناسب برای کروماتوگرافی گازی حتی به شکل مشتقات تبدیل شوند. چنین موادی به ویژه شامل اسیدهای سولفونیک، رنگ های محلول در آب و برخی آفت کش ها، به عنوان مثال مشتقات فنیل اوره است.

آشکارسازها:

آشکارساز UV روی ماتریس دیود. یک "ماتریس" از فتودیودها (بیش از دویست نفر از آنها) به طور مداوم سیگنال ها را در مناطق UV و قابل مشاهده طیف ثبت می کند، بنابراین ضبط طیف UV-B را در حالت اسکن فراهم می کند. این به شما امکان می دهد تا به طور مداوم، با حساسیت بالا، طیف بدون تحریف اجزایی را که به سرعت از یک سلول خاص عبور می کنند، ضبط کنید.

در مقایسه با تشخیص تک طول موج، که اطلاعاتی در مورد خلوص اوج ارائه نمی‌کند، توانایی مقایسه طیف کامل یک آرایه دیود، درجه اطمینان بسیار بیشتری را در نتیجه شناسایی فراهم می‌کند.

آشکارساز فلورسانس محبوبیت زیاد آشکارسازهای فلورسنت به دلیل گزینش پذیری و حساسیت بسیار بالای آنها و این واقعیت است که بسیاری از آلاینده های محیطی فلورسنت می کنند (مثلاً هیدروکربن های پلی آروماتیک).

یک آشکارساز الکتروشیمیایی برای تشخیص موادی که به راحتی اکسید یا احیا می شوند استفاده می شود: فنل ها، مرکاپتان ها، آمین ها، مشتقات آروماتیک نیترو و هالوژن، آلدئیدها، کتون ها، بنزیدین ها.

جداسازی کروماتوگرافی یک مخلوط روی یک ستون به دلیل پیشرفت آهسته PF زمان زیادی می برد. برای سرعت بخشیدن به فرآیند، کروماتوگرافی تحت فشار انجام می شود. این روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) نامیده می شود.

نوسازی تجهیزات مورد استفاده در کروماتوگرافی ستونی مایع کلاسیک، آن را به یکی از امیدوارکننده ترین و مدرن ترین روش های آنالیز تبدیل کرده است. کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا روشی مناسب برای جداسازی، جداسازی مقدماتی و آنالیز کمی و کیفی ترکیبات غیر فرار حرارت پذیر با وزن مولکولی کم و بالا است.

بسته به نوع جاذب مورد استفاده، این روش از 2 گزینه کروماتوگرافی استفاده می کند: در یک جاذب قطبی با استفاده از یک شوینده غیر قطبی (گزینه فاز مستقیم) و در یک جاذب غیر قطبی با استفاده از یک شوینده قطبی - به اصطلاح فاز معکوس بالا. کروماتوگرافی مایع عملکردی (RPHPLC).

در طول انتقال از شوینده به شوینده، تعادل در شرایط HPLC چندین برابر سریعتر از شرایط جاذب های قطبی و PF های غیر آبی برقرار می شود. در نتیجه این امر و همچنین راحتی کار با مواد شوینده آبی و آبی الکلی، OFVLC اکنون محبوبیت زیادی به دست آورده است. اکثر آنالیزهای HPLC با استفاده از این روش انجام می شود.

آشکارسازها خروجی یک جزء جداگانه از ستون با استفاده از یک آشکارساز ثبت می شود. برای ثبت، می توانید از تغییر در هر سیگنال تحلیلی که از فاز متحرک می آید و مرتبط با ماهیت و کمیت جزء مخلوط است استفاده کنید. کروماتوگرافی مایع از سیگنال های تحلیلی مانند جذب نور یا انتشار نور محلول خروجی (آشکارسازهای فتومتریک و فلورمتری)، ضریب شکست (آشکارسازهای شکست سنجی)، پتانسیل و هدایت الکتریکی (آشکارسازهای الکتروشیمیایی) و غیره استفاده می کند.

سیگنال شناسایی مداوم توسط یک ضبط کننده ضبط می شود. کروماتوگرام دنباله ای از سیگنال های آشکارساز است که بر روی نوار ضبط کننده ضبط می شود و هنگامی که اجزای جداگانه یک مخلوط از ستون خارج می شوند ایجاد می شود. اگر مخلوط جدا شود، پیک های منفرد روی کروماتوگرام خارجی قابل مشاهده است. موقعیت پیک در کروماتوگرام به منظور شناسایی ماده، ارتفاع یا مساحت قله - به منظور تعیین کمی استفاده می شود.

2.1 کاربرد

HPLC به طور گسترده در زمینه های زیر از آنالیز شیمیایی استفاده می شود (اشیاء تجزیه و تحلیل که در آنها HPLC عملاً رقابتی ندارد برجسته می شوند):

· کنترل کیفیت مواد غذایی - تونیک ها و افزودنی های طعم دهنده، آلدئیدها، کتون ها، ویتامین ها، قندها، رنگ ها، مواد نگهدارنده، داروهای هورمونی، آنتی بیوتیک ها، تریازین، کاربامات و سایر آفت کش ها، مایکوتوکسین ها، نیتروزامین ها، هیدروکربن های آروماتیک چند حلقه ای و غیره.

· حفاظت از محیط زیست - فنل ها، ترکیبات نیترو آلی، هیدروکربن های آروماتیک تک و چند حلقه ای، تعدادی آفت کش، آنیون های اصلی و کاتیون ها.

· پزشکی قانونی - داروها، مواد منفجره و رنگهای آلی، داروهای قوی.

· صنعت داروسازی - هورمون های استروئیدی، تقریباً تمام محصولات سنتز آلی، آنتی بیوتیک ها، آماده سازی های پلیمری، ویتامین ها، آماده سازی های پروتئینی.

· پزشکی - مواد بیوشیمیایی و دارویی ذکر شده و متابولیت های آنها در مایعات بیولوژیکی (اسیدهای آمینه، پورین ها و پیریمیدین ها، هورمون های استروئیدی، لیپیدها) در تشخیص بیماری ها، تعیین میزان دفع داروها از بدن به منظور دوز فردی آنها.

· کشاورزی - تعیین نیترات و فسفات در خاک برای تعیین مقدار کود مورد نیاز مصرفی، تعیین ارزش غذایی خوراک (اسیدهای آمینه و ویتامین ها)، آنالیز آفت کش ها در خاک، آب و محصولات کشاورزی.

· بیوشیمی، شیمی بیورگانیک، مهندسی ژنتیک، بیوتکنولوژی - قندها، لیپیدها، استروئیدها، پروتئین ها، اسیدهای آمینه، نوکلئوزیدها و مشتقات آنها، ویتامین ها، پپتیدها، الیگونوکلئوتیدها، پورفیرین ها و غیره.

· شیمی آلی - تمام محصولات پایدار سنتز آلی، رنگ ها، ترکیبات گرما، ترکیبات غیر فرار. شیمی معدنی (تقریبا همه ترکیبات محلول به شکل یون و ترکیبات پیچیده).

· کنترل کیفیت و ایمنی مواد غذایی، نوشیدنی های الکلی و غیر الکلی، آب آشامیدنی، مواد شیمیایی خانگی، عطرها در تمام مراحل تولید آنها.

· تعیین ماهیت آلودگی در محل یک فاجعه یا اضطرار ساخته دست بشر.

· کشف و تجزیه و تحلیل مواد مخدر، قوی، سمی و مواد منفجره.

· تعیین وجود مواد مضر (هیدروکربن های چند حلقه ای و دیگر معطر، فنل ها، آفت کش ها، رنگ های آلی، یون های فلزات سنگین، قلیایی و قلیایی خاکی) در پساب های مایع، انتشار هوا و زباله های جامد از شرکت ها و موجودات زنده.

· نظارت بر فرآیندهای سنتز آلی، پالایش نفت و زغال سنگ، تولید بیوشیمیایی و میکروبیولوژیکی.

تجزیه و تحلیل کیفیت خاک برای کوددهی، وجود آفت کش ها و علف کش ها در خاک، آب و محصولات، و همچنین ارزش غذایی خوراک؛ وظایف تحلیلی پژوهشی پیچیده؛ به دست آوردن مقادیر بسیار کوچکی از مواد فوق خالص

فصل 3. نمونه هایی از استفاده از HPLC در تجزیه و تحلیل اشیاء محیطی

HPLC روشی برای نظارت بر PAH در اشیاء محیطی است

برای هیدروکربن‌های آروماتیک چند حلقه‌ای (PAHs)، مواد سمی زیست محیطی از کلاس خطر 1، سطوح بسیار پایین حداکثر غلظت‌های مجاز (MACs) در اجسام طبیعی ایجاد شده است. تعیین PAH در سطح MPC و پایین‌تر یکی از پیچیده‌ترین مسائل تحلیلی است و برای حل آن‌ها از روش‌های تحلیلی پیشرفته (GC-MS، GC، HPLC) استفاده می‌شود. هنگام انتخاب یک روش برای نظارت، به ویژگی های اصلی در نظر گرفته شده - حساسیت و انتخاب، سرعت و کارایی اضافه می شود، زیرا نظارت شامل تجزیه و تحلیل سریال است. گزینه HPLC در ستون های کوتاه و با قطر کوچک تا حد زیادی این الزامات را برآورده می کند. با استفاده از این روش، نویسندگان روش‌هایی را برای نظارت بر بنزو[a]پیرن در سه محیط طبیعی توسعه دادند و تأیید کردند: آئروسل، پوشش برف و آب‌های سطحی. مشخصه‌های این روش‌ها عبارتند از: آماده‌سازی نمونه استاندارد ساده، از جمله استخراج PAHs با حلال‌های آلی و غلظت عصاره، وارد کردن مستقیم عصاره غلیظ به ستون کروماتوگرافی، استفاده از تشخیص فوتومتری چند طول موج در ناحیه UV طیف، شناسایی پیک های PAH در کروماتوگرام ها با استفاده از دو پارامتر زمان ماند و نسبت طیفی. خطای کل هنگام تعیین بنزو[a]پیرن در آئروسل در محدوده غلظت از 0.3 تا 450 نانوگرم بر متر مکعب، در آب های سطحی در محدوده غلظت 10 تا 1000 نانوگرم در لیتر، در پوشش برف در سطح از 10٪ تجاوز نمی کند. محدوده چگالی از 0.5 تا 50 میکروگرم بر متر مربع. برای تعیین همزمان PAH های اولویت (تا 12 ترکیب) و ثبت پیک های ناهمگن آنالیت ها، جداسازی مکرر عصاره با تغییر گزینش پذیری فاز متحرک، طول موج تشخیص و دمای ستون، با در نظر گرفتن فرد پیشنهاد شد. خواص PAH در حال تعیین است.

1 . کیفیت هوای محیط غلظت جرمی بنزو[a] پیرن. روش انجام اندازه گیری ها با استفاده از روش HPLC. گواهینامه MVI شماره 01-2000.

2 . کیفیت فاضلاب سطحی و تصفیه شده غلظت جرمی بنزو[a] پیرن. روش انجام اندازه گیری ها با استفاده از روش HPLC. گواهینامه MVI شماره 01-2001.

3 . کیفیت پوشش برفی غلظت جرمی بنزو[a] پیرن. روش انجام اندازه گیری ها با استفاده از روش HPLC. گواهینامه MVI شماره 02-2001.

حذف آنیلین از محلول های آبی با استفاده از ضایعات حاصل از احیای آلومینوگرمیک مقیاس مس آسیاب

مشکل حذف هیدروکربن ها از فاضلاب یک کار فوری است. در بسیاری از صنایع شیمیایی، پتروشیمی و غیره، آنیلین و مشتقات آن تشکیل می شود که مواد سمی هستند. آنیلین یک ماده بسیار سمی است، MPC - 0.1 میلی گرم بر متر مکعب. آنیلین و مشتقات آن در آب محلول هستند و بنابراین با رسوب گرانشی قابل حذف نیستند.

یکی از بهترین روش‌ها برای تصفیه فاضلاب از آلاینده‌های آلی، استفاده از جاذب‌های معدنی و آلی است که می‌توانند احیا شوند (آلومینوسیلیکات‌ها، رس‌های اصلاح‌شده، چوب، الیاف و غیره) و غیرقابل بازسازی (کربن فعال، مواد پلیمری ماکرو متخلخل و غیره). ).

جاذب های قابل بازسازی می توانند مواد آلی با قطبیت های مختلف را از آب حذف کنند. جستجو برای جاذب های موثر یک کار فوری است.

این گزارش نتایج یک مطالعه در زمینه استفاده از مقیاس مس نورد شده از کارخانه کابل ایروان (OPMOErKZ) به عنوان جاذب آنیلین را ارائه می دهد.

مطالعات کروماتوگرافی بر روی یک دستگاه کروماتوگرافی HPLC / کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا / سیستم ها (Waters 486 - آشکارساز، Waters 600S - کنترل کننده، Waters 626 - Pump)، روی یک ستون 250 x 4 میلی متر پر از جاذب های مورد مطالعه ما، سیار انجام شد. سرعت فاز 1 میلی‌لیتر بر متر بود / فاز متحرک حلال‌هایی است که در حال مطالعه هستیم/ آشکارساز UV-254 است. تجزیه و تحلیل طیف سنجی UV بر روی اسپکتروفتومتر Specord-50 انجام شد؛ طیف ها با استفاده از برنامه کامپیوتری ASPECT PLUS به دست آمد.

بخش های دقیق وزن شده جاذب ها به حجم های خاصی از آنیلین در آب اضافه شد که غلظت های اولیه آن متفاوت بود. مخلوط به مدت 6 ساعت کاملاً تکان داده شد و سپس نمونه رها شد تا ته نشین شود. جذب تقریباً در عرض 48 ساعت تکمیل می‌شود.میزان آنیلین رسوب‌شده توسط اسپکتروفتومتری UV و همچنین آنالیز رفرکتومتری تعیین می‌شود.

ابتدا، خواص جذب OPMOErKZ هنگام حذف آنیلین از محلول در تتراکلرید کربن مورد مطالعه قرار گرفت. معلوم شد که آنیلین جاذب 3 را بهترین جذب می کند (جدول).

اندازه گیری ها همچنین برای محلول های آبی آنیلین در غلظت های 0.01-0.0001 مول در لیتر انجام شد. جدول داده های یک راه حل 0.01 M را نشان می دهد.

جذب آنیلین توسط جاذب های مختلف از محلول آبی 0.01 مولار آنیلین در دمای 20 درجه سانتی گراد

قبلا مشخص شده بود که جذب در محدوده غلظت مشخص شده افزایش می یابد و به طور خطی به ضریب شکست بستگی دارد. مقدار آنیلین از رابطه گرافیکی "ضریب شکست - غلظت مولی" تعیین شد و با داده های کروماتوگرافی مایع و آنالیز طیفی UV تصحیح شد.

فعال ترین جاذب برای محلول های آبی جاذب 3 است. مقدار آلاینده جذب شده به عنوان اختلاف بین مقدار کل آلاینده اضافه شده به محلول اولیه و باقیمانده آن در محلول نهایی محاسبه شد.

روش های تعیین PAH در اشیاء محیطی

به طور معمول، کروماتوگرافی گازی (GC) و کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) برای تعیین PAH ها استفاده می شود. جداسازی 16 PAH اصلی که برای تجزیه و تحلیل کمی کافی است با استفاده از ستون های مویرگی در کروماتوگرافی گازی یا ستون های با کارایی بالا در HPLC به دست می آید. باید به خاطر داشت که ستونی که مخلوط های کالیبراسیون شانزده PAH را به خوبی جدا می کند، تضمین نمی کند که آنها نیز به خوبی از پس زمینه ترکیبات آلی همراه در نمونه های مورد مطالعه جدا شوند.

به منظور ساده سازی تجزیه و تحلیل و همچنین دستیابی به نتایج با کیفیت بالا، اکثر روش های تحلیلی شامل مرحله ای از جداسازی اولیه (جداسازی) PAH ها از سایر گروه های ترکیبات مرتبط در نمونه ها هستند. اغلب، روش‌های کروماتوگرافی مایع کم فشار برای این اهداف در یک سیستم مایع-جامد یا مایع-مایع با استفاده از مکانیسم‌های جذب استفاده می‌شوند، به عنوان مثال با استفاده از ژل سیلیکا یا آلومینا، گاهی اوقات مکانیسم‌های مخلوط استفاده می‌شود، به عنوان مثال جذب و حذف با استفاده از Sephadex.

استفاده از خالص سازی اولیه نمونه ها به فرد امکان می دهد از تأثیر موارد زیر جلوگیری شود:

ترکیبات کاملا غیر قطبی مانند هیدروکربن های آلیفاتیک.

ترکیبات با قطبی متوسط ​​و قوی، به عنوان مثال، فتالان، فنل ها، الکل های پلی هیدریک، اسیدها.

ترکیبات با وزن مولکولی بالا مانند رزین ها.

عمدتاً دو نوع آشکارساز در کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) استفاده می شود: آشکارساز فلورمتری یا آشکارساز اسپکتروفتومتری آرایه فتودیود. حد تشخیص PAH ها در تشخیص فلورمتری بسیار کم است، و این روش را به ویژه برای تعیین مقادیر کمی از ترکیبات پلی آروماتیک مناسب می کند. با این حال، آشکارسازهای فلورمتری کلاسیک عملاً هیچ اطلاعاتی در مورد ساختار ترکیب مورد مطالعه ارائه نمی دهند. طراحی‌های مدرن امکان ثبت طیف‌های فلورسانس را که مشخصه ترکیبات فردی هستند، می‌سازد، اما هنوز به طور گسترده در عمل اندازه‌گیری معمول استفاده نمی‌شوند. یک آشکارساز اسپکتروفتومتری با آرایه فتودیود (PDL) امکان ثبت طیف های جذبی در محدوده طیفی UV و مرئی را فراهم می کند؛ این طیف ها می توانند برای شناسایی استفاده شوند. اطلاعات مشابهی را می توان با استفاده از آشکارسازهای اسکن سریع به دست آورد.

هنگام انتخاب تکنیک های تحلیلی برای جداسازی، شناسایی و تجزیه و تحلیل کمی این PAH ها، شرایط زیر باید در نظر گرفته شود:

سطح محتویات تعیین شده در نمونه های آزمایشی؛

تعداد مواد مرتبط؛

روش تحلیلی مورد استفاده (تکنیک اندازه گیری)؛

قابلیت های تجهیزات سریال.

توسعه روشی برای تعیین عناصر قلیایی خاکی و منیزیم با استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا

توسعه و بهبود روش هایی که امکان حل مسائل آنالیز آب را فراهم می کند، یک مشکل مهم در شیمی تجزیه است. توسعه کروماتوگرافی مایع پرفشار با کارایی بالا باعث ایجاد یک جهت جدید در کروماتوگرافی تبادل یونی شد که به اصطلاح کروماتوگرافی یونی نامیده می شود. سنتز جاذب ها برای کروماتوگرافی یونی دشوار است، زیرا نیازهای زیادی برای آنها وجود دارد. به دلیل عدم وجود مبدل‌های کاتیونی بسیار مؤثر در بازار، از یک فاز معکوس اصلاح شده دینامیکی استفاده شد، که برای آن یک اصلاح‌کننده سنتز شد: N-hexadecyl-N-decanoyl-paraaminobenoylsulfonic اسید اتیل-دی ایزوپروپیل‌آمونیوم (DHDAS)، که در آن آمین آبگریز حاوی SO 3 - گروه، قادر به تبادل کاتیونی. پس از عبور از محلول اصلاح کننده، جذب در l = 260 نانومتر به 6.4 واحد چگالی نوری (°E) رسید و به یک فلات رسید. ظرفیت تبادل یونی محاسبه شده 15.65 میکرومول است. از آنجایی که کاتیون‌های عناصر قلیایی خاکی و منیزیم در ناحیه UV طیف جذب نمی‌شوند، تشخیص غیرمستقیم UV با استفاده از یک شوینده سنتز شده جذب کننده اشعه ماوراء بنفش 1،4-dipyridiniumbutane bromide (DPB bromide) استفاده شد. از آنجایی که یون های هالوژن قسمت های فولادی ستون را تخریب می کند، یون برمید 1،4-دی پیریدینیم بوتان با یون استات جایگزین شد. هنگام شستشوی ستون با ماده شوینده، یون ضد اصلاح کننده، اتیل دی ایزوپروپیل آمونیوم، با یون 1،4-دی پیریدینیم بوتان جاذب UV جایگزین می شود. جداسازی کاتیون ها در طول موج بهینه l = 260 نانومتر در مقیاس 0.4 A در حالت "مقیاس تاشو" انجام شد. قطبیت ضبط برعکس شد. جداسازی تمام کاتیون های مورد مطالعه با افزودن یک افزودنی کمپلکس - اسید اگزالیک به دست آمد. محدودیت های تشخیص برای Mg 2 + , Ca 2 + , Sr 2 + , Ba 2 + 8 میکروگرم در لیتر است. 16 میکروگرم در لیتر؛ 34 میکروگرم در لیتر؛ به ترتیب 72 میکروگرم در لیتر. تحت شرایط انتخاب شده، آب لوله کشی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت، محتوای Ca 2 + که در آن 10.6 + 1.9 mg-ion / L، Mg 2 + -2.5 + mg-ion / L بود. خطای تکرارپذیری از -2.2٪ برای Ca 2 + و 1.4٪ برای Mg 2 + تجاوز نمی کند.

تجزیه و تحلیل کمپلکس های کادمیوم در محیط

برای مطالعه مکانیسم های مهاجرت فلزات سنگین در بیوسفر، داده هایی در مورد اشکال شیمیایی وجود فلزات در طبیعت مورد نیاز است. مشکلات در تجزیه و تحلیل ترکیبات یکی از سمی ترین فلزات - کادمیوم - به این دلیل است که مجتمع های شکننده ای را تشکیل می دهد و هنگام تلاش برای جداسازی آنها، تعادل طبیعی مخدوش می شود. در این کار، ترکیبات کادمیوم در خاک و گیاهان با استفاده از تکنیکی مبتنی بر جداسازی کروماتوگرافی عصاره‌ها و سپس شناسایی اجزا با روش‌های آنالیز شیمیایی مورد بررسی قرار گرفت. این رویکرد نه تنها شناسایی اشکال شیمیایی کادمیوم، بلکه ردیابی دگرگونی‌های آن‌ها در اشیاء محیطی را نیز ممکن می‌سازد.

گروه‌های OH کربوهیدرات‌ها و پلی‌فنول‌ها (شامل فلاونوئیدها)، C=O، فسفات‌ها، NH 2، NO 2 و گروه‌های SH با کادمیوم در اجسام بیوسفر هماهنگ می‌شوند. برای اهداف این مطالعه، مجموعه ای از لیگاندهای مدل به نمایندگی از این کلاس از ترکیبات وارد شد. برهمکنش لیگاندهای مدل با نمک های کادمیوم محلول در آب با استفاده از طیف سنجی UV و HPLC مورد مطالعه قرار گرفت.

برای جداسازی ترکیبات کادمیوم، استخراج با حلال‌های مخصوص انتخاب شده (بدون تشکیل کمپلکس با کادمیوم) استفاده شد. این امکان جداسازی کادمیوم را از تمام فلزات سنگین، به جز آنالوگ شیمیایی نزدیک آن، روی، فراهم می کند. پیک‌های حاوی کادمیوم و روی در کروماتوگرام عصاره‌های به‌دست‌آمده با اتصال فلزات به شکل دی‌تیزونات‌های آنها شناسایی شد. برای جداسازی از روی، از تفاوت پایداری کمپلکس‌های Cd و Zn در pH 6-8 استفاده شد. ترکیبات کادمیوم جدا شده توسط HPLC با استفاده از تغییرات pH در طول فرآیند شستشو شناسایی شدند. تجزیه و تحلیل ترکیبات کادمیوم با اجزای خاک و بافت‌های گیاهی انجام شد و مواد تولید شده توسط گیاهان در پاسخ به افزایش عرضه کادمیوم از خاک شناسایی شدند. نشان داده شده است که فلاونوئیدها، به ویژه تریسین، عوامل محافظتی در غلات، مشتقات آلکوکسی سیستئین در حبوبات، و هم پلی فنول ها و هم تیول ها در سبزیجات چلیپایی هستند.

فصل 4. تجهیزات HPLC

سلسله ACCELA

کروماتوگراف مایع جدید با عملکرد فوق العاده بالا ACCELA قادر است در محدوده وسیعی از نرخ جریان و فشار کار کند و هم جداسازی HPLC معمولی در ستون های معمولی و هم جداسازی فوق العاده سریع و کارآمد در ستون هایی با اندازه ذرات جاذب کمتر از 2 میکرون را فراهم می کند. در فشارهای فوق العاده بالا (بیش از 1000 اتمسفر).

این سیستم شامل یک پمپ گرادیان چهارگانه است که قادر به ایجاد فشار بیش از 1000 اتمسفر و با حجم نگهداری تنها 65 میکرولیتر است که جداسازی کروماتوگرافی با سرعت بالا را امکان پذیر می کند. نمونه گیری خودکار ACCELAقابلیت کارکرد در سیکل تزریق نمونه 30 ثانیه ای و ارائه بالاترین تکرارپذیری تزریق. آشکارساز آرایه دیودی Accela PDAبا حداقل حجم سلول جریان (2 میکرولیتر) که برای کروماتوگرافی با سرعت بالا بهینه شده است، از فناوری لایت پایپ ثبت شده استفاده می کند و اشکال قله متقارن را که با سیستم کروماتوگرافی و ستون های بی عیب و نقص ارائه می شود، حفظ می کند.

این سیستم به طور یکپارچه با طیف سنج های جرمی ارتباط برقرار می کند تا قوی ترین و بهترین سیستم های LC/MS موجود در جهان را ایجاد کند.

ستون‌های 1.9 میکرومتری UHP برای هر کاربرد از Thermo Electron در دسترس هستند

سلسله TSP

اصل ماژولار ساخت ابزارهای HPLC به مشتری این امکان را می دهد که به طور انعطاف پذیر تجهیزات را برای حل هر گونه مشکل تحلیلی مونتاژ کند و در صورت تغییر، سریع و اقتصادی آن را اصلاح کند. طیف گسترده ای از ماژول ها شامل پمپ ها - از گرادیان ایزوکراتیک تا چهار جزیی، از میکروستون تا نیمه آماده سازی، همه آشکارسازهای موجود، سیستم های معرفی نمونه - از انژکتورهای دستی تا نمونه برداری های خودکار با امکان هرگونه دستکاری با نمونه ها، نرم افزار قدرتمند برای اندازه گیری پردازش نتایج و مدیریت تمام ماژول های سیستم. همه ماژول ها دارای گواهینامه CSA، TUF/GS، FCC(EMI)، VDE (EMI)، ISO-9000 هستند، جمع و جور هستند، طراحی مدرن دارند، کارکرد آسانی دارند، مجهز به نمایشگر داخلی و خود عیب یابی هستند. سیستم، به شما امکان می دهد تا پارامترهای روش کار را ایجاد و ذخیره کنید. آنها معیارهای "عمل آزمایشگاهی نمونه" (GLP) را برآورده می کنند و در ثبت نام ابزارهای اندازه گیری فدراسیون روسیه گنجانده شده اند. گزارش های اندازه گیری مطابق با فارماکوپه های انگلستان، ایالات متحده آمریکا، آلمان و فرانسه صادر می شود.

سیستم های مدولار TSP با بالاترین قابلیت اطمینان و پایداری در عملیات مشخص می شوند.

ترکیب ماژول ها از یک سو تمامی مزایای یک سیستم یکپارچه و از سوی دیگر انعطاف پذیری یک سیستم ماژولار را در اختیار تحلیلگر قرار می دهد. صرف نظر از کاربرد کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) - داروسازی، بیوتکنولوژی، تجزیه و تحلیل محیطی، تجزیه و تحلیل بالینی، تجزیه و تحلیل مواد غذایی و نوشیدنی، تجزیه و تحلیل پتروشیمی و شیمیایی - این ابزار همیشه به طور بهینه برای مطابقت با بالاترین نیازها پیکربندی شده است.

هم سیستم‌های تحقیقاتی و هم سیستم‌های روتین با کارایی بالا:

گاز زدایی با حلال بسیار کارآمد

امکان کار با مقادیر نمونه کوچک و فوق العاده کوچک

بالاترین حساسیت، هم با آشکارساز UV/VIS و هم آرایه دیود (با تکنولوژی معروف LightPipe با طول مسیر اپتیکال اختیاری 1 یا 5 سانتی متر)

کار با ستون های مختلف

بالاترین دقت تجزیه و تحلیل کمی

قابلیت کار خودکار با حجم نمونه های مختلف

خطای RMS برای زمان های نگهداری کمتر از 0.3٪

حداقل منطقه کاری اشغال شده توسط سیستم

بالاترین قابلیت اطمینان و پایداری پارامترها.

پمپ LC نقشه بردار- پمپ HPLC با بهترین تکرارپذیری زمان ماند در میان هر پمپ گرادیان چهار جزئی موجود در جهان. گاز زدای خلاء یکپارچه چهار کاناله و دمپر ضربانی پایداری خط پایه عالی را برای حداکثر حساسیت و دقت کمی فراهم می کند.

نمونه برداری خودکار بالاترین بهره وری و انعطاف پذیری تجزیه و تحلیل را فراهم می کند. طیف وسیعی از سینی‌های نمونه - از ویال‌های استاندارد گرفته تا میکروپلیت‌های 96 و 384 چاهی - تقریباً نیازهای همه برنامه‌ها را پوشش می‌دهند. فناوری جدید تزریق نمونه را تقریباً بدون اتلاف تضمین می کند؛ تقریباً 5 میکرولیتر از نمونه با نمونه برداری خودکار از حجم کل نمونه 5 میکرولیتر تزریق می شود.

نقشه بردار

آشکارساز UV/Vis و PDA (دتکتور آرایه دیودی)

نقشه بردار UV/Vis- آشکارساز نور مرئی و فرابنفش با طول موج متغیر ترکیبی از مقرون به صرفه بودن و قابلیت اطمینان با بالاترین حساسیت تکنولوژی LightPipe می باشد. انتخاب گسترده ای از سلول های جریان، این آشکارساز را برای همه کاربردها، از کاربردهایی که از کروماتوگرافی مویرگی یا میکروستونی استفاده می کنند تا نیمه آماده سازی و آماده سازی، همه کاره می کند.

نقشه بردار PDAآشکارساز حساس ترین آشکارساز HPLC با استفاده از آرایه دیود است. نوری منبع دو لامپ به طور یکپارچه کل محدوده طول موج 190 تا 800 نانومتر را پوشش می دهد. پرتوساز فیبر نوری وضوح نوری عالی را بدون کاهش حساسیت ارائه می دهد.

نقشه بردار R.I.آشکارساز شکست سنجی با یک کووت ترموستات با حداقل حجم با کنترل کامل الکترونیکی از رایانه.

نقشه بردار FLآشکارساز اسکن فلورمتری با بالاترین حساسیت و قابلیت تشخیص برای فلورسانس، نورتابی شیمیایی و فسفرسانس.

انتخاب گسترده ای از نمونه گیری های خودکار به شما امکان می دهد هم با ویال های معمولی و هم با صفحات 96 موقعیت کار کنید که به طور گسترده در بیوشیمی و عمل بالینی استفاده می شود. کار با آنها با استفاده از صفحات مشابه برای آماده سازی نمونه با استفاده از استخراج فاز جامد تسهیل می شود.

400 درایو الکتریکی، حلقه Valco (20 µl - استاندارد) با قابلیت پر کردن جزئی.

نمونه چرخ فلک 96.

درایو الکتریکی، ترموستات ستونی، حلقه Valco (100 میکرولیتر - استاندارد) با امکان پر کردن جزئی حالت AutoMix برای آماده سازی نمونه. چرخ فلک نمونه: ۸۴×۲ میلی لیتر (نمونه) + ۳×۱۰ میلی لیتر (معرف). ترموستات ستونی داخلی 420

خودکار لوپ برای کارهای تحقیقاتی با قابلیت عملکرد در حالت های پر کردن کامل، جزئی و تزریق نمونه میکرولیتری. انتخاب گسترده ای از چرخ فلک (استاندارد - 96 نمونه).

نمونه‌بردار خودکار تبلت برای کار با صفحات 96 و 384 موقعیت. تزریق نمونه به حلقه تحت فشار، توانایی تزریق نمونه های کمتر از 1 میکرولیتر. امکان نصب فیدر تبلت. HPLC

تولید کنندگان عمده تجهیزات HPLC

· آب - کروماتوگرافی فوق العاده، طیف سنجی جرمی، ستون ها، استخراج فاز جامد.

Varian, Inc. - کروماتوگراف ها و ستون ها، لوازم جانبی برای استخراج فاز جامد.

· فناوری های چابک - کروماتوگراف ها و ستون ها.

Hypersil - ستون ها و جاذب ها.

· Merck KGaA - صفحات TLC و لوازم جانبی برای TLC، ستون ها، جاذب ها، فازهای متحرک برای HPLC، لوازم جانبی برای استخراج فاز جامد

· دیونکس - تجهیزات و ستون های HPLC، به ویژه برای کروماتوگرافی یونی.

ادبیات

1. Pilipenko A.T., Pyatnitsky I.V. شیمی تجزیه. در دو کتاب: کتاب..1 - م.: شیمی، 1990، -480 ص.

1. Pilipenko A.T., Pyatnitsky I.V. شیمی تجزیه. در دو کتاب: کتاب..2 - م.: شیمی، 1990، -480 ص.

2. واسیلیف V.P. شیمی تجزیه. در 2 ساعت قسمت 2. روشهای فیزیکوشیمیایی تجزیه و تحلیل: کتاب درسی. برای Khimko - تکنولوژی. متخصص. دانشگاه ها - م.: بالاتر. مدرسه، 1989. – 384 ص.

3. مواد هیدروشیمیایی. جلد 100. روشها و ابزار فنی پایش عملیاتی کیفیت آبهای سطحی. L.: Gidrometeo-izdat, 1991. – 200 p.

4. Lurie Yu.Yu. شیمی تجزیه فاضلاب صنعتی / Yu.Yu. لوری; M.: KhimiyaYU, 1984. - 448 p.

5. Ewing G. روشهای ابزاری تجزیه و تحلیل شیمیایی / ترجمه. از انگلیسی م.: میر، 1989. – 348 ص.

6. گورلیک D.O.، Konopelko L.A.، Pankov E.D. پایش محیط زیست در 2 جلد. سنت پترزبورگ: کریسمس. 2000. – 260 ص.

7. Aivazov B.V. مقدمه ای بر کروماتوگرافی م.: بالاتر. مدرسه، 1983. – 450 ص.

8. Goldberg K.A., Vigdergauz M.S. مقدمه ای بر کروماتوگرافی گازی م.: شیمی، 1990. – 329 ص.

9. Stolyarov B.V. و دیگران // کروماتوگرافی گازی و مایع عملی. سن پترزبورگ: دانشگاه ایالتی سن پترزبورگ، 1998. - ص 81.

11. گورشکوف A.G.، Marinaite I.I. HPLC روشی برای نظارت بر PAH در اشیاء محیطی است

12. Torosyan G. O., Martirosyan V. A., Aleksanyan A. R., Zakaryan M. O.. حذف آنیلین از محلول های آبی با استفاده از ضایعات حاصل از احیای آلومینوگرمیک مقیاس مس نورد شده

13. L.A. تورکینا، G.N. Koroleva توسعه روشی برای تعیین عناصر قلیایی خاکی و منیزیم با استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا

14. Dultseva G.G.، Dubtsova Yu.Yu.، Skubnevskaya G.I. تجزیه و تحلیل کمپلکس های کادمیوم در محیط

کاربرد

تعیین کلومازون در آب با روشهای کروماتوگرافی

دستورالعمل های روش شناسی MUK 4.1.1415-03

1. تهیه شده توسط: مرکز علمی فدرال بهداشت به نام. F.F.

اریسمن؛ آکادمی کشاورزی مسکو به نام. ک.ا.

تیمیریازف; با مشارکت اداره نظارت بهداشتی و اپیدمیولوژیک دولتی وزارت بهداشت روسیه. توسعه دهندگان متدولوژی در پایان ذکر شده اند.

3. تایید شده توسط دکتر ارشد بهداشتی دولت

فدراسیون روسیه، معاون اول وزیر بهداشت فدراسیون روسیه، آکادمیک. RAMS G.G. اونیشچنکو 24 ژوئن 2003

5. برای اولین بار معرفی شد.

1. بخش مقدماتی

سازنده: FMS (ایالات متحده آمریکا).

نام تجاری: COMMAND.

ماده فعال: کلومازون.

2-(2-کلروبنزیل)-4،4-دی متیل-3-ایزوکسالیدین-3-ون (IUPAC)

مایع چسبناک قهوه ای روشن.

نقطه ذوب: 25 -C.

نقطه جوش: 275 -C.

فشار بخار در 25 -C: 19.2 مگاپاسکال.

ضریب تقسیم n-اکتانول/آب: K logP = 2.5.

بسیار محلول در استون، هگزان، اتانول، متانول،

کلروفرم، دی کلرومتان و استونیتریل؛ حلالیت در آب -

1.10 گرم در متر مربع dm حداقل 2 سال در دمای اتاق و حداقل 3 ماه در دمای 50 درجه سانتیگراد پایدار است.

مختصر مشخصات سم شناسی: حاد خوراکی

سمیت (LD) برای موش - 1369 - 2077 mg/kg. پوستی حاد

سمیت (LD) برای موش - بیش از 2000 میلی گرم بر کیلوگرم؛ حاد

سمیت استنشاقی (LC) برای موش - 4.8 میلی گرم بر متر مکعب. dm (4 ساعت).

استانداردهای بهداشتی حداکثر غلظت در آب 0.02 میلی گرم بر متر مکعب است. dm

حوزه کاربرد دارو. کلومازون یک علف کش انتخابی است که برای کنترل غلات و علف های هرز دو لپه ای در محصولات سویا و برنج با کاربرد پیش رویشی یا قبل از کاشت استفاده می شود.

2. روش تعیین کلومازون در آب

روش های کروماتوگرافی

2.1. مقررات اساسی

2.1.1. اصل تکنیک

این تکنیک بر اساس استخراج کلومازون از نمونه مورد تجزیه و تحلیل با هگزان، غلظت عصاره و تعیین کمی بعدی با روش‌های جایگزین است:

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) با

آشکارساز فرابنفش، کروماتوگرافی گازی مایع (GLC) با آشکارساز نرخ نوترکیب ثابت یا کروماتوگرافی لایه نازک (TLC). تعیین کمی با روش کالیبراسیون مطلق انجام می شود.

2.1.2. انتخابی بودن روش

در شرایط پیشنهادی، این روش در حضور آلاینده‌های محیطی جهانی خاص است: سیکلوپارافین‌های کلردار (ایزومرهای HCCH)، ترکیبات دی فنیل (DDT و مشتقات آن)، متابولیت‌های آنها - بنزن‌ها و فنل‌های پلی کلره، و همچنین در حضور تری کلرواستات سدیم. که می تواند در محصولات کشاورزی به عنوان علف کش استفاده شود.

2.1.3. مشخصات مترولوژیکی روش (95/0 = P)

معرف ها، محلول ها و مواد

کلومازون حاوی d.v. 99.8٪

(FMS، ایالات متحده آمریکا)

نیتروژن، GOST 9293-79 بسیار بالا

آمونیاک آبی، 25٪، h GOST 1277-81

استون، h GOST 2603-79

n-هگزان، h GOST 2603-79

پراکسید هیدروژن، محلول آبی 30٪ GOST 10929-77

ایزوپروپیل الکل، شیمیایی خالص TU 6-09-402-75

اسید سولفوریک، معرف گرید GOST 4203-77

اسید کلریدریک (اسید کلریدریک)، معرف درجه GOST 3118-77

متیل الکل، معرف درجه GOST

هیدروکسید سدیم، از نظر شیمیایی خالص، محلول آبی 25٪ GOST 4323-77

سولفات سدیم بی آب، معرف درجه GOST 1277-81

نیترات نقره، معرف گرید GOST 1277-81

2-فنوکسی متانول قسمت TU 6-09-3688-76

کروماتون N-AW-DMCS (0.16 - 0.20 میلی متر)

با 5% SE-30، هماپول، جمهوری چک

کروماتون N-AW-DMCS (0.16 - 0.20 میلی متر) با 1.5

OV-17 + 1.95٪ QF-1، هماپول، جمهوری چک

صفحات برای HPTLC (اتحادیه شوروی)

صفحات "Keselgel 60 F-254" (آلمان)

سوابق "Silufol" جمهوری چک

فیلترهای کاغذی "نوار سفید"، جدا شده و پیش شسته شده با هگزان TU 6-09-2678-77

2.3. دستگاه ها، تجهیزات، ظروف

کروماتوگراف مایع Milicrome

با آشکارساز فرابنفش

ستون کروماتوگرافی فولادی،

طول 64 میلی متر، قطر داخلی 2 میلی متر،

پر شده با سیلاسورب 600 اندازه دانه 5 میکرون

کروماتوگراف گازی سری "رنگ" یا

مشابه، مجهز به آشکارساز ثابت

نرخ نوترکیبی (RPR) با یک حد

تشخیص لیندان 4 x 10 g/cc. سانتی متر

ستون کروماتوگرافی شیشه ای، طول

1 یا 2 متر، قطر داخلی 2 - 3 میلی متر

میکروسرنگ نوع MSh-10، ظرفیت 10 میکرولیتر TU 5E2-833-024

دستگاه تکان دهنده نوع AVU-6s TU 64-1-2851-78

حمام آب TU 64-1-2850-76

ترازوهای تحلیلی نوع VLA-200 GOST 34104-80E

محفظه کروماتوگرافی GOST 10565-74

پمپ جت آب GOST 10696-75

پرتودهی جیوه-کوارتز نوع OKN-11 TU 64-1-1618-77

بطری های اسپری شیشه ای GOST 10391-74

اواپراتور خلاء چرخشی IR-1M

یا مشابه TU 25-11-917-76

واحد کمپرسور TU 64-1-2985-78

کابینت خشک کن TU 64-1-1411-76E

قیف های جدا کننده GOST 3613-75

فلاسک های حجمی، ظرفیت 100 میلی لیتر GOST 1770-74

سیلندرهای اندازه گیری، ظرفیت 10، 50 میلی لیتر GOST 1770-74E

فلاسک های گلابی شکل با بخش آسیاب شده،

با ظرفیت 100 میلی لیتر GOST 10394-72

فلاسک های مخروطی، ظرفیت 100 میلی لیتر GOST 22524-77

لوله های سانتریفیوژ با اندازه گیری GOST 25336-82E

پیپت ها ظرفیت 0.1، 1، 2، 5 و 10 میلی لیتر GOST 20292-74

قیف شیمیایی، مخروطی، قطر

34 - 40 میلی متر GOST 25336-82E

2.4. انتخاب نمونه

انتخاب، ذخیره سازی و آماده سازی نمونه ها مطابق با

"قوانین یکپارچه برای نمونه برداری از محصولات کشاورزی، محصولات غذایی و اشیاء زیست محیطی برای تعیین مقادیر کمی سموم" مصوب N 2051-79 مورخ 21.08.79

نمونه های انتخاب شده را نمی توان بیش از 5 روز در یخچال نگهداری کرد. قبل از تجزیه و تحلیل، آب (در صورت وجود ماده معلق) از طریق فیلتر کاغذی شل فیلتر می شود.

2.5. آماده شدن برای عزم

2.5.1. روش HPLC

2.5.1.1. آماده سازی فاز متحرک برای HPLC

با استفاده از یک پیپت، 5 میلی لیتر ایزووپانول و 5 میلی لیتر متانول را در یک فلاسک حجمی 100 میلی لیتری قرار دهید، هگزان را به علامت اضافه کنید، مخلوط کنید و صاف کنید.

2.5.1.2. تهویه ستون

ستون HPLC را با هگزان- متانول- ایزوپروپانول (90:5:5، حجم / حجم) به مدت 30 دقیقه شستشو دهید. با سرعت جریان حلال 100 میکرولیتر در دقیقه.

2.5.2. روش GLC آماده سازی و آماده سازی ستون

بسته بندی نهایی (5٪ SE-30 در کروماتون N-AW-DMCS) در یک ستون شیشه ای ریخته می شود، تحت خلاء فشرده می شود، ستون بدون اتصال به آشکارساز در ترموستات کروماتوگرافی نصب می شود و در جریان نیتروژن در یک جریان نیتروژن تثبیت می شود. دمای 250 -C برای ساعت 10 - 12

2.5.3. روش TLC

2.5.3.1. آماده سازی معرف های در حال توسعه

2.5.3.1.1. در حال توسعه معرف شماره 1

1 گرم نیترات نقره در 1 میلی لیتر آب مقطر، 10 میلی لیتر 2-فنوکسی متانول، 190 میلی لیتر استون، 1 تا 2 قطره پراکسید هیدروژن به آن اضافه می شود، محلول هم زده می شود و به یک بطری شیشه ای تیره منتقل می شود.

2.5.3.2.2. در حال توسعه معرف N 2

0.5 گرم نیترات نقره در 5 میلی لیتر آب مقطر در یک فلاسک حجمی 100 میلی لیتری حل می شود، 10 میلی لیتر آمونیاک آبی 25 درصد اضافه می شود، محلول با استون به 100 میلی لیتر تنظیم می شود، مخلوط می شود و به یک بالن شیشه ای تیره منتقل می شود.

2.5.3.2. آماده سازی فاز متحرک برای TLC

20 میلی لیتر استون را به یک فلاسک حجمی 100 میلی لیتری اضافه کنید، هگزان را به علامت اضافه کنید و مخلوط کنید. مخلوط در یک لایه نه بیشتر از 6 تا 8 میلی متر در 30 دقیقه در محفظه کروماتوگرافی ریخته می شود. قبل از شروع کروماتوگرافی

2.5.4. تهیه محلول های استاندارد

محلول استاندارد کلومازون حاوی 100 میکروگرم بر میلی لیتر با حل کردن 010/0 گرم از دارو حاوی 8/99 درصد ماده فعال در هگزان در یک فلاسک حجمی 100 میلی لیتری تهیه می شود. محلول به مدت یک ماه در یخچال نگهداری می شود.

محلول های استاندارد کار با غلظت 0.4؛ 1.0; 2.0; 4.0; 10.0; 20 و 40.0 میکروگرم بر میلی لیتر از محلول استوک استاندارد کلومازون با رقت سریال مناسب با هگزان تهیه می شود.

محلول های کاری بیش از یک ماه در یخچال نگهداری نمی شوند.

2.5.5. ساخت نمودار کالیبراسیون

2.5.5.1. نمودار کالیبراسیون A (اندازه گیری مطابق بند 2.7.1، HPLC)

برای ساخت یک نمودار کالیبراسیون، 5 میکرولیتر از محلول استاندارد کاری کلومازون با غلظت 4.0 به انژکتور کروماتوگراف تزریق می شود. 10.0; 20.0 و 40 میکروگرم در میلی لیتر.

2.5.5.2. نمودار کالیبراسیون B (اندازه گیری مطابق بند 2.7.2، GLC)

برای ایجاد منحنی کالیبراسیون، 5 میکرولیتر از محلول استاندارد کاری کلومازون با غلظت 0.4 به اواپراتور کروماتوگرافی تزریق می شود. 1.0; 2.0; 4.0 و 10.0.

حداقل 5 اندازه گیری موازی انجام دهید. میانگین ارتفاع پیک کروماتوگرافی برای هر غلظت را بیابید. یک نمودار کالیبراسیون (A یا B) از وابستگی ارتفاع پیک کروماتوگرافی بر حسب میلی متر به غلظت کلومازون در محلول بر حسب میکروگرم بر میلی لیتر بسازید.

2.6. شرح تعریف

100 میلی لیتر از نمونه آب آنالیز شده در یک قیف جداکننده با ظرفیت 250 میلی لیتر قرار می گیرد، 10 میلی لیتر محلول آبی 25 درصد هیدروکسید سدیم اضافه می شود، مخلوط می شود و 20 میلی لیتر n-هگزان اضافه می شود. قیف به مدت 3 دقیقه تکان داده می شود، پس از جداسازی فاز، لایه هگزان در یک فلاسک گلابی شکل 100 میلی لیتری ریخته می شود و آن را از لایه ای از سولفات سدیم بی آب که در قیف مخروطی شکل روی صافی کاغذی تا شده قرار داده می شود عبور می دهند. استخراج دارو از نمونه آبی دو بار دیگر با استفاده از 20 میلی لیتر n-هگزان تکرار می شود. عصاره ترکیبی هگزان بر روی یک اواپراتور خلاء چرخشی در دمای 40 درجه سانتیگراد تقریباً تا خشک شدن تبخیر می شود، باقی مانده با جریان هوا یا نیتروژن با خلوص بالا دمیده می شود. باقیمانده خشک در 0.1 (HPLC، TLC) یا 0.25 میلی لیتر (GLC) n-هگزان حل شده و با یکی از روش های کروماتوگرافی آنالیز می شود.

2.7. شرایط کروماتوگرافی

کروماتوگراف مایع با آشکارساز فرابنفش Milichrom (روسیه).

ستون فولادی 64 میلی متر طول، قطر داخلی 2 میلی متر،

پر شده با سیلاسورب 600 اندازه دانه 5 میکرون.

دمای ستون: دمای اتاق.

فاز متحرک: هگزان- ایزوپروپانول- متانول (90:5:5، حجم / حجم).

سرعت جریان مایع شوینده: 100 µl/min.

طول موج عملیاتی: 240 نانومتر

حساسیت: 0.4 واحد جذب روی ترازو

حجم نمونه تزریقی: 5 میکرولیتر.

زمان انتشار کلومازون: حدود 6 دقیقه.

محدوده تشخیص خطی: 20 - 200 نانوگرم.

نمونه هایی که پیک های بزرگتر از محلول استاندارد 40 میکروگرم بر میلی لیتر تولید می کنند با فاز متحرک درجه HPLC رقیق می شوند.

کروماتوگرافی گازی "Tsvet-570" با آشکارساز نرخ نوترکیبی یونی ثابت.

ستون شیشه ای به طول 1 متر، قطر داخلی 3 میلی متر، پر شده با کروماتون N-AW-DMCS با 5٪ SE-30 (0.16 - 0.20 میلی متر).

مقیاس کار الکترومتر 64 x 10 10 اهم است.

سرعت نوار ضبط 200 میلی متر در ساعت است.

دمای ترموستات ستونی - 190 -C

آشکارساز - 300 -С

اواپراتور - 220 -С

سرعت گاز حامل (نیتروژن) - 60 میلی لیتر در دقیقه.

حجم نمونه تزریق شده 5 میکرولیتر است.

زمان انتشار کلومازون 2.5 دقیقه است.

محدوده تشخیص خطی: 2 تا 50 نانوگرم.

نمونه هایی که پیک های بزرگتر از محلول استاندارد 10 میکروگرم بر میلی لیتر تولید می کنند با هگزان رقیق می شوند.

برای افزایش دقت شناسایی کلومازون در حضور گاما-HCH در نمونه که زمان ماند مشابهی دارد، کلومازون با تیمار با اسید سولفوریک غلیظ از نمونه خارج می شود. تجزیه و تحلیل مکرر نمونه امکان تعیین سهم کلومازون در سیگنال کروماتوگرافی اولیه را فراهم می کند.

محلول هگزان در یک فلاسک که طبق بند 2.6 به صورت کمی بدست می آید

(یا مقدار کمی از آن) روی صفحات کروماتوگرافی "Silufol"، "Keselgel 60F-254" یا "صفحات HPTLC" اعمال می شود. محلول های استاندارد در نزدیکی در حجمی مطابق با محتوای کلومازون 1، 2، 5 و 10 میکروگرم استفاده می شود. صفحه در یک محفظه کروماتوگرافی حاوی مخلوطی از n-هگزان-استون (4:1، حجمی) قرار می گیرد. پس از ایجاد کروماتوگرام، صفحه از محفظه خارج می شود، تحت کشش قرار می گیرد تا حلال ها تبخیر شوند، سپس با یکی از معرف های در حال توسعه تیمار می شوند و به مدت 5 دقیقه زیر یک لامپ ماوراء بنفش قرار می گیرند. منطقه محلی سازی دارو در صفحات "Silufol"، "Plates HPTLC" و "Keselgel 60F-254" به ترتیب به شکل لکه های قهوه ای خاکستری با مقدار Rf 0.35، 0.85 و 0.43 ظاهر می شود. برای تعیین کلومازون توسط TLC می توانید از صفحات آلوگرام و پولیگرام (ساخت آلمان) استفاده کنید. مقدار Rf کلومازون در این صفحات به ترتیب 0.37 و 0.38 است.

3. الزامات ایمنی

هنگام کار با حلال‌های آلی، مواد سمی و وسایل گرمایش الکتریکی، رعایت قوانین ایمنی عمومی پذیرفته شده ضروری است.

4. کنترل خطای اندازه گیری

کنترل عملیاتی خطای اندازه گیری و تکرارپذیری مطابق با توصیه های MI 2335-95 انجام می شود. GSI "کنترل کیفیت داخلی نتایج تجزیه و تحلیل شیمیایی کمی."

5. توسعه دهندگان

Yudina T.V., Fedorova N.E. (مرکز تحقیقات فدرال به نام F.F. Erisman).

Davidyuk E.I. (UkrNIIGINTOX، کیف)؛ Kisenko M.A.، Demchenko V.F. (انستیتوی طب کار آکادمی علوم و آکادمی علوم پزشکی اوکراین، کیف).

معرفی

آنالیز کروماتوگرافی معیاری برای همگن بودن یک ماده است: اگر ماده مورد تجزیه و تحلیل با هیچ روش کروماتوگرافی جدا نشود، آن را همگن (بدون ناخالصی) در نظر می گیرند.

تفاوت اساسی روش های کروماتوگرافی با سایر روش های فیزیکوشیمیایی آنالیز، امکان جداسازی مواد با خواص مشابه است. پس از جداسازی، اجزای مخلوط مورد تجزیه و تحلیل را می توان با هر روش شیمیایی، فیزیکی و فیزیکوشیمیایی شناسایی (تشخیص ماهیت) و کمیت (جرم، غلظت) کرد.

کروماتوگرافی به طور گسترده در آزمایشگاه ها و صنعت برای تجزیه و تحلیل کیفی و کمی سیستم های چند جزئی، کنترل تولید، به ویژه در ارتباط با اتوماسیون بسیاری از فرآیندها، و همچنین برای جداسازی آماده سازی (از جمله صنعتی) مواد منفرد (به عنوان مثال، فلزات نجیب) استفاده می شود. ) جداسازی عناصر کمیاب و پراکنده.

مطابق با وضعیت تجمع ماده شوینده، کروماتوگرافی گازی (GC، GC) و کروماتوگرافی مایع (HPLC، HPLC) متمایز می شوند.

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) برای تجزیه و تحلیل، جداسازی و خالص سازی پلیمرهای مصنوعی، داروها، مواد شوینده، پروتئین ها، هورمون ها و سایر ترکیبات مهم بیولوژیکی استفاده می شود. استفاده از آشکارسازهای بسیار حساس کار با مقادیر بسیار کمی از مواد (9-10-10-10 گرم) را ممکن می سازد که در تحقیقات بیولوژیکی بسیار مهم است.

روش HPLC بر روی کروماتوگرافی مایع مختلف انجام می شود. کروماتوگراف های مایع مدرن برای جداسازی مخلوط های پیچیده مواد به اجزای جداگانه و انجام تجزیه و تحلیل کیفی و کمی اجزای مخلوط جدا شده طراحی شده اند.

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا پروپیفنازون

در ارتباط با معرفی GMP به عمل تولید دارو در روسیه. اهمیت استفاده از روش های مدرن تجزیه و تحلیل، هم در شرکت های تولیدی و هم در سیستم کنترل دولتی کیفیت داروها در حال افزایش است. روش اساسی برای تجزیه و تحلیل کیفیت مواد و داروهای نهایی در کشورهای دارای صنعت داروسازی پیشرفته (ایالات متحده آمریکا، انگلستان، ژاپن، کشورهای اتحادیه اروپا) کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) است. این روش با توجه به ویژگی های خود الزامات تجزیه و تحلیل کمی حدود 80-90٪ از داروها را برآورده می کند.

تکنیک برای انجام هر گونه تعیین کروماتوگرافی دارای برخی الزامات کلی است. اول از همه، لازم است به مواردی از آنها توجه کنید که بیشترین سؤال را در بین متخصصان تازه کار ایجاد می کنند.

1. تهویه مطبوع اتاق. در اتاقی که کروماتوگراف مایع نصب می شود، نباید نوسانات ناگهانی دما وجود داشته باشد.

تغییر دما می تواند حفظ، کارایی و حتی انتخاب پذیری جداسازی را تغییر دهد.

در گرمای تابستان در اتاق های بدون شرط، کار با فازهای متحرک فاز معمولی و کم جوش بسیار دشوار می شود. در طول روز تبخیر تدریجی آنها رخ می دهد که منجر به تغییر در ترکیب مایع شوینده می شود.

در دماهای پایین، هنگام کار با مواد شوینده غنی شده با آب و/یا حاوی الکل، مشکلاتی ایجاد می شود. ویسکوزیته این گونه مواد شوینده با کاهش دما به شدت افزایش می یابد که منجر به افزایش فشار در سیستم می شود.

اثر نوسانات دمایی کوچک بر جداسازی را می توان با ترموستات کردن ستون کروماتوگرافی، یا کل سیستم مایع (که برای همه کروماتوگرافی ها امکان پذیر نیست) از بین برد.

2. کیفیت برق. اکثر کروماتوگراف های مدرن مجهز به سیستم های تثبیت کننده قدرت هستند، اما کیفیت منبع تغذیه در محل نیز باید بالا باشد. اگر منبع تغذیه ناکافی باشد، هر شروع یک سری از تعیین ها در حالت خودکار ممکن است به دلیل نقص عملکرد ناموفق باشد.

3. خلوص حلال ها. برای تهیه فازهای متحرک به خصوص از حلال های خالص باید استفاده کرد.

به طور کلی، الزامات خلوص فاز متحرک به روش تشخیص، روش شستشو (ایزوکراتیک یا گرادیان)، حساسیت آشکارساز به آنالیت هدف و غلظت آن بستگی دارد.

هنگام استفاده از تشخیص UV، نیاز به خلوص حلال ها هنگام حرکت به محدوده موج کوتاه، کمتر از 230-240 نانومتر افزایش می یابد. برای شستشوی ایزوکراتیک در طول تشخیص اشعه ماوراء بنفش در طول موج های بیشتر از 220-240 نانومتر، می توان از حلال های با خلوص بالا استفاده کرد. و آب تقطیر کنید. تمام معرف های اضافه شده به فاز متحرک نیز باید از خلوص کافی برخوردار باشند. تبلور مجدد معرف های کریستالی قبل از استفاده ممکن است مفید باشد.

برای شستشوی گرادیان، لازم است از حلال های درجه "برای کروماتوگرافی مایع" و آب تقطیر دوبل استفاده شود. الزامات ویژه در روش شستشوی گرادیان (در کروماتوگرافی فاز معکوس) بر روی خلوص بافر آبی و به طور خاص آب قرار می گیرد. اول از همه، این به این دلیل است که در مرحله اولیه شستشو، جاذب اجزای آلاینده را از فاز متحرک غنی شده در بافر آبی جذب می کند، که متعاقبا شسته شده و در کروماتوگرام به شکل "کوهان" ظاهر می شود. آستانه‌ها و پیک‌های فردی، که انتخاب سیگنال‌های مفید آنالیت را بسیار پیچیده می‌کنند.

خالص ترین حلال ها برای تعیین گروهی مقادیر کمی از مواد در حالت شستشوی گرادیان مورد نیاز است.

برای انجام تعیین در حالت شستشوی گرادیان و همچنین تعیین دقیق در حالت ایزوکراتیک، فاز متحرک باید یک بار استفاده شود، یعنی مایع شستشو باید دور ریخته یا دور ریخته شود.

در شستشوی ایزوکراتیک، اگر مشکل حساسیت خاصی وجود نداشته باشد، می توان از شوینده مصرف شده مجددا استفاده کرد. سیستمی که در آن مایع پس از عبور از آشکارساز به ظرف حاوی فاز متحرک بازگردانده می شود، «سیستم بازیافت» نامیده می شود. چنین سیستمی به ویژه در مورد انجام تعداد زیادی از تعیین‌های معمول همسوکراتیک بر روی ستون‌های استاندارد (250x4.6، 150x4.6) با سرعت جریان حجمی حدود 1 میلی‌لیتر در دقیقه مفید است. در این موارد، سیستم بازیافت تا 200-300 میلی لیتر حلال آلی در روز صرفه جویی می کند. این سیستم اقتصادی امکان استفاده از حلال های بسیار خالص و گران قیمت را برای تجزیه و تحلیل فراهم می کند. موضوع صرفه جویی در حلال های گران قیمت در مورد استفاده از میکروستون ها (80x2، 100x2) کمتر حاد است، زیرا جداسازی نیاز به مرتبه بزرگی حجم کمتری از فاز متحرک دارد.

4. گاز زدایی از حلال ها. حلال های مورد استفاده در کروماتوگرافی برای تهیه فازهای متحرک معمولاً حاوی هوای محلول هستند. آب مخصوصاً هوای زیادی دارد.

هنگام کار با مواد شوینده بدون گاز، حباب های هوا وارد اجزای مختلف سیستم مایع می شوند: پمپ، ستون، مویرگ ها، آشکارساز. هنگامی که هوا وارد یک سیستم مایع می شود، به دلیل نوسانات فشار در سیستم مایع، نویز زیاد و دوره ای روی کروماتوگرام ظاهر می شود. این منجر به کاهش شدید حساسیت تجزیه و تحلیل می شود.

برای حذف هوا از شوینده، آن را گاز زدایی می کنند. به عنوان یک قاعده، تنها مواد شوینده برای جداسازی فاز معکوس گاز زدایی می شوند - زیرا مخلوط های آبی-آلی حاوی مقادیر قابل توجهی هوای محلول هستند. گاز زدایی باید به ویژه در مورد شستشوی گرادیان و همچنین هنگام استفاده از تشخیص فلورمتری با دقت انجام شود.

در طول شستشوی گرادیان در حالت فاز معکوس، اختلاط دو ماده شوینده رخ می دهد - مخلوط های آبی-آلی با ترکیبات مختلف. مخلوط کردن مواد شوینده بدون گاز منجر به انتشار شدید هوای محلول می‌شود که برای تعیین به‌عنوان یک کل بسیار مهم است (در کروماتوگرام، حباب‌های هوا به عنوان «انتشار» تیز روی خط صفر ثبت می‌شوند).

حساسیت تشخیص فلورمتری با محتوای بالای هوای محلول در فاز متحرک کاهش می‌یابد (کوئنچ فلورسانس رخ می‌دهد). بنابراین، هنگام استفاده از آشکارسازی فلورمتری، باید توجه ویژه ای به گاززدایی ماده شوینده شود.

سه روش اصلی برای گاززدایی فازهای متحرک برای کروماتوگرافی مایع وجود دارد.

آ. گاز زدایی با خلاء - مایع شوینده در یک فلاسک کلایزن زیر خلاء پمپ جت آب برای چند دقیقه نگهداری می شود. هنگام انجام گاز زدایی، باید از جوشاندن مایع شوینده اجتناب شود.

ب گاز زدایی حرارتی برای گاز زدایی مواد شوینده آبی-آلی با نسبت بالایی از آب استفاده می شود. فاز متحرک در یک فلاسک قرار داده می شود که به طور هرمتیک با درپوش بسته نشده است و در حمام آب با دمای حدود 50 درجه سانتیگراد قرار می گیرد. پس از 10-15 دقیقه، فلاسک با یک درپوش بسته می شود و زیر آب جاری تا دمای اتاق خنک می شود.

V. گاز زدایی اولتراسوند. فاز متحرک با اولتراسوند به مدت چند دقیقه درمان می شود و سپس به مدت 10-15 دقیقه ته نشین می شود. این روش اغلب برای گاززدایی مواد شوینده آبی-آلی به اندازه کافی موثر نیست.

سیستم های پمپاژ مدرن برای کروماتوگرافی مایع به سیستم های گاز زدایی خودکار مجهز شده اند. با این حال، هنگام انجام تجزیه و تحلیل گرادیان، بهتر است هر دو فاز متحرک را ابتدا و به صورت دستی با استفاده از یکی از روش های داده شده گاز زدایی کنید.

5. فیلتراسیون فاز متحرک. برای اطمینان از عملکرد بی وقفه پمپ، توصیه می شود فاز متحرک را با استفاده از فیلتر غشایی تحت خلاء فیلتر کنید.

6. شستشوی ستون و اجزای سیستم مایع. پس از کار با فازهای متحرک آبی-آلی حاوی نمک و اسید، کل سیستم مایع (از جمله ستون) باید با آب مقطر با افزودن حلال آلی 10-5 درصد شسته شود. این شستشو به گونه ای انجام می شود که در ساعات غیر کاری اجزای سیستم مایع کروماتوگراف و خود فاز ثابت فرسوده نشوند.

عدم انجام چنین شستشو، اول از همه، منجر به این واقعیت می شود که پس از توقف پمپ، نمک ها از مایع شوینده روی قطعات آن و روی دیواره های کووت آشکارساز رسوب می کنند. این به نوبه خود منجر به عملکرد ناپایدار دستگاه به عنوان یک کل و همچنین سایش زودرس قطعات متحرک پمپ می شود. شکست منظم در شستشوی سیستم از شوینده های حاوی نمک و اسید می تواند منجر به کاهش طول عمر فاز ساکن شود.

افزودن مقداری حلال آلی به آب شستشو برای جلوگیری از آلودگی بیولوژیکی سیستم سیال ضروری است.

7. انتقال به یک فاز موبایل جدید که با فاز قبلی ترکیب نمی شود. این انتقال از طریق یک حلال میانی انجام می شود که به طور نامحدود با هر دو فاز متحرک قابل اختلاط است - معمولاً از طریق ایزوپروپانول یا استون.

برای تغییر از یک شوینده آبی به یک شوینده غیرقطبی، سیستم مایع باید با آب با افزودن یک حلال آلی شسته شود، سپس ستون کروماتوگرافی را بردارید، سیستم را با ایزوپروپانول (استون) بشویید، سیستم را با یک غیر قابل شستشو بشویید. شوینده قطبی و یک ستون جدید نصب کنید.

برای انتقال معکوس، ستون کروماتوگرافی را بردارید، سیستم مایع را با ایزوپروپانول (استون) بشویید، سپس با یک شوینده آبی، سپس یک ستون جدید نصب کنید.

هنگام تغییر از یک شوینده آبی به یک غیر قطبی، از قبل مطمئن شوید که ماده آب بندی پمپ برای کار با حلال های غیر قطبی طراحی شده است.

8. فیلتراسیون نمونه. اگر نمونه آنالیز شده حاوی مواد معلق حل نشده باشد، بهتر است آن را با عبور نمونه از فیلتر غشایی متصل به سرنگ فیلتر کنید. متأسفانه، اگر نمونه کوچکتر از یک میلی لیتر باشد، فیلتر کردن آن به این روش تقریبا غیرممکن می شود.

هنگام تجزیه و تحلیل منظم نمونه های حاوی مواد معلق، فیلتر ورودی در ستون (فریت) ممکن است مسدود شود که در درجه اول منجر به افزایش فشار در سیستم می شود. در این صورت بهتر است فیلتر ورودی را تعویض کنید و در صورت عدم جایگزینی، آن را در یک حلال آلی با درمان اولتراسونیک به مدت 10-15 دقیقه بشویید.

بهینه ترین راه حل برای مشکل استفاده از فیلتر درون خطی در جلوی ستون است. فیلتر درون خطی حاوی یک فریت قابل تعویض است - مانند روی ستون. تعویض فریت در یک فیلتر درون خطی یک عملیات معمولی است که می تواند اغلب انجام شود.

9. کاربرد پیش ستون ها. با تجزیه و تحلیل منظم نمونه های "کثیف"، ستون کروماتوگرافی به سرعت کثیف می شود و توانایی جداسازی خود را از دست می دهد. یک جایگزین شناخته شده برای آماده سازی دقیق نمونه در این مورد، استفاده از یک پیش ستون است که ستون اصلی را از آلودگی محافظت می کند.

گاهی اوقات توصیه می شود که اصلاً آماده سازی نمونه را انجام ندهید، بلکه یک فیلتر درون خطی و پیش ستون را در ردیف جلوی ستون اصلی قرار دهید. از مزایای این طرح می توان به سادگی و سرعت آنالیز با کار و معرف کمتر اشاره کرد.

10. حفظ ستون های کروماتوگرافی. قبل از ذخیره سازی طولانی مدت، ستون های کروماتوگرافی شسته شده و با حلالی پر می شوند که برای هر نوع فاز ثابت کاملاً خاص است.

بنابراین، ستون‌های کروماتوگرافی برای عملکرد در سیستم‌های فاز عادی معمولاً با یک هیدروکربن با جوش بالا، به عنوان مثال، ایزواکتان پر می‌شوند. فازهای معکوس با آب شسته شده و با استونیتریل پر می شوند، یا با سرعت تغذیه کم با ایزوپروپانول. فازهایی که برای کار با بافرهای آبی در نظر گرفته شده اند با مقدار کمی از آزید سدیم (باکتریوستاتیک) با آب پر می شوند.

دستورالعمل های ذخیره سازی ستون ممکن است در گذرنامه آن نشان داده شود.

11. ذخیره سازی بافرهای آب. در مورد تعیین‌های معمول، تهیه فوری حجم زیادی از بافر آبی برای آماده‌سازی فاز متحرک کاملاً راحت است. متأسفانه، بافر آبی را نمی توان بیش از چند روز ذخیره کرد، مگر اینکه سدیم آزید، یک عامل باکتریواستاتیک، به آن اضافه شود. فازهای متحرک مبتنی بر بافر فسفات بسیار ضعیف ذخیره می شوند.

گاهی اوقات حجم زیادی از بافر آبی به منظور "افزایش تکرارپذیری آنالیز" تهیه می شود. به طور کلی، با این رویکرد تکرارپذیری تجزیه و تحلیل افزایش نمی یابد، اما مشکلات مربوط به ذخیره سازی بافر ناگزیر به وجود می آیند.

به طور کلی پاسخ به این سوال این است که آب بافر را برای یک هفته تهیه کنیم یا یک روز؟ - صرفاً با اصل راحتی تعیین می شود.

12. منظم بودن کالیبراسیون. به عنوان یک قاعده، کالیبراسیون بر اساس استاندارد هر روز یا هر بار که یک شوینده جدید تهیه می شود انجام می شود.

کالیبراسیون زمانی انجام می شود که سیستم کروماتوگرافی به حالت پایدار برسد. پارامترهای قابل خواندن عبارتند از زمان ماند پیک استاندارد، مساحت آن (در صورت تشخیص اسپکتروفتومتری - در طول موج مرجع)، نسبت های طیفی (در صورت استفاده از آشکارساز اسپکتروفتومتری اسکن یا آرایه دیود).

در ابتدای کار، استاندارد را می توان دو بار تجزیه و تحلیل کرد تا تکرارپذیری زمان ماندگاری را تأیید کند.

1. تعیین اجزای داروی "BICILLIN-3" توسط HPLC

بی سیلین 3 یک پنی سیلین طولانی اثر است و مخلوطی از نمک های سدیم، نووکائین و بنزاتین بنزیل پنی سیلین (BP) است. با توجه به VFS فعلی 42-3034-98، تعیین BP در دارو با استفاده از HPLC انجام می شود، نووکائین به روش اسپکتروفتومتری تعیین می شود و بنزاتین (N,N1-dibenzylethylenediamine) با اتر از محلول آبی اشباع شده با کلرید سدیم استخراج می شود. . پس از تبخیر اتر، بنزاتین توسط تیتراسیون با اسید پرکلریک تعیین می شود.

در فارماکوپه اروپایی، محتوای BP و بنزاتین در نمک بنزاتین BP با استفاده از گرادیان HPLC در مخلوطی از متانول با محلول فسفات سدیم در pH 3.5 تعیین می‌شود.

هدف از این کار توسعه یک روش HPLC در حالت ایزوکراتیک برای تعیین اجزاء در بی سیلین-3 است.

بخش تجربی

ما از بیسیلین-3 تولید شده توسط AKO Sintez (Kurgan) استفاده کردیم. این مطالعه بر روی کروماتوگراف از Waters (ایالات متحده آمریکا) با پمپ مدل 510، آشکارساز UV مدل 481 و انژکتور مدل 7125 (Rheodyne) با حلقه دوز با ظرفیت 50 میکرولیتر انجام شد. برای تشخیص، از طول موج 214 نانومتر استفاده شد که در آن تمام ترکیبات آنالیز شده به خوبی تشخیص داده شدند. ثبت کروماتوگرام ها و محاسبه مناطق پیک و پارامترهای حفظ اصلی با استفاده از رایانه شخصی با مبدل آنالوگ به دیجیتال و برنامه Multichrome انجام شد.

یک نسخه فاز معکوس از روش HPLC بر روی یک ستون Luna C18 (2) با ابعاد 250 x 4.6 میلی‌متر از Phenomenex (ایالات متحده آمریکا) مورد مطالعه قرار گرفت، زیرا ستون قبلاً با تقارن بهبود یافته خروجی آمین آلی ثابت کرده بود که نسبتاً ارزان است. قله ها برای همین منظور، مخلوطی از استونیتریل با محلول بافر حاوی تری اتیلامین به عنوان یکی از اجزاء و با pH 5.0 به عنوان فاز متحرک استفاده شد.

محلول اولیه برای تهیه فاز متحرک محلول 2.5 مولار اسید فسفریک است که با تری اتیلامین تا pH 5.0 تیتر شد. یک محلول بافر برای HPLC با رقیق کردن محلول اولیه با آب 10 بار تهیه شد و 750 میلی لیتر از محلول بافر حاصل با 250 میلی لیتر استونیتریل مخلوط شد. در همان زمان، مقدار pH ظاهری فاز متحرک به 5.7 افزایش یافت. سرعت فاز موبایل 1 میلی لیتر در دقیقه است. کروماتوگرافی در دمای اتاق انجام شد. زمان آنالیز 20 دقیقه

از آنجایی که اجزای موجود در دارو از نظر خواص اسید-باز متفاوت هستند - BP یک اسید است و نووکائین و بنزاتین باز هستند، با افزایش pH زمان ماند آنها در محدوده pH که در آن یونیزاسیون آنها تغییر می کند در جهات مختلف تغییر می کند. بنابراین، با تغییر pH، انتخاب یک نگهداری راحت از اجزای آنالیز شده آسان است. با این حال، افزایش pH منجر به بدتر شدن قابل توجه در شکل پیک بنزاتین می شود و کاهش منجر به وضوح ناکافی محصولات هیدرولیز نووکائین و BP می شود. جداسازی اجزای بی سیلین-3 در شرایط فوق در شکل نشان داده شده است. زمان ماند نووکائین، بنزاتین و BP به ترتیب 4.2، 11.6 و 14.8 دقیقه بود.

آنچه قابل توجه است خروجی پیک نووکائین بین 2 پیک است که محصولات هیدرولیز BP هستند. در این راستا، برای جداسازی بهتر اجزاء، توصیه می شود مقدار کمی محلول 2.5 مولار اسید فسفریک یا تری اتیلامین به فاز متحرک اضافه شود و با کروماتوگرافی مخلوطی از نووکائین و BP که محلول آن ذخیره شده است، جداسازی کنترل شود. حدود یک روز در دمای اتاق.

برای تعیین کمی، 20-25 میلی گرم بی سیلین-3 به یک فلاسک حجمی 100 میلی لیتری اضافه شد و در محلول آبی 20 درصد استونیتریل حل شد. استفاده از متانول یا محلول های آن برای انحلال منجر به متیلاسیون جزئی BP شد. افزایش غلظت استونیتریل منجر به گسترش پیک نووکائین شد. حد بالایی غلظت دارو با حلالیت آن محدود می شود. منحنی های کالیبراسیون برای BP و بنزاتین با استفاده از نمک سدیم BP و بنزاتین دی استات پس از تبدیل مناسب به دست آمد. نمودار کالیبراسیون برای BP خطی در منطقه 0.1-0.5 mg / ml، برای بنزاتین و نووکائین - در منطقه 0.01-0.05 mg / ml است. نتایج حاصل از تعیین اجزای 5 سری دارو در جدول 1 ارائه شده است که هر مقدار میانگین 5 تعیین است. انحراف استاندارد نسبی برای نووکائین 1.6٪، برای بنزاتین 3.4٪ و برای BP 1.4٪ بود.

از جدول 1 نتیجه می شود که نتایج تعیین کمی با استفاده از HPLC در محدوده مجاز تنظیم شده توسط ND قرار می گیرد.

برای تأیید صحت روش پیشنهادی، اجزای بی‌سیلین-3 در مخلوط‌های مدل تهیه‌شده با مخلوط کردن نمک سدیم BP، بنزاتین دی استات و نووکائین مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. نتایج در جدول 2 نشان داده شده است. نتایج دوباره به اجزای اصلی محاسبه شد.

هر مقدار در ستون "یافت" جدول 2 میانگین نتیجه 3 تعیین است. میانگین انحراف نسبی برای بنزاتین 2.2٪، برای نووکائین 0.9٪ و برای BP 0.8٪ بود که با میانگین انحراف استاندارد نسبی یافت شده در هنگام تجزیه و تحلیل اجزا در نمونه های واقعی مرتبط است. برای بنزاتین، پراکندگی نتایج کمی بیشتر از سایر اجزا است، که با ارتفاع کم و شکل نامنظم قله و بر این اساس، خطای ادغام بزرگتر توضیح داده می شود. یکی دیگر از دلایل خطاهای نسبتاً بزرگ در تعیین بنزاتین ممکن است اثر حافظه انژکتور هنگام تجزیه و تحلیل مواد بسیار جذب شده باشد. با این حال، حتی چنین پراکندگی، کمی بزرگتر از آنالیز پذیرفته شده با استفاده از روش HPLC، برای تعیین بنزاتین کاملاً قابل قبول است.

نتیجه گیری

1. روشی برای تشخیص و تعیین کمی اجزاء در آماده سازی "Bicillin-3" توسعه یافته است.

2. این روش بر روی تعدادی از دسته های دارو آزمایش شده است و با تجزیه و تحلیل مخلوط های مدل با ترکیب شناخته شده تایید شده است.

2. HPLC در آنالیز داروهای حاوی پروپیفنازون

پروپی فنازون (4-ایزوپروپیل-2،3-دی متیل-1-فنیل-3-پیرازولین-5-ون؛ ایزوپروپیلانتی پیرین) یک مسکن غیر مخدر از سری پیرازولون است و بخشی از داروهای ترکیبی بدون نسخه است. در حال حاضر، قرص های کافتین (ترکیب: پروپیفنازون - 0.21 گرم، پاراستامول - 0.25 گرم، کافئین - 0.05 گرم، کدئین فسفات - 0.01 گرم) و ساریدون (پاراستامول - 0.25 گرم) به طور گسترده در عمل پزشکی استفاده می شود. g15 g, propy. کافئین - 0.05 گرم). با توجه به اسناد نظارتی موجود، کروماتوگرافی در یک لایه نازک جاذب برای تأیید صحت قرص های کافتین استفاده می شود. تعیین کمی پیشنهاد شده است که در بخش های جداگانه دارو با استفاده از روش های مختلف برای هر جزء انجام شود: با استفاده از اسپکتروفتومتری، تیتریومتری، ترکیبی از کروماتوگرافی لایه نازک و اسپکتروفتومتری. در اسناد نظارتی برای ساریدون، پاراستامول، کافئین و پروپیفنازون توسط HPLC بر روی ستون‌هایی به طول 12.5 سانتی‌متر با جاذب Merck Lichrospher C18 و فاز متحرک ترکیب: متانول-0.01 مولار اسید فسفریک به نسبت 30: 70 تعیین می‌شوند.

هدف از این کار توسعه روش هایی برای تشخیص و تعیین کمی اجزای کافتین و قرص ساریدون با استفاده از HPLC است.

در این کار از قرص های کافتین تولید شده توسط Alkaloid Skopje (جمهوری مقدونیه)، ساریدون تولید شده توسط Laboratories Roche Nicholas S.A.، Gaillard (فرانسه) و مواد تشکیل دهنده موجود در ترکیب آنها استفاده شد. این مطالعه بر روی کروماتوگرافی مایع میکروستونی خانگی "Milichrom-4" با آشکارساز اسپکتروفتومتری UV، ستونی به طول 8 سانتی متر با جاذب فاز معکوس Separon-C18 به عنوان فاز ثابت انجام شد. ماهیت قطبی ترکیبات مورد تجزیه و تحلیل و حلالیت خوب آنها در آب و استونیتریل انتخاب مخلوط آب-استونیتریل را در نسبت های مختلف به عنوان فاز متحرک تعیین کرد. فازهای متحرک مورد آزمایش قرار گرفتند: استونیتریل - آب در نسبت 9: 1. 7:3; 6:4; 8:2 و استونیتریل-آب-دی اتیلامین (3:2:0.2). استفاده از فازهای متحرک با کسر حجمی حلال آلی بیش از 80 درصد به منظور حذف فعل و انفعالات فاز عادی، که کنترل بیشتر ترکیب فاز متحرک را پیچیده می‌کند، اجتناب شد. کسر حجمی حلال کمتر از 5٪ منجر به بی ثباتی عملکردی فاز متحرک و زمان های ماند غیر قابل تکرار می شود. ورود دی اتیلامین به فاز متحرک به عنوان یک اصلاح کننده امکان جداسازی هر 4 جزء قرص کافتین را فراهم کرد. مشخص شده است که در سطح ژل سیلیکا اکتادسیل مقدار قابل توجهی از گروه های سیلانول باقیمانده وجود دارد که قادر به برهمکنش تبادل یونی هستند. دی اتیل آمین گروه های سیلانول را از فرآیند کروماتوگرافی حذف می کند، شکل پیک را بهبود می بخشد، زمان تجزیه و تحلیل را کاهش می دهد و pH روی سطح سیلیکاژل را تنظیم می کند. اندازه گیری تحت شرایط زیر انجام شد: مقیاس ثبت 2.0، زمان ماند 0.8 ثانیه، سرعت جریان مایع شوینده 50 میکرولیتر در دقیقه، حجم تزریق 3 میکرولیتر. تشخیص پیک در 2 طول موج - 238 و 276 نانومتر انجام شد.

شناسایی با توجه به پارامترهای نگهداری انجام شد که قبلاً با استفاده از محلول‌های استاندارد مواد مورد مطالعه تعیین شده بود.

اجزای قرص کافتین با استفاده از فاز متحرک استونیتریل-آب-دی اتیلامین (3:2.2:0.2) جدا می شوند. زمان ماندگاری پاراستامول 3.08 دقیقه، پروپیفنازون - 5.73 دقیقه، کافئین - 4.0 دقیقه، کدئین - 4.67 دقیقه بود.

اجزای ساریدون را می توان با استفاده از فاز متحرک استونیتریل-آب نیز جدا کرد (8:2). زمان ماندگاری پاراستامول - 3.9 دقیقه، پروپیفنازون - 5.11 دقیقه، کافئین - 4.44 دقیقه.

برای تعیین کمی از روش کالیبراسیون مطلق استفاده شد. رابطه مستقیمی بین غلظت ماده و ارتفاع پیک برای پاراستامول در محدوده 50-200 میکروگرم بر میلی لیتر، برای پروپیفنازون - 25-128 میکروگرم در میلی لیتر، کافئین - 20-50 میکروگرم در میلی لیتر، کدئین - مشاهده شد. 59-234 میکروگرم در میلی لیتر.

روش HPLC دارای محدودیت هایی در تجزیه و تحلیل مخلوط های پیچیده است. با حضور همزمان مواد در مقادیر ماکرو و ریز در مخلوط، ستون بیش از حد بارگذاری می شود که بر کیفیت جداسازی و شکل قله های در حال ظهور تأثیر می گذارد. در کافتین، محتوای کدئین فسفات در رابطه با پاراستامول و پروپی فنازون 21-25 برابر کمتر است، بنابراین استخراج مایع برای جداسازی کدئین از اجزای باقیمانده قرص توصیه می شود. ما قبلاً ثابت کرده‌ایم که پاراستامول، پروپیفنازون و کافئین طی یک استخراج با اتیل استات از محلول‌های آبی در pH 2.0 به ترتیب به مقادیر 87.43، 87.29 و 87.84 درصد استخراج می‌شوند و کدئین به طور کامل در محلول آبی و برای استخراج آن باقی می‌ماند. غلظت لازم است از کلروفرم در pH 9.0-10.0 استفاده شود.

روش تعیین کمی پاراستامول، پروپی فنازون و کافئین در قرص‌های ساریدون و کافتین 20 قرص در هاون آسیاب شده و به صورت پودر همگن ریز در می‌آیند، حدود 0.01 گرم (دقیقاً وزن شده) از پودر قرص آسیاب شده را وزن کرده و در 25 میلی‌لیتر قرار می‌دهند. بالن حجمی 10 میلی لیتر استونیتریل اضافه کرده و کاملا مخلوط کنید.

محتویات فلاسک با استونیتریل به علامت می رسد، مخلوط و فیلتر می شود. محلول در حجم 3.0 میکرولیتر به ستون کروماتوگراف تزریق می شود. محتوای پاراستامول، پروپیفنازون و کافئین با روش کالیبراسیون مطلق تعیین می شود. نتایج تعیین در جداول 1 و 2 آورده شده است که از آن مشخص است که داده های به دست آمده در محدوده محتوای مجاز مطابق با اسناد نظارتی (ND) قرار می گیرند.

روش برای تعیین کمی کدئین فسفات در قرص های کافتین.حدود 0.2 گرم قرص خرد شده (دقیقاً وزن شده) در 20 میلی لیتر آب حل می شود، خوب مخلوط می شود تا محلول همگن به دست آید، از طریق یک فیلتر برای رسوبات ریز و بسیار ریز فیلتر می شود، فیلتر با 10 میلی لیتر آب تصفیه شده شسته می شود. محلول با محلول اسید سولفوریک 10% اسیدی می شود تا pH 2.0 باشد. سه بار با اتیل استات در قسمت های 10 میلی لیتری عصاره گیری کنید. عصاره ها دور ریخته می شوند. یک محلول آمونیاک 25٪ به محلول آبی با pH 9.0-10.0 اضافه می شود. سه بار با کلروفرم در قسمت های 10 میلی لیتری عصاره گیری کنید. عصاره های کلروفرمی ترکیب شده در فنجان های چینی قرار می گیرند و در دمای اتاق تبخیر می شوند. بقایای خشک در استونیتریل حل شده، به یک فلاسک حجمی 25 میلی لیتری منتقل شده و با همان حلال به علامت رقیق می شود و 3 میکرولیتر از محلول حاصل به ستون کروماتوگرافی وارد شده و کدئین تحت شرایط توصیف شده تعیین می شود. نتایج حاصل از تعیین در جدول 3 آورده شده است.

برای ارزیابی صحت روش‌های پیشنهادی و بررسی تکرارپذیری نتایج، مخلوط‌های مدل تهیه و مورد مطالعه قرار گرفتند. داده های مبتنی بر نمونه قرص ساریدون در جدول 4 آورده شده است. همانطور که از جدول 4 مشاهده می شود، خطای نسبی تعیین برای پاراستامول 1.19 ±، برای پروپیفنازون 1.16 ± و برای کافئین 1.63 ± درصد تجاوز نمی کند.

روشی برای تعیین کمی اجزای قرص ساریدون در مخلوط مدل.بخش های دقیق پاراستامول (حدود 0.08 گرم)، پروپیفنازون (حدود 0.05 گرم) و کافئین (حدود 0.016 گرم) را وزن کنید، به یک بالن حجمی 50 میلی لیتری منتقل کنید، در حجم کمی از استونیتریل حل کنید و با همان استونیتریل تا نقطه علامت گذاری کنید. حلال. مقدار کمی از 2.5 میلی لیتر را بردارید و آن را به یک فلاسک حجمی 25 میلی لیتری منتقل کنید، حجم را با همان حلال تا علامت تنظیم کنید، مخلوط کنید و صاف کنید. محلول در حجم 3 میکرولیتر به ستون کروماتوگراف تزریق می شود.

نتیجه گیری

1. روشی برای تشخیص اجزای کافتین و قرص ساریدون با استفاده از HPLC ایجاد شده است.

زمان ماند برای پاراستامول 3.08 دقیقه، برای پروپیفنازون - 5.73 دقیقه، کافئین - 4 دقیقه و کدئین - 4.67 دقیقه بود.

2. یک روش HPLC برای تعیین کمی اجزای کافتین و قرص ساریدون پیشنهاد شد.

خطای نسبی تعیین برای پاراستامول 1.19-1.21 درصد، برای پروپیفنازون 1.16-1.71 درصد، برای کافئین 1.22-1.63 درصد و برای کدئین ±2.95 درصد بود.

3. استانداردسازی داروی "آدانول"

شرکت داروسازی پولیسان تعدادی داروی پیچیده با اثرات متابولیک تولید کرده است که فرآیندهای متابولیک را در مغز تحریک می کند، از جمله سیتوفلاوین (تزریق، قرص) و آدانول. "آدانول" دارای خواص ضد هیپوکسیک و ضد ایسکمیک است و یک داروی امیدوارکننده برای درمان بیماران مبتلا به عواقب سکته مغزی است. این یک شکل دوز قرص است که با پوشش روده ای پوشانده شده است.

حاوی سوکسینیک اسید (SA)، پیراستام (Pc)، ریبوکسین (Rb)، نیکوتین آمید (NA)، پیریدوکسین هیدروکلراید (PG)، ریبوفلاوین مونونوکلئوتید (RF) است.

هدف از کار ایجاد روشی برای تعیین کمی و کیفی UC در مخلوط‌های چند جزئی پیچیده با استفاده از مثال داروی "آدانول" است.

در این کار از یک کروماتوگرافی مایع با فشار بالا از Shimadzu (ژاپن) با آشکارساز UV و یک ستون Hypersil BDS C18 از Supelco Inc استفاده شد. اندازه دانه 5 میکرون، طول 250 میلی متر با قطر داخلی 4.6 میلی متر. فاز متحرک یک فاز آبی-آلی مبتنی بر بافر فسفات (pH 2.6-7.0) است. طول موج تشخیص 206 نانومتر حالت آنالیز ایزوکراتیک، سرعت شستشو 500 میکرولیتر در دقیقه. حجم نمونه 20 میکرولیتر طیف UV بر روی یک اسپکتروفتومتر UV mini-1240 از Shimadzu ثبت شد.

برای تعیین کمی بیشتر مواد موجود در دارو، روش های اسپکتروفتومتری آنالیز پیشنهاد شده است. با این حال، مقایسه ویژگی های طیفی اجزای دارو نشان داد که مناطق جذب YAK، PG، NA، Pb و Pc در ناحیه UV با یکدیگر همپوشانی دارند (شکل 1).

در این راستا، محتوای آنها در مخلوط را نمی توان با اسپکتروفتومتری مستقیم تعیین کرد و در این مورد توصیه می شود از روش HPLC استفاده شود. فقط RF دارای ناحیه جذب ویژه بیش از 350 نانومتر است (lmax=373، E1% 1cm=202 و lmax=445nm، E1% 1cm=243)، بنابراین یک تحلیل کیفی و کمی با روش اسپکتروفتومتری برای آن پیشنهاد شده است.

بر اساس داده‌های به‌دست‌آمده، طول موج کاری بهینه برای آنالیز 5 ماده انتخاب شد. این مقدار حداکثر طیف UV UC است که کمترین جذب ویژه (lmax = 206 نانومتر E1% 1cm = 5.8) را در مقایسه با سایر اجزای مخلوط دارد (جدول را ببینید).

از آنجایی که تمام مواد موجود در آماده سازی یونی هستند، توصیه می شود از کروماتوگرافی فاز معکوس برای تجزیه و تحلیل آنها با استفاده از فازهای ثابت و متحرک غیر قطبی استفاده شود. در کروماتوگرافی فاز معکوس ترکیبات یونی، مقدار pH یکی از عواملی است که به طور قابل توجهی بر راندمان جداسازی تک تک مواد تأثیر می گذارد. هنگام کار با جاذب های فاز معکوس مدرن، محلول های بافری با pH در محدوده 2.0 تا 8.0 معمولاً در فاز متحرک استفاده می شود. از آنجایی که طول موج عملیاتی بهینه انتخاب شده 206 نانومتر است، بهتر است از بافر فسفات استفاده شود زیرا موقعیتی در محدوده طول موج UV بیش از 200 نانومتر ندارد.

برای مطالعه رفتار UC در مقادیر مختلف pH، طیف های آن در محلول های بافر فسفات pH 7.0 و 2.6 ثبت شد (شکل 2). در pH 2.6، یک اثر هیپوکرومیک شکل مولکولی UC مشاهده می شود - جذب در مقایسه با طیف در pH 7.0 3 برابر کاهش می یابد (در این مقدار pH، تفکیک UC به طور کامل سرکوب می شود). با در نظر گرفتن این موضوع، مقدار pH بهینه فاز متحرک 7.0 است. سپس تأثیر ترکیب و pH فاز متحرک بر کارایی جداسازی اجزای دارو مورد مطالعه قرار گرفت. در pH 2.6، هیچ جداسازی کاملی از مخلوط به پیک‌های منفرد وجود نداشت - PC، Na و PG تقسیم نمی‌شوند و ابتدا به عنوان یک پیک بیرون می‌آیند و پس از آن YaK و Pb به شکل پیک‌های منفرد قرار می‌گیرند. در pH 5.5 نیز جداسازی کامل اجزا وجود نداشت. در pH 7.0، جداسازی کامل اجزای مخلوط رخ داد. همه مواد به شکل پیک های جداگانه در توالی زیر ظاهر شدند: YAK، Pc، PG، NA و Pb. با این حال، روند جداسازی طولانی است - 45-50 دقیقه.

برای اطمینان از نیروی شستشوی بیشتر فاز متحرک و سرعت بخشیدن به فرآیند جداسازی، لازم است یک حلال آلی قطبی کمتر در ترکیب آن وارد شود. از حلال هایی که اغلب به عنوان شوینده در HPLC استفاده می شوند، با توجه به حد شفافیت در نور UV در طول موج کاری انتخاب شده (lopt = 206 نانومتر)، می توانیم از استونیتریل و متانول استفاده کنیم که حدود شفافیت آنها به ترتیب 195 و 205 نانومتر است.

زمانی که متانول 2 درصد به فاز متحرک وارد شد، زمان فرآیند کاهش یافت، اما پیک NA دارای عدم تقارن بالایی بود و پیک سرب روی دم پیک NA همپوشانی داشت. پس از کاهش غلظت متانول به 1٪، پیک های سرب و NA با هم همپوشانی نداشتند، اما عدم تقارن پیک NA افزایش یافت. به منظور کاهش آن، استونیتریل به فاز متحرک حاوی 1 درصد متانول وارد شد.

در نتیجه آزمایش ها، یک فاز متحرک انتخاب شد - یک فاز آبی-آلی متشکل از یک بافر فسفات با pH 7.0 حاوی 1٪ متانول و 0.5٪ استونیتریل، که جداسازی موثر هر 5 جزء را تضمین می کرد (شکل 3). کل زمان کروماتوگرافی در این سیستم 35 دقیقه و زمان ماندگاری اجزا تقریباً (بر حسب دقیقه) بود: YA - 5.3، Ps - 15، PG - 19.3، NA - 26، Rb - 31.

تعیین کمی با روش استاندارد خارجی با استفاده از محلول‌های نمونه استاندارد اجزای جداگانه انجام شد.

مشخصات مترولوژیکی روش تعیین کمی پیشنهادی با استفاده از مخلوط مدل در 5 تکرار مورد مطالعه قرار گرفت و در جدول ارائه شده است.

همانطور که از جدول زیر است، با استفاده از روش توسعه یافته در داروی "آدانول" می توان هر 5 جزء را با خطای نسبی بیش از 3٪ با احتمال اطمینان 95٪ تعیین کرد.

علاوه بر پیک‌های اجزای اصلی دارو، کروماتوگرام به‌دست‌آمده در شرایطی که در بالا توضیح داده شد، قله‌های هیپوگزانتین و اسید نیکوتینیک موجود در مواد اولیه و همچنین آنهایی را که در طی هیدرولیز از سرب و NA تشکیل شده‌اند را شناسایی می‌کند. بنابراین، روش توسعه‌یافته به ما اجازه می‌دهد تا این ناخالصی‌های خارجی را در آماده‌سازی به صورت کیفی و کمی تعیین کنیم.

نتیجه گیری

1. شرایط بهینه برای تجزیه و تحلیل کمی اسید سوکسینیک با استفاده از روش HPLC در یک مخلوط چند جزئی تعیین شد.

2. روشی برای تجزیه و تحلیل کیفی و کمی اجزای داروی "آدانول" از جمله ناخالصی ها با خطای نسبی تعیین بیش از 3٪ توسعه یافته است.

فهرست ادبیات استفاده شده

1. م.ا. Kazmin، A.V. میخالف، A.P. Arzamastsev "تعیین اجزای دارو "BICILLIN-3" توسط HPLC" // داروخانه - شماره 5 - 2002 - ص 5-6.

2. T.H. ورگیچیک، ن. اس. Onegova "HPLC در تجزیه و تحلیل داروهای حاوی پروپیفنازون" // داروسازی - شماره 6 - 2002 - صفحات 13-16.

3. A.Yu. پتروف، اس.ا. دمیتریچنکو، A.L. کووالنکو، ال.ای. الکسیوا "استانداردسازی دارو "آدانول" // داروخانه - شماره 5 - 2002 - صفحات 11-13.

اضافی

1. Baram G.I., Fedorova G.A. // کاربرد کروماتوگرافی در صنایع غذایی، میکروبیولوژیکی و پزشکی: مات. همه Conf. - گلندژیک، 1990 - ص 43-44.

2. Krichkovskaya L.V., Chernenkaya L.A. // کاربرد کروماتوگرافی در صنایع غذایی، میکروبیولوژیکی و پزشکی: مات. همه Conf. - Gelendzhik, اکتبر 8-12, 1990, M., 1990. - P.49.

3. کروماتوگرافی: کاربرد عملی روش: در 2 قسمت. قسمت دوم - م.: میر، 1365. - 422 ص.

مقاله عمومی داروسازی

به جای هنر GF XI

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (کروماتوگرافی مایع با فشار بالا) یک روش کروماتوگرافی ستونی است که در آن فاز متحرک مایعی است که در یک ستون کروماتوگرافی پر از یک فاز ثابت (جاذب) حرکت می کند. ستون های کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا با مقاومت هیدرولیکی بالا در ورودی مشخص می شوند.

بسته به مکانیسم جداسازی مواد، انواع زیر کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا متمایز می شود: جذب، تقسیم، تبادل یون، حذف، کایرال و غیره مطابق با ماهیت برهمکنش های بین مولکولی اصلی که رخ می دهد. در کروماتوگرافی جذبی، جداسازی مواد به دلیل توانایی های متفاوت آنها برای جذب و دفع از سطح یک جاذب با سطح توسعه یافته، به عنوان مثال، سیلیکاژل اتفاق می افتد. در کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا پارتیشن، جداسازی به دلیل تفاوت در ضرایب توزیع مواد جدا شده بین فاز ساکن (معمولاً به صورت شیمیایی به سطح حامل ثابت پیوند می‌شود) و فاز متحرک رخ می‌دهد.

بسته به نوع فاز متحرک و ثابت، کروماتوگرافی فاز عادی و فاز معکوس تشخیص داده می شود. در کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا فاز نرمال، فاز ثابت قطبی است (اغلب سیلیکا ژل یا سیلیکاژل با گروه های NH 2 یا CN پیوندی و غیره) و فاز متحرک غیر قطبی است (هگزان یا مخلوطی از هگزان). با حلال های آلی قطبی بیشتر - کلروفرم، الکل ها و غیره). احتباس مواد با افزایش قطبیت افزایش می یابد. در کروماتوگرافی فاز معمولی، توانایی شستشوی فاز متحرک با افزایش قطبیت افزایش می یابد.

در کروماتوگرافی فاز معکوس، فاز ثابت غیرقطبی است (سیلیکاژل های آبگریز با گروه های پیوندی C4، C8، C18، و غیره). فاز متحرک - قطبی (مخلوط آب و حلال های قطبی: استونیتریل، متانول، تتراهیدروفوران و غیره). احتباس مواد با افزایش آبگریزی (غیر قطبی) افزایش می یابد. هر چه مقدار حلال آلی بیشتر باشد، توانایی شستشوی فاز متحرک بالاتر است.

در کروماتوگرافی تبادل یونی، مولکول‌های مخلوطی از مواد، که در محلول به کاتیون‌ها و آنیون‌ها تفکیک شده‌اند، هنگام حرکت از طریق جاذب (مبدل کاتیونی یا مبدل آنیونی) به دلیل قدرت متفاوت برهمکنش یون‌های تعیین‌شده با گروه‌های یونی، از هم جدا می‌شوند. از جاذب

در کروماتوگرافی حذف اندازه (الک، نفوذ ژل، فیلتراسیون ژل)، مولکول های مواد به دلیل توانایی متفاوت آنها برای نفوذ در منافذ فاز ساکن، بر اساس اندازه جدا می شوند. در این حالت، بزرگترین مولکول هایی که قادر به نفوذ به حداقل تعداد منافذ فاز ساکن هستند، اولین کسانی هستند که ستون را ترک می کنند و مواد با اندازه های مولکولی کوچک آخرین کسانی هستند که از ستون خارج می شوند.

کروماتوگرافی کایرال ترکیبات فعال نوری را به انانتیومرهای جداگانه جدا می کند. جداسازی را می توان در فازهای ثابت کایرال یا در فازهای ثابت کایرال با استفاده از فازهای متحرک کایرال انجام داد.

گزینه های دیگری برای کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا وجود دارد.

بسته به نوع فازهای متحرک و ثابت و همچنین ماهیت ترکیبی که تعیین می شود، اغلب جداسازی نه با یک، بلکه توسط چندین مکانیسم به طور همزمان رخ می دهد.

منطقه برنامه

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا با موفقیت برای تجزیه و تحلیل کمی و کیفی محصولات دارویی در آزمایش‌های "هویت"، "ناخالصی‌های خارجی"، "انحلال"، "یکنواختی دوز"، "تعیین کمی" استفاده شده است. لازم به ذکر است که کروماتوگرافی به شما امکان می دهد چندین آزمایش را در یک نمونه ترکیب کنید، از جمله "اصالت" و "تعیین کمی".

تجهیزات

برای انجام تجزیه و تحلیل، از ابزارهای مناسب - کروماتوگرافی مایع استفاده می شود.

کروماتوگراف مایع معمولاً شامل اجزای اصلی زیر است:

- واحد آماده سازی فاز متحرک، شامل یک ظرف با فاز متحرک (یا ظروف با حلال های جداگانه موجود در فاز متحرک) و یک سیستم گاز زدایی فاز متحرک؛

- سیستم پمپاژ؛

- میکسر فاز متحرک (در صورت لزوم)؛

- سیستم معرفی نمونه (انژکتور)، می تواند دستی یا اتوماتیک (اتوماتیک) باشد.

- ستون کروماتوگرافی (قابل نصب در ترموستات)؛

- آشکارساز (یک یا چند با روش های مختلف تشخیص)؛

- سیستم کنترل کروماتوگراف، جمع آوری و پردازش داده ها.

علاوه بر این، کروماتوگراف ممکن است شامل: یک سیستم آماده سازی نمونه و یک راکتور پیش ستونی، یک سیستم سوئیچینگ ستونی، یک راکتور پس از ستون و سایر تجهیزات باشد.

سیستم پمپاژ

پمپ ها فاز متحرک را با سرعت معین به ستون تامین می کنند. ترکیب فاز متحرک و سرعت جریان می تواند در طول تجزیه و تحلیل ثابت یا متغیر باشد. در مورد ترکیب ثابت فاز متحرک، فرآیند ایزوکراتیک و در مرحله دوم - گرادیان نامیده می شود. یک سیستم پمپاژ کروماتوگرافی مایع مدرن از یک یا چند پمپ کنترل شده توسط کامپیوتر تشکیل شده است. این به شما امکان می دهد ترکیب فاز متحرک را طبق یک برنامه خاص در طول شستشوی گرادیان تغییر دهید. پمپ‌های کروماتوگرافی مایع تحلیلی با کارایی بالا به شما این امکان را می‌دهند که سرعت جریان فاز متحرک را در ستون در محدوده 0.1 تا 10 میلی‌لیتر در دقیقه با فشار ورودی ستون تا 40 مگاپاسکال حفظ کنید. ضربان های فشار توسط سیستم های دمپر مخصوصی که در طراحی پمپ ها گنجانده شده اند به حداقل می رسد. قسمت های کاری پمپ ها از مواد مقاوم در برابر خوردگی ساخته شده است که امکان استفاده از اجزای تهاجمی را در فاز متحرک فراهم می کند.

شیرآلات

در میکسر، در صورتی که مخلوط مورد نیاز از قبل تهیه نشده باشد، یک فاز متحرک منفرد از حلال های منفرد عرضه شده توسط پمپ ها تشکیل می شود. اختلاط اجزای فاز متحرک در میکسر می تواند هم در فشار کم (قبل از پمپ ها) و هم در فشار بالا (بعد از پمپ ها) رخ دهد. میکسر را می توان برای آماده سازی فاز متحرک و شستشوی ایزوکراتیک استفاده کرد.

حجم میکسر می تواند بر زمان ماندگاری اجزا در طول شستشوی گرادیان تأثیر بگذارد.

انژکتورها

انژکتورها می توانند جهانی باشند، با قابلیت تغییر حجم نمونه تزریق شده، یا گسسته برای تزریق حجم معینی از نمونه. هر دو نوع انژکتور می توانند اتوماتیک باشند ("انژکتورهای خودکار" یا "نمونه گیری خودکار"). انژکتور برای معرفی نمونه (محلول) مستقیماً در مقابل ستون کروماتوگرافی قرار دارد. طراحی انژکتور به شما امکان می دهد جهت جریان فاز متحرک را تغییر دهید و نمونه اولیه را به یک حلقه دوز با حجم معین (معمولاً از 10 تا 100 میکرولیتر) یا به یک دستگاه دوز ویژه با حجم متغیر وارد کنید. . حجم حلقه روی علامت گذاری آن نشان داده شده است. طراحی مجزای انژکتور معمولاً امکان تعویض حلقه را می دهد. انژکتورهای اتوماتیک مدرن می توانند تعدادی عملکرد اضافی داشته باشند، به عنوان مثال، عملکرد ایستگاه آماده سازی نمونه را انجام دهند: نمونه ها را مخلوط و رقیق کنید، یک واکنش مشتق سازی قبل از ستون را انجام دهید.

ستون کروماتوگرافی

ستون‌های کروماتوگرافی معمولاً لوله‌های ساخته شده از فولاد ضد زنگ، شیشه یا پلاستیک هستند که با جاذب پر شده و از دو طرف با فیلترهایی با قطر منافذ 2-5 میکرومتر بسته می‌شوند. طول ستون تحلیلی می تواند در محدوده 5 تا 60 سانتی متر یا بیشتر باشد، قطر داخلی می تواند از 2 تا 10 میلی متر باشد. در کروماتوگرافی میکروستونی از ستون هایی با قطر داخلی کمتر از 2 میلی متر استفاده می شود. همچنین ستون های مویین با قطر داخلی حدود 0.3-0.7 میلی متر وجود دارد. ستون های کروماتوگرافی مقدماتی می توانند قطر داخلی 50 میلی متر یا بیشتر داشته باشند.

ستون های کوتاه (پیش ستون) را می توان در جلوی ستون تحلیلی برای انجام وظایف کمکی مختلف نصب کرد که اصلی ترین آنها محافظت از ستون تحلیلی است. به طور معمول، تجزیه و تحلیل در دمای اتاق انجام می شود، اما برای افزایش راندمان جداسازی و کاهش زمان تجزیه و تحلیل، می توان از ترموستات ستونی در دمای 80 تا 100 درجه سانتی گراد استفاده کرد. امکان استفاده از دماهای بالا در هنگام جداسازی به دلیل پایداری فاز ثابت محدود شده است، زیرا تخریب آن در دماهای بالا امکان پذیر است.

فاز ثابت (جاذب)

موارد زیر معمولاً به عنوان جاذب استفاده می شوند:

• ژل سیلیکا، اکسید آلومینیوم، مورد استفاده در کروماتوگرافی فاز معمولی. مکانیسم حفظ در این مورد معمولاً جذب است.
• سیلیکاژل، رزین ها یا پلیمرهای پیوند شده با گروه های اسیدی یا بازی. حوزه کاربرد - تبادل یونی و کروماتوگرافی یونی.
• سیلیکاژل یا پلیمرهایی با توزیع اندازه منافذ مشخص (کروماتوگرافی حذف اندازه).
• جاذب های اصلاح شده شیمیایی (جاذب هایی با فازهای پیوندی) که اغلب بر اساس ژل سیلیکا تهیه می شوند. مکانیسم حفظ، جذب یا توزیع بین فاز متحرک و ثابت است. دامنه کاربرد بستگی به نوع گروه های عاملی پیوند شده دارد. برخی از انواع جاذب ها را می توان در کروماتوگرافی فاز معکوس و معمولی استفاده کرد.
• جاذب های کایرال اصلاح شده شیمیایی، به عنوان مثال، سلولز و مشتقات آمیلوز، پروتئین ها و پپتیدها، سیکلودکسترین ها، کیتوزان ها، که برای جداسازی انانتیومرها (کروماتوگرافی کایرال) استفاده می شوند.

جاذب های با فازهای پیوندی می توانند درجات مختلفی از اصلاح شیمیایی داشته باشند. پرکاربردترین فازهای پیوندی عبارتند از:

- گروه های اکتادسیلی (اکتادسیل سیلان جاذب (ODS) یا C 18)؛

- گروه های اکتیل (اکتیل سیلان جاذب یا C8)؛

- گروه های فنیل (جاذب فنیل سیلان)؛

- گروه های سیانوپروپیل (جاذب CN)؛

- گروه های آمینوپروپیل (جاذب NH 2)؛

– گروه های دیول (دیول جاذب).

اغلب، آنالیز روی فازهای پیوندی غیرقطبی در حالت فاز معکوس با استفاده از جاذب C 18 انجام می شود.

مواد جاذب با فازهای پیوندی به دست آمده بر اساس ژل سیلیکا از نظر شیمیایی در مقادیر pH از 2.0 تا 7.0 پایدار هستند، مگر اینکه به طور خاص توسط سازنده بیان شده باشد. ذرات جاذب می توانند شکل های کروی یا نامنظم و تخلخل های متنوع داشته باشند. اندازه ذرات جاذب در کروماتوگرافی مایع تحلیلی با کارایی بالا معمولاً 10-3 میکرومتر است، در کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا آماده سازی - 50 میکرومتر یا بیشتر. همچنین ستون های یکپارچه وجود دارد که در آنها جاذب یکپارچه با منافذ عبوری است که کل حجم ستون را پر می کند.

راندمان جداسازی بالا توسط سطح بالای ذرات جاذب (که نتیجه اندازه میکروسکوپی آنها و وجود منافذ است) و همچنین ترکیب یکنواخت جاذب و بسته بندی متراکم و یکنواخت آن تضمین می شود.

آشکارسازها

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا از انواع روش های تشخیص استفاده می کند. در حالت کلی، فاز متحرک با اجزای حل شده در آن پس از ورود ستون کروماتوگرافی به سلول آشکارساز، جایی که یکی از خواص آن به طور مداوم اندازه گیری می شود (جذب در ناحیه ماوراء بنفش یا مرئی طیف، فلورسانس، ضریب شکست، الکتریکی رسانایی و غیره). کروماتوگرام حاصل نموداری از وابستگی برخی پارامترهای فیزیکی یا فیزیکوشیمیایی فاز متحرک به زمان است.

رایج ترین آشکارسازها در کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا، اسپکتروفتومتری هستند. در طول شستشوی مواد، چگالی نوری محلول خروجی در یک میکروکووت مخصوص طراحی شده در طول موج از پیش انتخاب شده اندازه گیری می شود. طیف گسترده خطی آشکارساز امکان تجزیه و تحلیل ناخالصی ها و اجزای اصلی مخلوط را در یک کروماتوگرام واحد فراهم می کند. یک آشکارساز اسپکتروفتومتری امکان تشخیص را در هر طول موجی در محدوده کاری خود (معمولاً 190-600 نانومتر) فراهم می کند. آشکارسازهای چند موجی نیز مورد استفاده قرار می‌گیرند که امکان تشخیص همزمان در چندین طول موج و آشکارسازهای آرایه‌ای دیودی را فراهم می‌کنند که امکان ثبت همزمان چگالی نوری در کل محدوده طول موج عملیاتی (معمولاً 190-950 نانومتر) را فراهم می‌کند. این امکان ثبت طیف جذب اجزای عبوری از سلول آشکارساز را فراهم می کند.

یک آشکارساز فلورسنت برای تعیین ترکیبات فلورسنت یا ترکیبات غیر فلورسنت در قالب مشتقات فلورسنت آنها استفاده می شود. اصل کار یک آشکارساز فلورمتری بر اساس اندازه گیری انتشار فلورسنت نور جذب شده است. جذب معمولاً در ناحیه فرابنفش طیف انجام می شود، طول موج تشعشعات فلورسنت از طول موج نور جذب شده بیشتر است. آشکارسازهای فلورمتری حساسیت و گزینش پذیری بسیار بالایی دارند. حساسیت آشکارسازهای فلورسانس تقریباً 1000 برابر بیشتر از حساسیت آشکارسازهای اسپکتروفتومتری است. آشکارسازهای فلورسنت مدرن نه تنها به دست آوردن کروماتوگرام ها، بلکه همچنین ثبت طیف های تحریک و فلورسانس ترکیبات مورد تجزیه و تحلیل را ممکن می سازد.

برای تعیین ترکیباتی که در نواحی فرابنفش و نواحی مرئی طیف جذب ضعیفی دارند (مثلاً کربوهیدرات ها)، استفاده کنید. انکسار سنجیآشکارسازها (انکسار سنج). از معایب این آشکارسازها می توان به حساسیت کم (در مقایسه با آشکارسازهای اسپکتروفتومتری) و وابستگی قابل توجه به درجه حرارت به شدت سیگنال (آشکارگر باید دارای ترموستات باشد) و همچنین عدم امکان استفاده از آنها در حالت شستشوی گرادیان اشاره کرد.

اصل عملیات آشکارسازهای پراکندگی نور لیزر تبخیریبر اساس اختلاف فشار بخار حلال های کروماتوگرافی موجود در فاز متحرک و مواد مورد تجزیه و تحلیل است. فاز متحرک در خروجی ستون وارد دستگاه اتمایزر شده، با نیتروژن یا CO 2 مخلوط شده و به شکل یک آئروسل خوب، وارد یک لوله تبخیر گرم شده با دمای 30 تا 160 درجه سانتیگراد می شود که در آن دستگاه متحرک فاز تبخیر می شود یک آئروسل از ذرات غیرفرار مواد مورد تجزیه و تحلیل، شار نور را در محفظه پراکندگی پراکنده می کند. با درجه پراکندگی شار نور، می توان مقدار ترکیب تعیین شده را قضاوت کرد. آشکارساز حساس تر از یک انکسارسنج است، سیگنال آن به خواص نوری نمونه، به نوع گروه های عاملی در مواد تعیین شده، به ترکیب فاز متحرک بستگی ندارد و می تواند در گرادیان استفاده شود. حالت شستشو

آشکارسازهای الکتروشیمیایی (رسانایی، آمپرومتریک، کولومتری و غیره). یک آشکارساز آمپرومتریک برای تشخیص ترکیبات الکترواکتیو که می توانند روی سطح یک الکترود جامد اکسید یا احیا شوند استفاده می شود. سیگنال تحلیلی مقدار جریان اکسیداسیون یا کاهش است. سلول آشکارساز حداقل دو الکترود دارد - یک الکترود کار و یک الکترود مرجع (کلرید نقره یا فولاد). یک پتانسیل کاری به الکترودها اعمال می شود که مقدار آن به ماهیت ترکیبات تعیین شده بستگی دارد. اندازه گیری ها را می توان هم در یک پتانسیل ثابت و هم در حالت پالسی انجام داد، زمانی که مشخصات تغییرات پتانسیل الکترود کار در طول یک چرخه ضبط سیگنال تنظیم می شود. یک آشکارساز آمپرومتریک از الکترودهای کاری ساخته شده از مواد کربن (اغلب کربن شیشه ای یا گرافیت) و فلزات: پلاتین، طلا، مس، نیکل استفاده می کند.

یک آشکارساز هدایت سنجی برای تشخیص آنیون ها و کاتیون ها در کروماتوگرافی یونی استفاده می شود. اصل عملکرد آن بر اساس اندازه گیری هدایت الکتریکی فاز متحرک در طول شستشوی ماده است.

یک آشکارساز طیف سنجی جرمی که حساسیت و گزینش پذیری بالایی دارد، بسیار آموزنده است. جدیدترین مدل های طیف سنج جرمی کروماتوگرافی مایع در محدوده جرمی m/z بین 20 تا 4000 amu عمل می کنند.

در کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا، آشکارسازهای فوریه-IR، رادیواکتیویته و برخی دیگر نیز استفاده می شود.

سیستم جمع آوری و پردازش داده ها

یک سیستم پردازش داده مدرن یک رایانه شخصی است که با یک کروماتوگراف با نرم افزار نصب شده رابط دارد که به شما امکان می دهد کروماتوگرام را ضبط و پردازش کنید و همچنین عملکرد کروماتوگراف را کنترل کنید و پارامترهای اصلی سیستم کروماتوگرافی را نظارت کنید.

فاز موبایل

فاز متحرک در کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا عملکرد دوگانه ای را انجام می دهد: انتقال مولکول های جذب شده را در طول ستون تضمین می کند و ثابت های تعادل را تنظیم می کند، و در نتیجه، حفظ در نتیجه برهمکنش با فاز ساکن (جذب شده روی سطح) و با مولکول های مواد در حال جدا شدن. بنابراین، با تغییر ترکیب فاز متحرک در کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا، می توان بر زمان ماند ترکیبات، انتخاب پذیری و کارایی جداسازی آنها تأثیر گذاشت.

فاز متحرک می تواند از یک حلال، اغلب دو حلال، و در صورت لزوم، سه یا بیشتر تشکیل شود. ترکیب فاز متحرک به عنوان نسبت حجمی حلال های تشکیل دهنده آن نشان داده می شود. در برخی موارد، نسبت جرم ممکن است نشان داده شود که باید به طور خاص بیان شود. محلول های بافر با مقدار pH معین، نمک های مختلف، اسیدها و بازها و سایر اصلاح کننده ها می توانند به عنوان اجزای فاز متحرک استفاده شوند.

کروماتوگرافی فاز معمولی معمولاً از هیدروکربن های مایع (هگزان، سیکلوهگزان، هپتان) و دیگر حلال های نسبتاً غیر قطبی با افزودن کمی ترکیبات آلی قطبی استفاده می کند که نیروی شستشوی فاز متحرک را تنظیم می کند.

در کروماتوگرافی فاز معکوس، آب یا مخلوط های آبی-آلی به عنوان فاز متحرک استفاده می شود. افزودنی های آلی معمولا حلال های آلی قطبی (استونیتریل و متانول) هستند. برای بهینه‌سازی جداسازی، می‌توان از محلول‌های آبی با مقدار pH معین، به ویژه محلول‌های بافر، و همچنین افزودنی‌های مختلف به فاز متحرک استفاده کرد: اسیدهای فسفریک و استیک هنگام جداسازی ترکیبات اسیدی. آمونیاک و آمین های آلیفاتیک هنگام جداسازی ترکیبات اساسی و سایر اصلاح کننده ها.

تجزیه و تحلیل کروماتوگرافی تا حد زیادی تحت تأثیر خلوص فاز متحرک است، بنابراین ترجیح داده می شود از حلال های تولید شده به طور خاص برای کروماتوگرافی مایع (از جمله آب) استفاده شود.

هنگام استفاده از آشکارساز اسپکتروفتومتری UV، فاز متحرک نباید جذب قابل توجهی در طول موج انتخاب شده برای تشخیص داشته باشد. حد شفافیت یا چگالی نوری در طول موج مشخصی از یک سازنده حلال خاص اغلب بر روی بسته بندی نشان داده می شود.

فاز متحرک و محلول های آنالیز شده نباید حاوی ذرات حل نشده و حباب های گاز باشد. آب به دست آمده در شرایط آزمایشگاهی، محلول های آبی، حلال های آلی از پیش مخلوط شده با آب و همچنین محلول های تجزیه شده باید تحت فیلتراسیون و گاززدایی قرار گیرند. برای این منظور، فیلتراسیون خلاء معمولاً از طریق یک فیلتر غشایی با اندازه منافذ 0.45 میکرومتر، نسبت به حلال یا محلول معین بی اثر است.

فهرست شرایط کروماتوگرافی که باید مشخص شود

مونوگراف فارماکوپه باید شامل: نام تجاری کامل ستون با نشان‌دهنده سازنده و شماره کاتالوگ، ابعاد ستون (طول و قطر داخلی)، نوع جاذب نشان‌دهنده اندازه ذرات، اندازه منافذ، دمای ستون (در صورت وجود ترموستات) باشد. لازم است)، حجم نمونه تزریق شده (حلقه های حجمی)، ترکیب فاز متحرک و روش تهیه آن، نرخ تغذیه فاز متحرک، نوع آشکارساز و شرایط تشخیص (در صورت لزوم، پارامترهای سلول آشکارساز مورد استفاده)، شرح حالت گرادیان (در صورت استفاده)، شامل مرحله تعادل مجدد با شرایط اولیه، زمان کروماتوگرافی، شرح دقیق روش محاسبه و فرمول، شرح آماده سازی محلول های استاندارد و آزمایشی.

اگر از مشتق سازی پیش ستونی در نمونه گیری خودکار استفاده شود، اطلاعاتی در مورد برنامه نمونه برداری خودکار ارائه می شود. اگر از مشتق‌سازی پس از ستون استفاده شود، نرخ خوراک معرف مشتق‌کننده، حجم حلقه اختلاط و دمای آن نشان داده می‌شود.

انواع اصلاح شده کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا

کروماتوگرافی جفت یونی

یکی از انواع کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا فاز معکوس، کروماتوگرافی جفت یونی است که امکان تعیین ترکیبات یونیزه را فراهم می کند. برای انجام این کار، ترکیبات آلی آبگریز با گروه‌های یونی (معرف‌های جفت یونی) به فاز متحرک کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا فاز معکوس اضافه می‌شوند. معمولاً از آلکیل سولفات های سدیم برای جداسازی بازها استفاده می شود؛ نمک های تترا آلکیلامونیوم (تترا بوتیل آمونیوم فسفات، ستیل تری متیل آمونیوم برومید و غیره) برای جداسازی اسیدها استفاده می شوند. در حالت جفت یونی، گزینش پذیری جداسازی اجزای غیریونی توسط مکانیسم حفظ فاز معکوس محدود می شود و حفظ بازها و اسیدها به طور قابل توجهی افزایش می یابد، در حالی که شکل پیک های کروماتوگرافی بهبود می یابد.

حفظ در حالت جفت یون به دلیل فرآیندهای نسبتاً پیچیده تعادلی است که با یکدیگر رقابت می کنند. از یک طرف به دلیل فعل و انفعالات آبگریز و اثر جابجایی محیط قطبی فاز متحرک، جذب یون های آبگریز در سطح ژل آلکیل سیلیس به گونه ای امکان پذیر است که گروه های باردار با فاز متحرک روبرو شوند. در این حالت، سطح خواص تبادل یونی را به دست می آورد و احتباس از قوانین کروماتوگرافی تبادل یونی پیروی می کند. از سوی دیگر، امکان تشکیل یک جفت یونی به طور مستقیم در حجم مایع شوینده و به دنبال آن جذب آن بر روی جاذب طبق مکانیسم فاز معکوس وجود دارد.

کروماتوگرافی برهمکنش هیدروفیل ( HILIC کروماتوگرافی)

کروماتوگرافی برهمکنش آبدوست برای جداسازی ترکیبات قطبی که در کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا فاز معکوس ضعیف باقی می مانند استفاده می شود. در این نسخه از کروماتوگرافی، مخلوط آب- استونیتریل با افزودن نمک، اسید یا باز به عنوان فاز متحرک استفاده می شود. فازهای ثابت، به عنوان یک قاعده، ژل های سیلیکا اصلاح شده با گروه های قطبی (آمینو، دیول، گروه های سیانوپروپیل و غیره) هستند. ترکیبات قطبی بیشتر قوی تر نگه داشته می شوند. توانایی شستشوی فاز متحرک با افزایش قطبیت افزایش می یابد.

تبادل یونی و کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا

کروماتوگرافی تبادل یونی برای تجزیه و تحلیل ترکیبات آلی (بازهای هتروسیکلیک، اسیدهای آمینه، پروتئین ها و غیره) و غیر آلی (کاتیون ها و آنیون های مختلف) استفاده می شود. جداسازی اجزای مخلوط مورد تجزیه و تحلیل در کروماتوگرافی تبادل یونی بر اساس برهمکنش برگشت پذیر یون های مواد مورد تجزیه و تحلیل با گروه های تبادل یونی جاذب است. این جاذب ها عمدتاً یا رزین های تبادل یونی پلیمری (معمولاً کوپلیمرهای استایرن و دی وینیل بنزن با گروه های تبادل یونی پیوندی) یا ژل های سیلیکا با گروه های تبادل یونی پیوندی هستند. جاذب هایی با گروه های: -NH 3 +، -R 3 N +، -R 2 HN +، -RH 2 N + و غیره برای جداسازی آنیون ها (مبدل های آنیونی) و جاذب هایی با گروه های: -SO 3 -، - استفاده می شوند. RSO 3 – , –COOH, -PO 3 – و سایرین برای جداسازی کاتیونها (مبدل کاتیونی).

محلول های آبی اسیدها، بازها و نمک ها به عنوان فاز متحرک در کروماتوگرافی تبادل یونی استفاده می شوند. به طور معمول، از محلول های بافر برای حفظ مقادیر خاص pH استفاده می شود. همچنین می توان از افزودنی های کوچک حلال های آلی قابل امتزاج با آب - استونیتریل، متانول، اتانول، تتراهیدروفوران استفاده کرد.

کروماتوگرافی یونی - یک نوع کروماتوگرافی تبادل یونی که در آن از آشکارساز هدایت سنجی برای تشخیص ترکیبات (یون ها) در حال تعیین استفاده می شود. برای تعیین بسیار حساس تغییرات در هدایت الکتریکی فاز متحرک که از آشکارساز عبور می کند، هدایت الکتریکی پس زمینه فاز متحرک باید کم باشد.

دو نوع اصلی کروماتوگرافی یونی وجود دارد.

اولین آنها، کروماتوگرافی یونی دو ستونی، مبتنی بر سرکوب رسانایی الکتریکی الکترولیت فاز متحرک با استفاده از یک ستون تبادل یونی دوم یا یک سیستم سرکوب غشایی خاص است که بین ستون تحلیلی و آشکارساز قرار دارد. با عبور از سیستم، هدایت الکتریکی فاز متحرک کاهش می یابد.

دومین نوع کروماتوگرافی یونی، کروماتوگرافی یونی تک ستونی است. این گزینه از فاز متحرک با رسانایی الکتریکی بسیار کم استفاده می کند. اسیدهای آلی ضعیف به طور گسترده ای به عنوان الکترولیت استفاده می شوند: بنزوئیک، سالیسیلیک یا ایزوفتالیک.

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا با حذف اندازه

کروماتوگرافی حذف اندازه (ژل کروماتوگرافی) نسخه ویژه ای از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا بر اساس جداسازی مولکول ها بر اساس اندازه آنها است. توزیع مولکول ها بین فاز ثابت و متحرک بر اساس اندازه مولکول ها و تا حدی بر اساس شکل و قطبیت آنها است.

دو نوع محدود کننده برهمکنش مولکول ها با فاز ثابت متخلخل امکان پذیر است. مولکول های بزرگتر از حداکثر قطر منافذ به هیچ وجه حفظ نمی شوند و ابتدا شسته می شوند و همزمان با فاز متحرک حرکت می کنند. مولکول هایی با اندازه های کوچکتر از حداقل قطر منافذ جاذب آزادانه به منافذ نفوذ می کنند و آخرین مولکول هایی هستند که از ستون شسته می شوند. مولکول‌های باقی‌مانده، با اندازه‌های متوسط، تا حدی در منافذ باقی می‌مانند و در حین شستشو، مطابق با اندازه‌هایشان به بخش‌هایی تقسیم می‌شوند و تا حدی بسته به اندازه و تا حدی بسته به شکل آنها به داخل منافذ جاذب نفوذ می‌کنند. در نتیجه، مواد با زمان های نگهداری متفاوت شسته می شوند.

کروماتوگرافی حذف یون

مکانیسم کروماتوگرافی حذف یون بر اساس اثری است که در نتیجه آن ترکیبات به شکل یونیزه روی جاذب تبادل یونی باقی نمی مانند، در حالی که ترکیبات به شکل مولکولی بین فازهای ثابت و آبی در داخل منافذ جاذب تبادل یونی توزیع می شوند. و فاز متحرک در حال مهاجرت در فضای بین ذرات جاذب. جداسازی بر اساس دافعه الکترواستاتیک، برهمکنش های قطبی و آبگریز بین ترکیبات محلول و جاذب است.

گروه های آنیونی روی سطح جاذب به عنوان یک "غشاء" نیمه تراوا بین فاز ثابت و متحرک عمل می کنند. اجزای دارای بار منفی به فاز متحرک ثابت نمی رسند، زیرا توسط گروه های عملکردی با بار مشابه دفع می شوند و در حجم "مرده" (آزاد) ستون شسته می شوند. اجزاء به شکل مولکولی توسط جاذب تبادل کاتیونی "رد" نمی شوند و بین فازهای ثابت و متحرک توزیع می شوند. تفاوت در درجه نگهداری اجزای غیریونی مخلوط با ترکیبی از برهمکنش های قطبی اجزای غیریونی با گروه های عاملی جاذب تبادل کاتیونی و برهمکنش های آبگریز اجزای غیریونی با ماتریس جاذب غیر قطبی دیکته می شود.

کروماتوگرافی کایرال

هدف کروماتوگرافی کایرال جداسازی ایزومرهای نوری است. جداسازی ها بر روی فازهای ثابت کایرال یا در فازهای ثابت غیر معمولی با استفاده از فازهای متحرک کایرال انجام می شود. به عنوان فازهای ثابت کایرال، جاذب هایی با سطح اصلاح شده، گروه ها یا مواد دارای مراکز کایرال (کیتوسان ها، سیکلودکسترین ها، پلی ساکاریدها، پروتئین ها و غیره (انتخاب کننده های کایرال) استفاده می شود. کروماتوگرافی فازی: هنگام استفاده از فازهای ثابت غیر کایرال، برای اطمینان از جداسازی انانتیومرها، اصلاح کننده های کایرال به فازهای متحرک اضافه می شوند: کمپلکس های فلزی کایرال، لیگاندهای کایرال خنثی، معرف های جفت یون کایرال و غیره.

کروماتوگرافی مایع با عملکرد فوق العاده

کروماتوگرافی مایع با عملکرد فوق العاده، نوعی از کروماتوگرافی مایع است که کارآمدتر از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا کلاسیک است.

یکی از ویژگی های کروماتوگرافی مایع با عملکرد فوق العاده، استفاده از جاذب هایی با اندازه ذرات از 1.5 تا 2 میکرون است. اندازه ستون کروماتوگرافی معمولاً بین 50 تا 150 میلی متر طول و 1 تا 4 میلی متر در قطر متغیر است. حجم نمونه تزریق شده می تواند بین 1 تا 50 میکرولیتر باشد. استفاده از چنین ستون های کروماتوگرافی می تواند زمان تجزیه و تحلیل را به میزان قابل توجهی کاهش دهد و کارایی جداسازی کروماتوگرافی را افزایش دهد. با این حال، در این حالت، فشار روی ستون می تواند به 80-120 مگاپاسکال برسد، فرکانس مورد نیاز جمع آوری داده های آشکارساز می تواند به 40-100 هرتز افزایش یابد و حجم خارج ستونی سیستم کروماتوگرافی باید به حداقل برسد. تجهیزات کروماتوگرافی و ستون‌های مورد استفاده در کروماتوگرافی مایع با عملکرد فوق‌العاده به‌طور ویژه برای پاسخگویی به الزامات این نوع کروماتوگرافی تنظیم شده‌اند.

تجهیزات طراحی شده برای کروماتوگرافی مایع با عملکرد فوق العاده نیز می توانند در نسخه کلاسیک کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا استفاده شوند.

9885 0

HPLC یک کروماتوگرافی ستونی مایع است که در آن می توان از مکانیسم های مختلف جذب استفاده کرد. در اصل، HPLC شکل مدرن کروماتوگرافی ستونی مایع کلاسیک است. برخی از مهم ترین ویژگی های کیفی HPLC در زیر ذکر شده است:
- سرعت بالای فرآیند، که باعث می شود مدت زمان جداسازی از چند ساعت و روز به دقیقه کاهش یابد.
- حداقل درجه تاری مناطق کروماتوگرافی، که امکان جداسازی ترکیباتی را فراهم می کند که فقط کمی در ثابت جذب متفاوت هستند.
- درجه بالایی از مکانیزاسیون و اتوماسیون جداسازی و پردازش اطلاعات که به لطف آن کروماتوگرافی مایع ستونی به سطح جدیدی از تکرارپذیری و دقت رسیده است.

تحقیقات فشرده در دهه های اخیر و حجم عظیمی از داده های تجربی انباشته شده اکنون به ما اجازه می دهد تا در مورد طبقه بندی انواع در چارچوب روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا صحبت کنیم. البته، طبقه بندی با توجه به مکانیسم جذب ارائه شده در بالا همچنان معتبر است.

یک طبقه بندی رایج بر اساس قطبیت مقایسه ای فازهای متحرک و ثابت است. در این حالت بین کروماتوگرافی فاز عادی و معکوس تمایز قائل می شود.

کروماتوگرافی فاز نرمال (NPC) گونه ای از HPLC است که در آن فاز متحرک قطبی کمتری نسبت به فاز ساکن است و دلیلی وجود دارد که باور کنیم عامل اصلی تعیین کننده احتباس، برهمکنش سوربات ها به طور مستقیم با سطح یا حجم جاذب است.

کروماتوگرافی فاز معکوس (RPC) گونه‌ای از HPLC است که در آن فاز متحرک قطبی‌تر از فاز ساکن است و احتباس با تماس مستقیم مولکول‌های سوربات با سطح یا حجم جاذب تعیین می‌شود. در این حالت، سوربات های یونیزه شده با یون های فاز متحرک جذب شده روی سطح مبادله نمی شوند.

کروماتوگرافی تبادل یونی گزینه ای است که در آن جذب با تبادل یون های جذب شده فاز متحرک با یون های مواد کروماتوگرافی انجام می شود. کروماتوگرافی تبادل لیگاند را می توان به روشی کاملا مشابه تعریف کرد.

کروماتوگرافی بر روی جاذب های اصلاح شده دینامیکی نوعی از HPLC است که در آن سوربات به طور مستقیم با سطح جاذب برهمکنش نمی کند، اما با مولکول های لایه های سطحی مایع شوینده ارتباط برقرار می کند.
کروماتوگرافی جفت یونی یک نوع کروماتوگرافی فاز معکوس ترکیبات یونیزه است که در آن یک ضد یون آبگریز به فاز متحرک اضافه می شود که به طور کیفی ویژگی های جذب سیستم را تغییر می دهد.

کروماتوگرافی حذف اندازه روشی برای جداسازی ترکیبات بر اساس وزن مولکولی آنها است که بر اساس تفاوت در سرعت انتشار مولکول های با اندازه های مختلف در منافذ فاز ساکن است.

برای HPLC، یک ویژگی بسیار مهم اندازه جاذب ها است، معمولاً 3-5 میکرون، در حال حاضر تا 1.8 میکرون است. این اجازه می دهد تا مخلوط های پیچیده از مواد به سرعت و به طور کامل جدا شوند (زمان تجزیه و تحلیل متوسط ​​از 3 تا 30 دقیقه).

مشکل جداسازی با استفاده از یک ستون کروماتوگرافی که یک لوله پر از جاذب است حل می شود. هنگام انجام تجزیه و تحلیل، یک مایع (شوینده) از یک ترکیب خاص از طریق یک ستون کروماتوگرافی با سرعت ثابت تغذیه می شود. دوز دقیق اندازه گیری شده از نمونه به این جریان تزریق می شود. اجزای یک نمونه وارد شده به یک ستون کروماتوگرافی به دلیل تمایلات متفاوتی که با جاذب ستون دارند، با سرعت های مختلف در امتداد آن حرکت می کنند و در زمان های مختلف به طور متوالی به آشکارساز می رسند.

بنابراین، ستون کروماتوگرافی وظیفه انتخاب و کارایی جداسازی اجزا را بر عهده دارد. با انتخاب انواع مختلف ستون ها می توان میزان جدایی آنالیت ها را کنترل کرد. ترکیبات از طریق زمان نگهداری آنها شناسایی می شوند. تعیین کمی هر یک از مولفه ها بر اساس بزرگی سیگنال تحلیلی اندازه گیری شده با استفاده از آشکارساز متصل به خروجی ستون کروماتوگرافی محاسبه می شود.

جاذب ها توسعه HPLC تا حد زیادی با ایجاد نسل های جدید جاذب ها با خواص جنبشی خوب و خواص ترمودینامیکی متنوع همراه است. ماده اصلی جاذب در HPLC سیلیکا ژل است. از نظر مکانیکی قوی است و دارای تخلخل قابل توجهی است که ظرفیت تبادل زیادی با اندازه ستون های کوچک می دهد. رایج ترین اندازه ذرات 5-10 میکرون است. هرچه به شکل کروی ذرات نزدیک‌تر باشد، مقاومت جریان پایین‌تر، بازده بالاتر خواهد بود، به‌ویژه اگر کسر بسیار باریکی از آن جدا شود (مثلاً 7 +1 میکرون).

سطح مخصوص سیلیکاژل 10-600 متر بر گرم است. ژل سیلیکا را می توان با گروه های شیمیایی مختلف پیوند شده به سطح (C-18، CN، NH2، SO3H) اصلاح کرد که امکان استفاده از جاذب های مبتنی بر آن را برای جداسازی طیف گسترده ای از کلاس های ترکیبات فراهم می کند. عیب اصلی سیلیکاژل مقاومت شیمیایی پایین آن در pH است< 2 и рН >9 (سیلیس در قلیاها و اسیدها حل می شود). بنابراین، در حال حاضر جستجوی فشرده برای جاذب های مبتنی بر پلیمرهایی وجود دارد که در pH از 1 تا 14 پایدار هستند، به عنوان مثال، بر اساس پلی متیل متاکریلات، پلی استایرن و غیره.

جاذب برای کروماتوگرافی تبادل یونی با توجه به ویژگی های جداسازی (در محیط اسیدی یا قلیایی)، ماده اصلی به پلی استایرن با دی وینیل بنزن با درجات مختلف پیوند متقابل با SO3 -H+ (مبدل کاتیونی اسیدی قوی) یا -COO-Naf (کاتیون اسیدی ضعیف) جذب می شود. مبدل‌ها)، گروه‌های -H2N+ (CH3) به سطح آنها 3Cl- (مبدل‌کننده‌های آنیونی پایه قوی) یا -N+HR2Cl- (مبدل‌های آنیونی پایه ضعیف) پیوند زدند.

جاذب برای کروماتوگرافی نفوذ ژل. نوع اصلی آن استایرن-DVB است. شیشه های ماکرو متخلخل، متیل متاکریلات و سیلیکاژل نیز استفاده می شود. از همان جاذب ها برای کروماتوگرافی رد یون استفاده می شود.
پمپ ها برای اطمینان از جریان فاز متحرک (MP) از طریق ستون با پارامترهای مشخص شده، از پمپ های فشار قوی استفاده می شود. مهمترین مشخصات فنی پمپ های LC عبارتند از: محدوده جریان; حداکثر فشار کاری؛ تکرارپذیری جریان؛ محدوده ضربان عرضه حلال

بسته به ماهیت تامین حلال، پمپ ها می توانند دارای منبع (جریان) ثابت و فشار ثابت باشند. اصولاً در حین کار تحلیلی از حالت دبی ثابت و هنگام پرکردن ستون ها از حالت فشار ثابت استفاده می شود. بر اساس اصل عملکرد، پمپ ها به پمپ های سرنگی و پمپ های پیستونی رفت و برگشتی تقسیم می شوند.

پمپ های سرنگ. پمپ های این نوع با عدم وجود تقریباً کامل ضربان در جریان فاز متحرک در حین کار مشخص می شوند. معایب پمپ: الف) مصرف زیاد زمان و حلال برای شستشو هنگام تعویض حلال. ب) تعلیق جداسازی در حین پر کردن پمپ. ج) ابعاد و وزن زیاد در عین حصول اطمینان از جریان و فشار زیاد (به یک موتور قدرتمند و نیروی پیستونی زیاد با مساحت زیاد آن نیاز است).

پمپ های پیستونی رفت و برگشتی. پمپ های این نوع یک منبع حجمی ثابت فاز متحرک را برای مدت طولانی فراهم می کنند. حداکثر فشار کاری 300-500 اتمسفر، دبی 0.01-10 میلی لیتر در دقیقه. تکرارپذیری جریان حجمی 0.5٪ است. نقطه ضعف اصلی این است که حلال به صورت یک سری پالس های متوالی به سیستم عرضه می شود، بنابراین ضربان های فشار و جریان وجود دارد.

این دلیل اصلی افزایش نویز و کاهش حساسیت تقریباً تمام آشکارسازهای مورد استفاده در LC، به ویژه آنهایی است که الکتروشیمیایی استفاده می کنند. راه‌های مبارزه با ضربان‌ها: استفاده از پمپ‌های دوبل یا پمپ بگ لای دو پلانجر، با استفاده از دستگاه‌های میرایی و وسایل الکترونیکی.

مقدار تغذیه حجمی توسط سه پارامتر تعیین می شود: قطر پیستون (معمولاً 3.13؛ 5.0؛ 7.0 میلی متر)، دامنه آن (12-18 میلی متر) و فرکانس (که به سرعت چرخش موتور و گیربکس بستگی دارد).

دیسپنسرها. هدف دیسپنسر انتقال نمونه در فشار اتمسفر به ورودی ستون با فشار تا چند اتمسفر است. مهم است که هیچ حجم "مرده" در دیسپنسر وجود نداشته باشد که توسط فاز متحرک قابل شستشو نباشد و در طول دوز کردن نمونه فرسایشی نداشته باشد. در ابتدا، دیسپنسرهای LC مشابه تلگراف‌های گاز با سوراخ شدن غشاء بودند. با این حال، غشاها بیش از 50-100 اتمسفر را تحمل نمی کنند، مقاومت شیمیایی آنها کافی نیست، قطعات آنها فیلترهای ستون و مویرگ ها را آلوده می کنند.

فاز مایع سرعت انتشار بسیار کمتری نسبت به فاز گاز دارد. بنابراین، می توانید با متوقف کردن جریان دوز کنید - نمونه زمان برای فرسایش در تلگراف را ندارد. در حالی که نمونه در حال وارد شدن به دیسپنسر است، یک شیر مخصوص جریان حلال را قطع می کند. فشار در ورودی به ستون به سرعت کاهش می یابد؛ پس از چند ثانیه، نمونه را می توان با یک میکروسرنگ معمولی به محفظه توزیع کننده تزریق کرد. بعد، تلگراف قفل می شود، جریان حلال روشن می شود و جداسازی اتفاق می افتد.

فشاری که این شیر تحمل می کند تا 500-800 اتمسفر است. اما هنگامی که جریان متوقف می شود، تعادل در ستون مختل می شود، که می تواند منجر به ظهور قله های اضافی "خالی" شود.

دیسپنسرهای حلقه ای بیشترین استفاده را دارند. هنگامی که دیسپنسر پر می شود، ورودی های 1، 2 و کانال بین آنها تحت فشار بالا هستند. ورودی های 3-6، کانال های بین آنها و حلقه دوز تحت فشار اتمسفر هستند، که به شما امکان می دهد حلقه را با استفاده از سرنگ یا پمپ پر کنید. هنگامی که دیسپنسر چرخانده می شود، جریان فاز متحرک نمونه را به ستون جابجا می کند. برای کاهش خطا، حلقه با حجم نمونه 5-10 برابر شسته می شود. اگر نمونه کوچک باشد، می توان آن را با میکروسرنگ به حلقه تزریق کرد. حجم حلقه معمولاً 5-50 µl است.

در. وینوف، تی.جی. ولووا

معرفی.

توسعه سریع کروماتوگرافی مایع در 10 سال گذشته عمدتاً به دلیل توسعه فشرده مبانی نظری و استفاده عملی از نسخه بسیار مؤثر آن و همچنین ایجاد و تولید صنعتی جاذب ها و تجهیزات لازم است.

یکی از ویژگی های متمایز کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) استفاده از جاذب هایی با اندازه دانه 3-10 میکرون است که انتقال سریع جرم با راندمان جداسازی بسیار بالا را تضمین می کند.

در حال حاضر، HPLC از نظر نرخ توسعه، حتی از کروماتوگرافی گازی پیشی گرفته است، در بین روش های ابزاری مقام اول را به خود اختصاص داده است. مهمترین مزیت HPLC در مقایسه با کروماتوگرافی گازی، توانایی مطالعه تقریباً هر جسمی بدون هیچ گونه محدودیتی در خواص فیزیکوشیمیایی آنها، به عنوان مثال، نقطه جوش یا وزن مولکولی است.

امروزه HPLC یک روش ابزاری با طراحی خوب است که به طور گسترده در زمینه های مختلف علم و فناوری استفاده می شود. اهمیت آن به ویژه در زمینه های حیاتی مانند بیوشیمی، زیست شناسی مولکولی، کنترل آلودگی محیط زیست و همچنین در صنایع شیمیایی، پتروشیمی، غذایی و دارویی بسیار زیاد است.

از آنجایی که با توجه به ویژگی‌های متدولوژی زیر لازم است تعدادی از الزامات بسیار خاص در نظر گرفته شود.

آ. ستون های HPLC با رسانه های قطر ذرات بسیار کوچک بسته بندی شده اند. در نتیجه، در سرعت های حجمی حلال مورد نیاز برای جداسازی سریع نمونه، فشار بالایی بر روی ستون ایجاد می شود.

ب آشکارسازهای مورد استفاده در HPLC به نوسانات جریان و فشار مایع شوینده (نویز) حساس هستند. علاوه بر این، هنگام استفاده از آشکارسازهای غلظت، حتی پایداری بالاتری از سرعت حجمی مایع شوینده مورد نیاز است.

V. فرآیند جداسازی کروماتوگرافی با تعدادی اثرات متضاد همراه است، به عنوان مثال، پراکندگی نمونه در فاز متحرک منجر به مخلوط شدن اجزای جدا شده و کاهش حداکثر غلظت ماده در پیک شسته شده (در آشکارساز) می شود. پراکندگی در تمام مناطق سیستم از نقطه تزریق نمونه تا آشکارساز مشاهده می شود.

د- حلال هایی که به عنوان یک فاز متحرک عمل می کنند اغلب می توانند باعث خوردگی تجهیزات شوند. این در درجه اول برای حلال های مورد استفاده در کروماتوگرافی فاز معکوس، که در کاربردهای HPLC بیوشیمیایی ترجیح داده می شود، اعمال می شود.

ویژگی های HPLC به عنوان یک تکنیک ابزاری باید در طول توسعه، ایجاد و بهره برداری از این سیستم ها در نظر گرفته شود. بیش از ده سال جستجو و تحقیق برای ایجاد نمونه های تجاری از سیستم های کروماتوگرافی و اجزای آنها که به اندازه کافی قابل اعتماد، ساده و ایمن برای کار با نسبت قابل قبولی بین قیمت و مشخصات فنی باشند، طول کشید. گرایش‌های اخیر به سمت کاهش ستون‌ها (هم طول و هم قطر) نیازهای جدیدی را برای ابزارها ایجاد می‌کند.

1.1. بهره وریوگزینش پذیری

کروماتوگرافی روشی برای جداسازی اجزای یک مخلوط بر اساس تفاوت توزیع تعادل آنها بین دو فاز غیرقابل اختلاط است که یکی ساکن و دیگری متحرک است. فاز متحرک و زمانی که در فاز ساکن هستند در جای خود باقی می مانند. با توجه به تفاوت در میل ترکیبی اجزای مخلوط برای فازهای ثابت و متحرک، هدف اصلی کروماتوگرافی به دست آمده است - جداسازی یک دوره زمانی قابل قبول از مخلوط به نوارهای جداگانه (پیک) اجزا در حین حرکت در امتداد آنها. ستون با فاز متحرک.

از این مفاهیم کلی، مشخص می شود که جداسازی کروماتوگرافی تنها در صورتی امکان پذیر است که اجزای نمونه که در هنگام معرفی نمونه وارد ستون می شوند، اولاً در فاز متحرک حل شده و ثانیاً با فاز ساکن برهم کنش (حفظ) داشته باشند. . اگر در هنگام معرفی نمونه، هر یک از اجزاء به صورت محلول نباشد، فیلتر می شود و در فرآیند کروماتوگرافی شرکت نمی کند. به همین ترتیب، اجزایی که با فاز ساکن برهمکنش ندارند، بدون جدا شدن به اجزای خود، از ستون با فاز متحرک عبور می کنند.

اجازه دهید این شرط را بپذیریم که برخی از دو جزء در فاز متحرک محلول هستند و با فاز ساکن تعامل دارند، یعنی فرآیند کرویاتوگرافی می‌تواند بدون اختلال پیش برود. در این صورت، پس از عبور مخلوط از ستون، می توانید کروماتوگرام های فرم را بدست آورید الف، بیا V(شکل 1.1). این کروماتوگرام ها جداسازی های کروماتوگرافی را نشان می دهند که از نظر کارایی متفاوت هستند. (آو ب) با گزینش پذیری و گزینش پذیری برابر (بو V)با کارایی یکسان

هر چه پیک به دست آمده در همان زمان نگهداری باریکتر باشد، بازده ستون بالاتر است. کارایی ستون با تعداد صفحات نظری (NPT) اندازه گیری می شود. ن: بازده بالاتر

برنج. 1.2. پارامترهای پیک کروماتوگرافی و محاسبه تعداد صفحات نظری:

تی آر - زمان نگهداری اوج ساعت - ارتفاع قله؛ Wj/j - عرض قله در نصف ارتفاع آن

برنج. 1.1. نوع کروماتوگرام بسته به کارایی و انتخابی ستون:

آ- گزینش پذیری معمولی، کاهش بهره وری (صفحات نظری کمتر)؛ ب - گزینش پذیری و کارایی معمول؛ V -راندمان طبیعی، افزایش گزینش پذیری (نسبت بیشتر زمان نگهداری اجزا)

بازده، هرچه FTT بیشتر باشد، پهن شدن قله باند باریک اولیه در هنگام عبور از ستون کوچکتر و قله در خروجی ستون باریکتر است. PTT تعداد مراحل برقراری تعادل بین فازهای متحرک و ثابت را مشخص می کند.

دانستن تعداد صفحات نظری در هر ستون و طول ستون L (μm)، و همچنین میانگین قطر دانه جاذب د ج (μm)، به راحتی می توان مقادیر ارتفاع معادل یک صفحه نظری (HETT) و همچنین ارتفاع کاهش یافته معادل یک صفحه نظری (RHETT) را بدست آورد:

شرط = L/ ن

PVETT =B3TT/d c.

با داشتن مقادیر FTT، HETT و PHETT، به راحتی می توان کارایی ستون هایی با انواع مختلف، طول های مختلف، پر از جاذب هایی با ماهیت و دانه بندی متفاوت را مقایسه کرد. با مقایسه PTT دو ستون با طول یکسان، کارایی آنها مقایسه می شود. هنگام مقایسه HETP، ستون هایی با جاذب هایی با اندازه دانه یکسان و طول های مختلف مقایسه می شوند. در نهایت، مقدار PVETT به هر دو ستون اجازه می دهد تا کیفیت جاذب را اولاً و کیفیت پر کردن ستون ها را ارزیابی کند و ثانیاً بدون در نظر گرفتن طول ستون ها، دانه بندی مواد جاذب ماهیت آن را ارزیابی کند.

انتخاب پذیری ستون نقش زیادی در دستیابی به جداسازی کروماتوگرافی دارد.

گزینش پذیری یک ستون به عوامل زیادی بستگی دارد و مهارت آزمایشگر تا حد زیادی با توانایی تأثیرگذاری بر گزینش جداسازی تعیین می شود. برای این کار، سه عامل بسیار مهم در دست کروماتوگراف است: انتخاب ماهیت شیمیایی جاذب، انتخاب ترکیب حلال و اصلاح کننده های آن، و در نظر گرفتن ساختار شیمیایی و خواص اجزای جدا شده. . گاهی اوقات تغییر دمای ستون که ضرایب توزیع مواد بین فاز متحرک و ثابت را تغییر می دهد، تأثیر محسوسی بر انتخاب پذیری دارد.

هنگام در نظر گرفتن و ارزیابی جداسازی دو جزء در کروماتوگرام، وضوح یک پارامتر مهم است. R s, که زمان های خروجی و عرض پیک هر دو جزء جدا شده را مرتبط می کند

وضوح به عنوان پارامتری که جداسازی اوج را مشخص می‌کند، با افزایش گزینش‌پذیری افزایش می‌یابد که با افزایش شمارنده منعکس می‌شود، و بازده افزایش می‌یابد که با کاهش مقدار مخرج به دلیل کاهش عرض قله‌ها منعکس می‌شود. بنابراین، پیشرفت سریع کروماتوگرافی مایع منجر به تغییر مفهوم "کروماتوگرافی مایع با فشار بالا" شد - "کروماتوگرافی مایع با وضوح بالا" جایگزین آن شد (در حالی که شکل اختصاری این اصطلاح در انگلیسی حفظ شد. HPLC به عنوان صحیح ترین مشخص کننده جهت توسعه کروماتوگرافی مایع مدرن).

بنابراین، شستشوی ستون کاهش می‌یابد و کارایی افزایش می‌یابد زمانی که از جاذب ریزتر استفاده می‌شود، ترکیب یکنواخت‌تر (کسری باریک)، فشرده‌تر و یکنواخت‌تر در ستون، با استفاده از لایه‌های فاز پیوند نازک‌تر، حلال‌های ویسکوز کمتر و نرخ جریان بهینه.

با این حال، همراه با محو شدن نوار ناحیه کروماتوگرافی در طول فرآیند جداسازی در ستون، می توان آن را در دستگاه برای معرفی نمونه، در انژکتور مویرگ های اتصال - ستون و ستون - آشکارساز، در سلول آشکارساز و در برخی از دستگاه های کمکی (میکروفیلتر برای به دام انداختن ذرات مکانیکی از نمونه های نصب شده بعد از انژکتور، پیش ستون ها، راکتورهای سیم پیچ و غیره) - هر چه حجم اضافی ستون در مقایسه با حجم حفظ شده پیک بیشتر باشد، فرسایش بیشتر می شود. همچنین مهم است که حجم مرده کجا قرار دارد: هر چه سیگنال کروماتوگرافی باریکتر باشد، تار شدن حجم مرده بیشتر است. بنابراین، باید به طراحی آن قسمت از کروماتوگرافی که ناحیه کروماتوگرافی باریک ترین است (انژکتور و دستگاه ها از انژکتور تا ستون) توجه ویژه ای شود - در اینجا فرسایش اضافی ستون خطرناک ترین است و بیشترین تأثیر را دارد. اگرچه اعتقاد بر این است که در کروماتوگراف هایی که به خوبی طراحی شده اند، منابع رقت اضافی اضافی ستون باید به حداقل کاهش یابد، با این وجود، هر دستگاه جدید، هر اصلاح کروماتوگراف لزوماً باید با آزمایش روی یک ستون و مقایسه کروماتوگرام حاصل خاتمه یابد. با پاسپورت یکی اگر اعوجاج پیک یا کاهش شدید راندمان مشاهده شد، مویرگ ها و سایر وسایلی که به تازگی وارد سیستم شده اند باید به دقت بررسی شوند.

شستشوی خارج از ستون و قضاوت نادرست آن می تواند منجر به کاهش قابل توجه (بیش از 50٪) کارایی شود، به ویژه در مواردی که کروماتوگراف های نسبتاً قدیمی برای HPLC پرسرعت، HPLC ریز ستونی و سایر انواع HPLC مدرن که نیاز به استفاده دارند، استفاده می شود. میکرو انژکتورها، مویرگ های اتصال داخلی با قطر حداقل 0.05-0.15 میلی متر، ستون هایی با ظرفیت 10-1000 میکرولیتر، آشکارسازهای با میکروکووت با ظرفیت 0.03-1 میکرولیتر و با سرعت بالا، ضبط کننده ها و انتگرال های پرسرعت. .

1.2. حفظ و استحکام حلال

برای اینکه آنالیت ها روی ستون جدا شوند، همانطور که در بالا ذکر شد، ضریب ظرفیت ک" باید بیشتر از 0 باشد، یعنی مواد باید توسط فاز ساکن، جاذب، حفظ شوند. با این حال، ضریب ظرفیت نباید خیلی زیاد باشد تا زمان شستشوی قابل قبولی به دست آید. اگر برای مخلوط معینی از مواد، فاز ثابتی انتخاب شود که آنها را حفظ کند، کار بیشتر روی توسعه یک تکنیک تجزیه و تحلیل شامل انتخاب حلالی است که به طور ایده‌آل برای همه اجزا متفاوت است، اما به طور قابل قبولی خیلی بزرگ نیست. ک". این با تغییر قدرت شستشوی حلال به دست می آید.

در مورد کروماتوگرافی جذب روی سیلیکاژل یا اکسید آلومینیوم، به عنوان یک قاعده، قدرت یک حلال دو جزئی (به عنوان مثال، هگزان با افزودن ایزوپروپانول) با افزایش محتوای جزء قطبی (ایزوپروپانول) افزایش می یابد. یا با کاهش محتوای ایزوپروپانول کاهش می یابد. اگر جزء قطبی حاوی بیش از حد کوچک شود (کمتر از 0.1٪)، باید با نیروی شستشو ضعیف تری جایگزین شود. همین کار انجام می شود و اجزای قطبی یا غیرقطبی را با اجزای دیگر جایگزین می کنند، حتی اگر این سیستم گزینش پذیری مورد نظر را با توجه به اجزای مورد نظر در مخلوط فراهم نکند. هنگام انتخاب سیستم های حلال، هم حلالیت اجزای مخلوط و هم سری eluotropic حلال ها که توسط نویسندگان مختلف گردآوری شده است در نظر گرفته می شود.

قدرت حلال در هنگام استفاده از فازهای قطبی پیوندی (نیتریل، آمینو، دیول، نیترو و غیره)، با در نظر گرفتن واکنش‌های شیمیایی احتمالی و حذف حلال‌های خطرناک برای فاز (به عنوان مثال، کتون‌ها برای فاز) تقریباً به همان روش انتخاب می‌شود. فاز آمینو).

در مورد کروماتوگرافی فاز معکوس، قدرت حلال با افزایش محتوای ماده آلی در شوینده (متانول، استونیتریل یا THF) افزایش می یابد و با افزودن آب بیشتر کاهش می یابد. اگر دستیابی به گزینش پذیری مورد نظر امکان پذیر نباشد، از یک جزء آلی دیگر استفاده می کنند یا با استفاده از افزودنی های مختلف (اسیدها، معرف های جفت یونی و غیره) سعی در تغییر آن می کنند.

در جداسازی با استفاده از کروماتوگرافی تبادل یونی، قدرت حلال با افزایش یا کاهش غلظت محلول بافر یا تغییر pH تغییر می کند؛ در برخی موارد از اصلاح با مواد آلی استفاده می شود.

با این حال، به ویژه در مورد مخلوط های پیچیده طبیعی و بیولوژیکی، اغلب نمی توان قدرت حلال را به گونه ای انتخاب کرد که تمام اجزای نمونه در مدت زمان قابل قبولی شستشو شوند. سپس باید به شستشوی گرادیان متوسل شوید، یعنی از حلالی استفاده کنید که قدرت شستشوی آن در طول فرآیند آنالیز تغییر می کند به طوری که طبق یک برنامه از پیش تعیین شده دائماً افزایش می یابد. این تکنیک امکان دستیابی به شستشوی تمام اجزای مخلوط های پیچیده را در مدت زمان نسبتاً کوتاه و جداسازی آنها به اجزاء به صورت پیک های باریک فراهم می کند.

1.3. اندازه ذرات جاذب، نفوذپذیری و کارایی

با توجه به فرسایش در ستون، نشان دادیم که کارایی ستون (HETT) به اندازه ذرات جاذب بستگی دارد. تا حد زیادی، توسعه سریع HPLC در 10-12 سال گذشته، اولاً به دلیل توسعه روش‌هایی برای تولید جاذب‌هایی با اندازه ذرات از 3 تا 10 میکرون و با ترکیب کسری باریک بوده است که بازدهی بالا را فراهم می‌کند. نفوذپذیری و ثانیاً روش‌های توسعه برای پر کردن ستون‌ها با این جاذب‌ها و ثالثاً توسعه و تولید سریال کروماتوگراف‌های مایع با پمپ‌های فشار بالا، انژکتورها و آشکارسازهایی با کووت‌های با حجم کم که قادر به ثبت پیک‌های کم حجم هستند.

برای ستون‌های با دوغاب با بسته‌بندی خوب، کاهش ارتفاع صفحه نظری معادل (LPHE) می‌تواند 2 باشد، صرفنظر از اینکه از ذرات 3، 5، 10 یا 20 میکرومتر برای بسته‌بندی استفاده می‌شود. در این صورت به ترتیب ستون هایی (با طول استاندارد 250 میلی متر) با راندمان 41670، 25000، 12500 و 6250 تن را دریافت خواهیم کرد. انتخاب کارآمدترین ستون پر از ذرات 3 میکرومتری طبیعی به نظر می رسد. با این حال، این راندمان به قیمت عملیات فشار بسیار بالا و سرعت جداسازی نسبتاً کم خواهد بود، زیرا پمپ موجود به احتمال زیاد قادر خواهد بود حلال را از طریق چنین ستونی با سرعت حجمی بالا پمپاژ کند. در اینجا ما با سوال رابطه بین اندازه ذرات جاذب، کارایی و نفوذپذیری ستون ها روبرو هستیم.

اگر ضریب مقاومت ستون را از اینجا بیان کنیم - یک کمیت بدون بعد، معادله زیر را بدست می آوریم:

ضریب مقاومت برای ستون های پر شده با ریزذرات از همان نوع با استفاده از روش مشابه کمی متفاوت است و مقادیر زیر است:

نوع ذرات «... کروی نامنظم

فرم فرم

بسته بندی خشک. . . . . 1000-2000 800-1200

بسته بندی تعلیق. . . 700-1500 500-700

فشار ورودی ستون با سرعت جریان خطی، ضریب کشش ستون، ویسکوزیته حلال و طول ستون متناسب و با مجذور قطر ذره نسبت معکوس دارد.

با اعمال این رابطه در ستون های فوق با ذرات با قطرهای 3، 5، 10 و 20 میکرومتر و با فرض ثابت بودن دبی خطی، ضریب مقاومت ستون و ویسکوزیته حلال، نسبت فشار ورودی 44:16:4:1 به دست می آید. برای ستون هایی با طول مساوی بنابراین، اگر برای یک جاذب فاز معکوس با اندازه ذرات 10 میکرومتر هنگام استفاده از سیستم های حلال متانول - . آب (70:30) معمولاً روی یک ستون استاندارد با سرعت جریان حلال 1 میلی لیتر در دقیقه، فشار در ورودی ستون 5 مگاپاسکال، سپس برای ذرات 5 میکرومتر - 20 مگاپاسکال و برای 3 میکرومتر - 55 مگاپاسکال است. . هنگام استفاده از سیلیکاژل و یک سیستم حلال با چسبندگی کمتر، هگزان - ایزوپروپانول (100:2)، مقادیر به طور قابل توجهی کمتر خواهد بود: به ترتیب 1، 4 و 11 مگاپاسکال. اگر در مورد یک جاذب فاز معکوس استفاده از ذرات با اندازه 3 میکرومتر بسیار مشکل ساز است و 5 میکرومتر ممکن است، اما نه در همه دستگاه ها، پس برای جاذب فاز معمولی هیچ مشکلی با فشار وجود ندارد. لازم به ذکر است که HPLC مدرن با سرعت بالا معمولاً از سرعت جریان حلال بالاتری نسبت به مثال بالا استفاده می کند، بنابراین فشار مورد نیاز حتی بیشتر می شود.

با این حال، در مواردی که تعداد مشخصی از صفحات نظری برای جداسازی مورد نیاز است و انجام آنالیز نرخ مطلوب است، تصویر تا حدودی تغییر می کند. از آنجایی که طول ستون های دارای جاذب با اندازه دانه های 3، 5، 10 میکرون با کارایی برابر به ترتیب 7.5 خواهد بود. 12.5 و 25 سانتی متر، سپس نسبت فشار در ورودی به ستون ها به 3:2:1 تغییر می کند. بر این اساس، مدت زمان تجزیه و تحلیل در چنین ستون هایی با بازدهی برابر در نسبت 0.3: 0.5: 1 خواهد بود، یعنی در هنگام جابجایی از 10 به 5 و 3 میکرون، مدت زمان آنالیز 2 و 3.3 برابر کاهش می یابد. این تحلیل سریعتر به قیمت فشار نسبتاً بالاتر در ورودی ستون انجام می شود.

داده های ارائه شده برای مواردی معتبر است که جاذب های با اندازه دانه های مختلف دارای منحنی های توزیع اندازه ذرات یکسان هستند، ستون ها به همان روش بسته بندی شده اند و ضریب مقاومت ستون یکسانی دارند. باید در نظر داشت که با کاهش اندازه ذرات، دشواری به دست آوردن کسرهای باریک از جاذب افزایش می یابد. فراکسیون های تولید کنندگان مختلف ترکیبات کسری متفاوتی دارند. بنابراین ضریب مقاومت ستون بسته به اندازه دانه، نوع جاذب، روش بسته بندی ستون و غیره متفاوت خواهد بود.

طبقه بندی روش های HPLC با مکانیزم جداسازی

اکثر جداسازی های انجام شده توسط HPLC بر اساس مکانیسم ترکیبی از برهمکنش مواد با جاذب است که باعث حفظ بیشتر یا کمتر اجزا در ستون می شود. مکانیسم های جداسازی به شکل کم و بیش خالص در عمل بسیار نادر است، به عنوان مثال، جذب هنگام استفاده از سیلیکاژل کاملاً بی آب و هگزان بی آب برای جداسازی هیدروکربن های معطر.

با یک مکانیسم نگهداری ترکیبی برای مواد با ساختارها و وزن‌های مولکولی مختلف، می‌توان سهم در حفظ جذب، توزیع، حذف و سایر مکانیسم‌ها را ارزیابی کرد. با این حال، برای درک و درک بهتر مکانیسم‌های جداسازی در HPLC، توصیه می‌شود جداسازی‌هایی با غلبه مکانیسم دیگری را مربوط به نوع خاصی از کروماتوگرافی، به عنوان مثال، کروماتوگرافی تبادل یونی در نظر بگیرید.

2.1.1 کروماتوگرافی جذب

جداسازی توسط کروماتوگرافی جذبی در نتیجه برهمکنش یک ماده با جاذب هایی مانند سیلیکاژل یا اکسید آلومینیوم که مراکز فعال روی سطح دارند، انجام می شود. تفاوت در توانایی برهمکنش با مراکز جذب مولکول های نمونه مختلف منجر به جدا شدن آنها به مناطق در حین حرکت با فاز متحرک در امتداد ستون می شود. تفکیک منطقه ای اجزای به دست آمده در این مورد به برهمکنش با حلال و جاذب بستگی دارد.

جذب روی سطح یک جاذب حاوی گروه های هیدروکسیل بر اساس برهمکنش خاص بین سطح قطبی جاذب و گروه ها یا بخش های قطبی (یا قابل قطبش) مولکول ها است. چنین برهمکنش هایی شامل برهمکنش دوقطبی-دوقطبی بین دوقطبی های دائمی یا القایی، تشکیل پیوند هیدروژنی تا تشکیل کمپلکس های r یا کمپلکس های انتقال بار است. یک اتفاق ممکن و کاملاً مکرر در کار عملی تجلی جذب شیمیایی است که می تواند منجر به افزایش قابل توجه زمان ماند، کاهش شدید راندمان، ظهور محصولات تجزیه یا جذب غیرقابل برگشت ماده شود.

ایزوترم های جذب مواد دارای شکل خطی، محدب یا مقعر هستند. با ایزوترم جذب خطی، پیک ماده متقارن است و زمان ماند به اندازه نمونه بستگی ندارد. بیشتر اوقات، ایزوترم های جذب مواد غیرخطی و دارای شکل محدب هستند که منجر به عدم تقارن قله با تشکیل دم می شود.

بیشترین کاربرد در HPLC جاذب های سیلیکاژل با حجم منافذ، مساحت سطح و قطر منافذ متفاوت است. اکسید آلومینیوم بسیار کمتر مورد استفاده قرار می گیرد و جاذب های دیگر که به طور گسترده در کروماتوگرافی ستونی و لایه نازک کلاسیک استفاده می شود، بسیار به ندرت استفاده می شود. دلیل اصلی این امر، استحکام مکانیکی ناکافی اکثر جاذب های دیگر است که اجازه بسته بندی یا استفاده در فشارهای بالا مشخصه HPLC را نمی دهد.

گروه های قطبی که باعث جذب می شوند و روی سطح سیلیکا ژل و اکسید آلومینیوم قرار دارند از نظر خواص مشابه هستند. بنابراین معمولاً ترتیب شستشوی مخلوط مواد و سری eluotropic حلالها برای آنها یکسان است. با این حال، تفاوت در ساختار شیمیایی ژل سیلیکا و اکسید آلومینیوم گاهی اوقات منجر به تفاوت در انتخاب می شود - سپس اولویت به یک یا جاذب دیگری داده می شود که برای یک کار خاص مناسب تر است. به عنوان مثال، آلومینا گزینش پذیری بیشتری را برای جداسازی هیدروکربن های آروماتیک چند هسته ای خاص فراهم می کند.

ترجیحی که معمولاً به سیلیکاژل در مقایسه با اکسید آلومینیوم داده می شود با انتخاب گسترده تری از ژل های سیلیکا از نظر تخلخل، سطح و قطر منافذ و همچنین فعالیت کاتالیزوری قابل توجهی بالاتر اکسید آلومینیوم توضیح داده می شود که اغلب منجر به اعوجاج نتایج تجزیه و تحلیل می شود. به دلیل تجزیه اجزای نمونه یا جذب شیمیایی برگشت ناپذیر آنها.

2.1.2 معایب کروماتوگرافی جذبی که استفاده از آن را محدود می کند

محبوبیت کروماتوگرافی جذب به تدریج با توسعه روش HPLC کاهش یافت؛ این روش به طور فزاینده ای با گزینه های دیگری مانند HPLC فاز معکوس و فاز عادی بر روی جاذب هایی با فاز پیوندی جایگزین شد و همچنان جایگزین می شود. معایب کروماتوگرافی جذبی که منجر به این شده است چیست؟

اول از همه، این مدت طولانی فرآیندهای تعادل جاذب با حلال های حاوی آب در مقادیر کم، دشواری تهیه چنین حلال هایی با رطوبت معین و قابل تکرار است. این منجر به تکرارپذیری ضعیف پارامترهای حفظ، وضوح و انتخاب می شود. به همین دلیل، استفاده از شستشوی گرادیان غیرممکن است - بازگشت به حالت اولیه آنقدر طولانی است که به طور قابل توجهی از زمان به دست آمده با استفاده از گرادیان فراتر می رود.

معایب قابل توجه جاذب ها، به ویژه اکسید آلومینیوم، همراه با موارد مکرر بازآرایی ترکیبات حساس به کاتالیز، تجزیه آنها و جذب غیرقابل برگشت نیز به خوبی شناخته شده است و بارها در مقالات ذکر شده است. مواد جاذب برگشت ناپذیری که در قسمت ابتدایی ستون جمع می شوند، ماهیت جاذب را تغییر می دهند و می توانند منجر به افزایش مقاومت ستون یا حتی گرفتگی کامل آن شوند. آخرین ایراد را می توان با استفاده از یک پیش ستون، که توسط-با افزایش مقاومت و گرفتگی، با جاذب جدید* جایگزین می شود یا با جاذب جدید پر می شود. با این حال، جذب برگشت ناپذیر، که در این مورد نیز رخ می دهد، منجر به کروماتوگرام می شود که در آن اجزای نمونه حساس به جذب یا تجزیه کاتالیزوری به طور کامل یا جزئی وجود ندارند.

2.2. کروماتوگرافی توزیع

کروماتوگرافی پارتیشن گونه ای از HPLC است که در آن جداسازی مخلوط به اجزا به دلیل تفاوت در ضرایب توزیع آنها بین دو فاز غیرقابل اختلاط انجام می شود: یک حلال (فاز متحرک) و یک فاز روی جاذب (فاز ساکن). از نظر تاریخی، اولین جاذب هایی از این نوع بودند که با اعمال فازهای مایع (اکسی دی پروپیونیتریل، روغن پارافین و غیره) بر روی تکیه گاه های متخلخل، مشابه روشی که جاذب ها برای کروماتوگرافی گازی مایع (GLC) تهیه می شدند، به دست می آمدند. با این حال، مضرات چنین جاذب هایی بلافاصله آشکار شد، که اصلی ترین آنها شستشوی نسبتاً سریع فاز از حامل بود. به همین دلیل، مقدار فاز در ستون به تدریج کاهش یافت، زمان‌های ماند نیز کاهش یافت و مراکز جذبی که فاز تحت پوشش آن قرار نگرفتند، در قسمت اولیه ستون ظاهر شدند و باعث تشکیل پیک دم‌ها شدند. این اشکال با اشباع کردن حلال با فاز اعمال شده قبل از ورود به ستون، برطرف شد. هنگام استفاده از فازهای پلیمری با چسبناک تر و کمتر محلول تر، حباب کاهش می یابد، اما در این مورد، به دلیل دشواری انتشار از لایه های پلیمری ضخیم، راندمان ستون به طور قابل توجهی کاهش می یابد.

منطقی بود که فاز مایع را از طریق پیوندهای شیمیایی روی حامل به گونه ای پیوند بزنیم که حذف آن از نظر فیزیکی غیرممکن شود، یعنی تبدیل حامل و فاز به یک - به اصطلاح جاذب فاز پیوندی.

تلاش‌های بعدی محققان با هدف جستجوی معرف‌هایی بود که پیوند آنها نسبتاً سریع و کامل انجام می‌شد و پیوندهای تشکیل‌شده تا حد امکان پایدار بودند. این معرف‌ها آلکیل کلروسیلان‌ها و مشتقات آن‌ها بودند که با استفاده از فناوری مشابه، امکان به‌دست آوردن جاذب‌های فاز پیوندی از انواع مختلف و با گروه‌های قطبی و غیرقطبی مختلف روی سطح را فراهم کردند.

کاربرد موفقیت‌آمیز جاذب‌های نوع دوم برای HPLC به رشد تولید آنها توسط تولیدکنندگان مختلف کمک کرده است. هر شرکتی چنین جاذب هایی را معمولاً بر اساس نوع سیلیکاژل خود و با استفاده از فناوری خاص خود تولید می کند که معمولاً "دانش فنی" تولید را تشکیل می دهد. در نتیجه، تعداد زیادی جاذب، که از نظر شیمیایی دقیقاً یکسان نامیده می شوند (به عنوان مثال، سیلیکاژل پیوند شده با اکتادسیل سیلان)، ویژگی های کروماتوگرافی بسیار متفاوتی دارند. این به دلیل این واقعیت است که سیلیکاژل می تواند دارای منافذ بازتر یا باریک تر باشد، سطح متفاوتی داشته باشد، تخلخل، سطح آن قبل از پیوند می تواند هیدروکسیله شود یا خیر، مونو، دی یا تری کلروسیلان ها می توانند پیوند شوند، شرایط پیوند می تواند مونومر، پلیمر باشد. یا فاز لایه مخلوط، روش های مختلفی برای حذف معرف های باقی مانده استفاده می شود، غیرفعال سازی اضافی سیلانول و سایر گروه های فعال ممکن است یا ممکن است استفاده نشود.

پیچیدگی فناوری پیوند معرف ها و تهیه مواد اولیه و مواد، ماهیت چند مرحله ای آن، منجر به این واقعیت می شود که حتی دسته هایی از جاذب ها که با استفاده از فناوری یکسان از یک شرکت تولیدی به دست می آیند، می توانند ویژگی های کروماتوگرافی کمی متفاوت داشته باشند. این امر به ویژه در مواردی که از چنین جاذب هایی برای تجزیه و تحلیل مخلوط های چند جزئی حاوی موادی استفاده می شود که به طور قابل توجهی در تعداد و موقعیت گروه های عاملی و نوع عملکرد متفاوت هستند، صادق است.

با در نظر گرفتن موارد فوق، همیشه باید تلاش کرد تا اطمینان حاصل شود که هنگام استفاده از تکنیک تجزیه و تحلیل شرح داده شده در ادبیات، از جاذب یکسان و شرایط عملیاتی یکسان استفاده می شود. در این صورت احتمال بازتولید نشدن اثر حداقل است. اگر این امکان پذیر نیست، اما یک جاذب از شرکت دیگری با فاز پیوندی مشابه گرفته شده است، باید برای این واقعیت آماده باشید که کار مجدد این تکنیک زمان زیادی طول می کشد. در عین حال این احتمال وجود دارد (و باید در نظر گرفت) که با این جاذب حتی پس از توسعه طولانی، جداسازی لازم حاصل نشود. وجود بسیاری از تکنیک های جداسازی توصیف شده در ادبیات جاذب های قدیمی که برای مدت طولانی تولید شده اند، تولید و استفاده بیشتر آنها را به همین دلیل تحریک می کند. با این حال، در مواردی که لازم است به سمت توسعه روش های اصلی حرکت کنیم، به ویژه در رابطه با مواد مستعد تجزیه، جذب شیمیایی، بازآرایی، توصیه می شود کار بر روی جاذب هایی که اخیراً تولید شده اند و با استفاده از جدید و بهبود یافته تولید شده اند شروع شود. نسخه های این فناوری جاذب های جدید دارای ترکیب کسری یکنواخت تر، پوشش سطحی یکنواخت تر و کامل تر با فاز پیوندی و مراحل نهایی پیشرفته تر پردازش جاذب هستند.

2.3. کروماتوگرافی تبادل یونی

در کروماتوگرافی تبادل یونی، جداسازی اجزای مخلوط از طریق برهمکنش برگشت پذیر مواد یونیزه کننده با گروه های یونی جاذب حاصل می شود. حفظ خنثی الکتریکی جاذب با وجود یون های متقابلی که قادر به تبادل یونی هستند که در مجاورت سطح قرار دارند تضمین می شود. یون نمونه معرفی شده، در تعامل با بار ثابت جاذب، با یون ضد مبادله می شود. مواد با شباهت‌های متفاوت برای بارهای ثابت روی مبدل‌های آنیونی یا مبدل‌های کاتیونی جدا می‌شوند. مبدل‌های آنیونی دارای گروه‌هایی با بار مثبت در سطح هستند و آنیون‌ها را از فاز متحرک جذب می‌کنند. بر این اساس مبدل‌های کاتیونی حاوی گروه‌هایی با بار منفی هستند که با کاتیون‌ها تعامل دارند.

به عنوان یک فاز متحرک، از محلول‌های آبی نمک‌های اسیدها، بازها و حلال‌هایی مانند آمونیاک مایع استفاده می‌شود، یعنی سیستم‌های حلالی با ثابت دی الکتریک e بالا و تمایل بیشتری به یونیزه کردن ترکیبات. معمولاً با محلول‌های بافری کار می‌کنند که PH را مجاز می‌کنند. مقدار قابل تنظیم

در طول جداسازی کروماتوگرافی، یون‌های آنالیت با یون‌های موجود در شوینده رقابت می‌کنند و تمایل به تعامل با گروه‌های بار مخالف جاذب دارند. نتیجه این است که کروماتوگرافی تبادل یونی می تواند برای جداسازی هر ترکیبی که می تواند به نحوی یونیزه شود استفاده شود. حتی می توان مولکول های قند خنثی را در قالب مجتمع های آنها با یون های بورات تجزیه و تحلیل کرد:

شکر + VO 3 2 - = شکر -VO 3 2 -.

کروماتوگرافی تبادل یونی برای جداسازی مواد بسیار قطبی ضروری است که بدون تبدیل به مشتقات توسط GLC قابل تجزیه و تحلیل نیستند. این ترکیبات شامل اسیدهای آمینه، پپتیدها و قندها هستند.

کروماتوگرافی تبادل یونی به طور گسترده در پزشکی، زیست شناسی، بیوشیمی، برای نظارت بر محیط زیست، در تجزیه و تحلیل محتوای داروها و متابولیت های آنها در خون و ادرار، آفت کش ها در مواد خام غذایی، و همچنین برای جداسازی ترکیبات معدنی استفاده می شود. از جمله رادیو ایزوتوپ ها، لانتانیدها، اکتینیدها و غیره. تجزیه و تحلیل بیوپلیمرها (پروتئین ها، اسیدهای نوکلئیک و غیره) که معمولاً ساعت ها یا روزها طول می کشد، با استفاده از کروماتوگرافی تبادل یونی در 20-40 دقیقه با جداسازی بهتر انجام می شود. استفاده از کروماتوگرافی تبادل یونی در زیست شناسی امکان مشاهده مستقیم نمونه ها در محیط های بیولوژیکی را فراهم کرده است و احتمال بازآرایی یا ایزومریزاسیون را کاهش می دهد که می تواند منجر به تفسیر نادرست نتیجه نهایی شود. استفاده از این روش برای نظارت بر تغییرات رخ داده در مایعات بیولوژیکی جالب است. استفاده از مبدل‌های آنیون ضعیف متخلخل مبتنی بر ژل سیلیکا، امکان جداسازی پپتیدها را فراهم کرد. V

مکانیسم تبادل یونی را می توان به شکل معادلات زیر نشان داد:

برای تبادل آنیون

X-+R+Y- ساعت ->■ Y-+R+X-.

برای تبادل کاتیونی |

X+ + R-Y+ h=* Y++R-X+.

در حالت اول، یون نمونه X~ با یون فاز متحرک Y~ برای مراکز یونی R+ مبدل یونی رقابت می کند و در حالت دوم، کاتیون های نمونه X+ با یون های Y+ فاز متحرک برای R رقابت می کنند. ~ مراکز یونی

به طور طبیعی، یون‌های نمونه‌ای که برهمکنش ضعیفی با مبدل یونی دارند، در طول این مسابقه به‌طور ضعیفی روی ستون باقی می‌مانند و اولین یون‌هایی هستند که از آن خارج می‌شوند و برعکس، یون‌هایی که قوی‌تر هستند آخرین یون‌هایی هستند که از ستون خارج می‌شوند. . به طور معمول، فعل و انفعالات BTqpH4Hbie با ماهیت غیر یونی به دلیل جذب یا پیوندهای هیدروژنی نمونه با بخش غیریونی ماتریس یا به دلیل حلالیت محدود نمونه در فاز متحرک رخ می دهد. جداسازی کروماتوگرافی تبادل یونی "کلاسیک" به شکل "خالص" آن دشوار است، و بنابراین برخی از کروماتوگراف ها از اصول تجربی و نه نظری در کروماتوگرافی تبادل یونی استفاده می کنند.

جداسازی مواد خاص در درجه اول به انتخاب مناسب ترین جاذب و فاز متحرک بستگی دارد. رزین های تبادل یونی و ژل های سیلیکا با گروه های یونوژن پیوندی به عنوان فازهای ثابت در کروماتوگرافی تبادل یونی استفاده می شوند.

2.4. بخش کروماتوگرافی حذف

کروماتوگرافی حذف یک گزینه است! کروماتوگرافی مایع، که در آن جداسازی به دلیل توزیع مولکول ها بین حلال واقع در منافذ جاذب و حلال در حال جریان رخ می دهد. " بین ذراتش

بر خلاف سایر گزینه های HPLC، که در آن جداسازی آیندهبا توجه به برهمکنش‌های متفاوت اجزاء با سطح جاذب، نقش پرکننده جامد در کروماتوگرافی حذف اندازه، تنها تشکیل منافذ با اندازه معین است و فاز ساکن، حلالی است که این منافذ را پر می‌کند. بنابراین، استفاده از اصطلاح جاذب برای این پرکننده ها تا حدی خودسرانه است.

یکی از ویژگی های اساسی روش توانایی جدا کردن مولکول ها بر اساس اندازه آنها در محلول در محدوده تقریباً هر وزن مولکولی - از 10 2 تا 10 8 است که آن را برای مطالعه پلیمرهای مصنوعی و زیستی ضروری می کند.

به طور سنتی، فرآیند انجام شده در حلال‌های آلی اغلب کروماتوگرافی نفوذ ژل و در سیستم‌های آبی - کروماتوگرافی فیلتراسیون ژل نامیده می‌شود. در این کتاب، یک اصطلاح واحد برای هر دو گزینه پذیرفته شده است که از انگلیسی "Size Exclusion" - حذف بر اساس اندازه - آمده است و مکانیسم فرآیند را به طور کامل منعکس می کند.

تجزیه و تحلیل دقیق ایده های موجود در مورد نظریه بسیار پیچیده فرآیند کروماتوگرافی حذف اندازه در تک نگاری ها انجام شده است.

حجم کل حلال در ستون Vt (این اغلب حجم کل ستون نامیده می شود، زیرا Vd در فرآیند کروماتوگرافی شرکت نمی کند) مجموع حجم فازهای متحرک و ثابت است.

ماندگاری مولکول ها در یک ستون خروجی با احتمال انتشار آنها در منافذ تعیین می شود و به نسبت اندازه مولکول ها و منافذ بستگی دارد که به صورت شماتیک در شکل 1 نشان داده شده است. 2.15. ضریب توزیع کا،مانند سایر انواع کروماتوگرافی، نسبت غلظت یک ماده در فاز ثابت و متحرک است.

از آنجایی که فاز متحرک و ثابت ترکیب یکسانی دارند، پس Kd ماده ای که هر دو فاز برای آن به یک اندازه قابل دسترسی هستند برابر با وحدت است. این وضعیت برای مولکول‌های C با کوچک‌ترین اندازه‌ها (از جمله مولکول‌های حلال)، که به تمام منافذ نفوذ می‌کنند (نگاه کنید به شکل 2.15) تحقق می‌یابد و بنابراین با کندترین حالت در ستون حرکت می‌کنند. حجم نگهداری آنها برابر با حجم کل حلال است Vt-

برنج. 2.15. مدل جداسازی مولکولی با اندازه گیری در کروماتوگرافی حذف اندازه

تمام مولکول هایی که اندازه آنها بزرگتر از اندازه منافذ جاذب است نمی توانند وارد آنها شوند (حذف کامل) و از کانال های بین ذرات عبور کنند. آنها از ستون با همان حجم نگهداری برابر با حجم فاز متحرک V 0 شسته می شوند - ضریب تقسیم برای این مولکول ها صفر است.

مولکول هایی با اندازه متوسط ​​که فقط می توانند در برخی از منافذ نفوذ کنند، بر اساس اندازه خود در ستون نگه داشته می شوند. ضریب توزیع این مولکول ها از صفر تا یک متغیر است و کسری از حجم منافذ قابل دسترسی برای مولکول های یک اندازه معین را مشخص می کند.

تحلیل کیفی

یک کروماتوگراف که وارد حوزه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا می شود باید با مبانی آنالیز کیفی آشنا شود. تجزیه و تحلیل کیفی برای شناسایی یک محصول شناخته شده استفاده می شود که به روشی جدید به دست آمده یا در مخلوطی با سایر محصولات یافت می شود." هنگام جداسازی اجزای مختلف از مخلوط های پیچیده بیولوژیکی و شیمیایی ضروری است که به ویژه در پزشکی، پزشکی قانونی، بوم شناسی اهمیت دارد. برای نظارت بر وجود برخی فرآورده های شیمیایی دارویی و متابولیت های آنها در bioml.ter.ials. تجزیه و تحلیل "آشنایی با مبانی کیفی" به جلوگیری از اشتباهات رایج کمک می کند، به عنوان مثال، تشخیص ناخالصی های یک نمونه از ناخالصی های موجود در یک حلال یا بررسی خلوص یک ماده در بیش از یک طول موج اسپکتروفتومتر، اما در انواع مختلف و غیره.

قبل از انجام آنالیز، لازم است مشخص شود که آیا کل نمونه توسط یک سیستم حلال معین از ستون شسته می شود یا خیر. برای اطمینان از شستشوی کامل، لازم است تمام مایع جاری شده از ستون جمع آوری شود، حلال تبخیر شود، باقیمانده وزن شود و درجه بازیابی نمونه را بیابید.

شناسایی اجزاء در HPLC می تواند به سه روش انجام شود: 1) با استفاده از اطلاعات نگهداری. 2) مناطق به دست آمده در طول جداسازی را در یک ستون کروماتوگرافی مایع با استفاده از روش های تجزیه و تحلیل طیفی یا شیمیایی بررسی کنید. 3) آنالایزر طیف را مستقیماً به ستون متصل کنید.

حجم احتباس برای ثبت پیک ها در کروماتوگرافی استفاده می شود. وی آر یا زمان ماندگاری تی آر. هر دو کمیت مشخصه یک ماده در یک سیستم کروماتوگرافی معین هستند. از آنجایی که زمان ماند ماده جدا شده شامل زمان برهمکنش در ستون و زمان عبور بخش های خالی لوله است، از ابزاری به ابزار دیگر متفاوت است. راحت است که ماده ای در یک ستون معین حفظ نشود و آن را به عنوان یک استاندارد زمان و حجم نگهداری آن در نظر بگیرید تی 0 , V o. کروماتوگرافی ماده و استاندارد باید در شرایط یکسان (فشار و سرعت جریان) انجام شود. هنگامی که با داده‌های نگهداری شناسایی می‌شوند، مواد فردی شناخته شده که ممکن است در نمونه‌ها وجود داشته باشند، در همان سیستم کروماتوگرافی جدا شده و مقادیر برای آنها به دست می‌آید. تی آر. مقایسه این مقادیر تی آر با زمان ماندن اوج مجهول، می توان دریافت که آنها یا منطبق هستند، در این صورت این احتمال وجود دارد که پیک ها با یک ماده مطابقت داشته باشند، یا تی آر ماده شناخته شده مطابقت ندارد تی آر منطقه ناشناخته سپس تخمین تقریبی مقادیر هنوز امکان پذیر است تی آر موادی که برای اندازه گیری مستقیم میزان نگهداری آنها در دسترس نیستند. بیایید هر دو گزینه را در نظر بگیریم.

در مورد اول، بدیهی است که مطالعه اولیه نمونه برای فرض وجود مواد خاص در آن ضروری است. هنگام کار با مخلوط های ساده، تعیین اینکه آیا میزان حفظ مناطق نمونه و مواد شناخته شده مطابقت دارد یا خیر، یعنی مقادیر، دشوار نیست. tB یکسان یا متفاوت در مورد مخلوط های پیچیده، چندین ماده ممکن است با مقادیر مشابه شسته شوند تی آر, و مناطق به دست آمده در طول جداسازی کروماتوگرافی با هم همپوشانی دارند. در نتیجه به دست آوردن مقادیر دقیق تی آر برای مناطق مختلف غیر ممکن می شود. قابلیت اطمینان شناسایی با افزایش وضوح، کنترل دقیق تر شرایط جداسازی و اندازه گیری مکرر مقادیر افزایش می یابد. تی آر و میانگین مقادیر یافت شده. در این حالت، جداسازی کروماتوگرافی مواد شناخته شده و ناشناخته باید متناوب باشد. هنگام جداسازی مخلوط های پیچیده، ارزش تی آر مواد می توانند تحت تأثیر ماتریس خود نمونه تغییر کنند. این اثر در ابتدای کروماتوگرام و زمانی که پیک ها همپوشانی دارند امکان پذیر است. همانطور که قبلا ذکر شد، می توان مناطق را محکم کرد.

در چنین مواردی، استاندارد باید به نسبت 1:1 به نمونه اضافه شود، اگر مواد یکسان باشند، مقدار تی آر ماده اولیه تغییر نمی کند و تنها یک پیک در کروماتوگرام به دست می آید. اگر دستگاهی با سیستم کروماتوگرافی چرخه ای دارید، برای شناسایی قابل اعتماد، توصیه می شود مخلوط را چندین بار از ستون عبور دهید.

اطلاعات مربوط به میزان نگهداری را نیز می توان در ادبیات پیدا کرد، اما ارزش این اطلاعات محدود است. از آنجایی که ستون‌های حتی یک دسته تکرارپذیری ضعیفی دارند، مقادیر ادبیات همیشه با مقدار واقعی مطابقت ندارند. تی آر روی این ستون با این حال، برای کروماتوگرافی جذب، می توان پیش بینی کرد تی آر بر اساس داده های ادبیات یکی دیگر از مشکلات مربوط به استفاده از معانی ادبی است تی آر, - دشواری یافتن آنها در ادبیات تخصصی، اگرچه مرورهای کتابشناختی منتشر شده در مجله کروماتوگرافی دارای فهرست به روز شده بر اساس نوع ماده است.

در حالت دوم، زمانی که زمان‌های ماند ترکیبات شناخته شده و مناطق نمونه با هم منطبق نیستند، می‌توان زمان ماند جزء مجهول را پیش‌بینی کرد. پیش‌بینی‌های ماندگاری نسبی بر اساس داده‌های ساختاری در کروماتوگرافی طرد فضایی کاملاً قابل اعتماد هستند. دقت آنها در جذب و کروماتوگرافی پارتیشن، و به ویژه هنگام کار بر روی یک فاز متصل به شیمیایی، کمتر است. برای کروماتوگرافی یونی و جفت یونی مواد با p شناخته شده کافقط تعیین تقریبی مقادیر امکان پذیر است tR. همیشه پیش بینی حفظ نسبی یا مقادیر *x آسان تر از مقادیر مطلق است ک". ارزش های نسبی تی آر ارزیابی ترکیبات یا مشتقات مرتبط، مانند اسیدهای آلکیل کربوکسیلیک جایگزین یا مشتقات بنزن آسان تر است.

هنگام جداسازی همولوگ ها یا الیگومرها به صورت ایزوکراتیک، گاهی اوقات الگوی زیر مشاهده می شود:

\ gk" = آ + Bn,

جایی که آو که در- ثابت برای تعدادی از نمونه های انتخاب شده و برای یک سیستم کروماتوگرافی معین (روی یک ستون، با همان فازهای متحرک و ثابت). پ- تعداد واحدهای ساختاری یکسان در مولکول نمونه.

ورود یک گروه عاملی / به مولکول نمونه منجر به تغییر خواهد شد ک" در معادله اول با مقداری ضریب ثابت a/ در یک سیستم کروماتوگرافی معین. امکان بدست آوردن ثابت های گروه a/ برای گروه های جانشین مختلف/ وجود دارد که با افزایش قطبیت گروه های عاملی در همه انواع کروماتوگرافی مقادیر آنها افزایش می یابد، به جز فاز معکوس که مقادیر ثابت ها با کاهش می یابد. افزایش قطبیت

برخی از ثابت های گروه a/ برای گروه های جایگزین مختلف/ در جدول آورده شده است. 9.1.

در کروماتوگرافی جذبی، معادله اول همیشه قابل اجرا نیست، زیرا به شرطی معتبر است که همه ایزومرها دارای یک مقدار باشند. ک", که همیشه رعایت نمی شود. با این حال، می‌توان logfe" ترکیبات مشابه را در یک ستون در مقابل logfe" همان ترکیبات را در یک ستون متفاوت یا در مقابل ویژگی‌های مربوطه در کروماتوگرافی لایه نازک ترسیم کرد، به عنوان مثال، log[(l- RF) IRf].

هنگام مقایسه داده های نگهداری می توان از مقادیر ضریب ظرفیت استفاده کرد ک", چون بر خلاف او تی آر سرعت فاز متحرک و ویژگی های هندسی ستون تحت تأثیر قرار نمی گیرد.

جداسازی فازهای متصل به شیمیایی مشابه جداسازی های کروماتوگرافی پارتیشن با فازهای مشابه است و بنابراین می توان از داده های استخراج حالت پایدار برای پیش بینی زمان ماند استفاده کرد.

در کروماتوگرافی تبادل یونی، سه عامل بر میزان احتباس تاثیر می‌گذارند: درجه یونیزاسیون اسیدها و بازها، بار مولکول یونیزه شده و توانایی ماده از فاز متحرک آبی که در کروماتوگرافی تبادل یونی استفاده می‌شود، برای مهاجرت به مواد آلی. فاز. مورد دوم به وزن مولکولی ترکیب و آبگریزی آن بستگی دارد. بنابراین، اسیدها یا بازهای قوی تر در طول جداسازی تبادل آنیون یا تبادل کاتیونی به شدت حفظ می شوند. هنگام کاهش pK aاز یک اسید منفرد موجود در نمونه، هنگامی که تعدادی از اسیدها به دلیل تبادل آنیونی جدا می شوند، احتباس افزایش می یابد و با افزایش p/Co، احتباس بازها هنگامی که به دلیل تبادل کاتیونی جدا می شوند افزایش می یابد.

بنابراین، همزمانی زمان نگهداری یک ماده شناخته شده با ماده مشاهده شده، فرض هویت آنها را ممکن می سازد. اگر کروماتوگرام های یک ماده شناخته شده و یک جزء ناشناخته تحت شرایط مختلف مقایسه شوند، قابلیت اطمینان شناسایی افزایش می یابد. اگر مواد در جذب و کروماتوگرافی فاز معکوس یا تبادل یونی و حذف اندازه رفتار یکسانی داشته باشند، قابلیت اطمینان شناسایی افزایش می‌یابد. اگر قابلیت اطمینان شناسایی با حفظ نسبی برابر 90٪ باشد، پس هنگام مطالعه رفتار همان مواد تحت شرایط متفاوت قابل توجهی، قابلیت اطمینان شناسایی در حال حاضر 99٪ است.

یک ویژگی ارزشمند ماده مورد استفاده در شناسایی، نسبت سیگنال های به دست آمده برای یک ماده معین در دو آشکارساز مختلف است. ماده مورد تجزیه و تحلیل پس از خروج از ستون، ابتدا از آشکارساز اول و سپس از آشکارساز دوم عبور می کند و سیگنال های دریافتی از آشکارسازها به طور همزمان با استفاده از یک ضبط کننده چند قلمی یا روی دو ضبط کننده ثبت می شوند. به طور معمول، اتصال سری یک آشکارساز فرابنفش (حساس تر، اما انتخابی) با یک رفرکتومتر، یا یک اشعه ماوراء بنفش با یک آشکارساز فلورسانس، یا دو آشکارساز فرابنفش که در طول موج های مختلف کار می کنند استفاده می شود. پاسخ نسبی، یعنی نسبت سیگنال انکسارسنج به سیگنال فتومتر، مشخصه ماده است، مشروط بر اینکه هر دو آشکارساز در محدوده خطی خود عمل کنند. این با تجویز مقادیر مختلف از یک ماده آزمایش می شود. اطلاعات کیفی را می توان با کار با آشکارسازهای فتومتریک مجهز به دستگاه توقف جریان به دست آورد که اجازه می دهد تا طیف پیک بیرون آمده از ستون را در حالی که در سلول جریان قرار دارد ثبت کند و آن را با طیف یک ترکیب شناخته شده مقایسه کند.

اسپکتروفتومترهای مدرن، هنوز هم گران قیمت، با آرایه دیودی، در شناسایی اهمیت قابل توجهی دارند.

یک ماده کاملاً ناشناخته را نمی توان به تنهایی با استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا شناسایی کرد؛ روش های دیگری نیز ضروری هستند.

آنالیز کمی

کروماتوگرافی مایع کمی یک روش تحلیلی به خوبی توسعه یافته است که از نظر دقت کمتر از کروماتوگرافی گازی کمی نیست و به طور قابل توجهی از دقت TLC یا الکتروفورز فراتر می رود. مانند کاتارومتر در GLC) بنابراین برای به دست آوردن نتایج کمی کالیبراسیون دستگاه الزامی است.

تجزیه و تحلیل کمی شامل مراحل زیر است: 1) جداسازی کروماتوگرافی. 2) اندازه گیری نواحی یا ارتفاعات قله. 3) محاسبه ترکیب کمی مخلوط بر اساس داده های کروماتوگرافی. 4) تفسیر نتایج به دست آمده، یعنی پردازش آماری. بیایید تمام این مراحل را در نظر بگیریم.

4.1. جداسازی کروماتوگرافی

ممکن است در هنگام جمع آوری نمونه اشتباهاتی رخ دهد. اجتناب از خطا و به دست آوردن نمونه معرف کافی از جامدات ناهمگن، مواد فرار یا ناپایدار و محصولات کشاورزی و مواد زیستی بسیار مهم است. نمونه های ناهمگن، به عنوان مثال محصولات غذایی، کاملاً مخلوط و ربع می شوند. با انجام چندباره این عمل همگنی نمونه حاصل می شود.

خطاها و تلفات مواد در مرحله استخراج، جداسازی، تصفیه و غیره قابل انجام است.

نمونه ها باید به طور کامل حل شده و محلول های آنها با دقت 0.1 ± درصد آماده شود. توصیه می شود نمونه در فاز متحرک حل شود که احتمال بارش آن پس از وارد شدن به کروماتوگرافی از بین می رود. اگر انحلال در فاز متحرک امکان پذیر نباشد، باید از حلال قابل اختلاط با آن استفاده کرد و حجم نمونه (کمتر از 25 میکرولیتر) را به کروماتوگراف وارد کرد.

خطاهای قابل توجهی می تواند در حین تزریق نمونه به دلیل شکنش نمونه، نشت و لکه گیری اوج رخ دهد. تار شدن قله ها باعث تشکیل دم می شود که منجر به همپوشانی جزئی قله ها و در نتیجه خطا در تشخیص می شود. دستگاه های دریچه حلقه ای به دلیل دقت بالاتر و وابستگی کمتر به اپراتور برای معرفی نمونه در تجزیه و تحلیل کمی نسبت به سرنگ ها ارجحیت دارند.

هنگام جداسازی کروماتوگرافی مواد، عوارضی نیز می تواند ایجاد شود که منجر به تحریف داده ها می شود: تجزیه و تحلیل کمی. ممکن است در طول فرآیند کروماتوگرافی، تجزیه یا تبدیل نمونه یا جذب غیرقابل برگشت ماده روی ستون وجود داشته باشد. اطمینان از عدم وجود این پدیده های نامطلوب و در صورت لزوم بازسازی ستون یا جایگزینی آن بسیار مهم است. همپوشانی اوج و باطله را می توان با تغییر شرایط کروماتوگرافی کاهش داد.

قله هایی با اشکال کاذب یا نامشخص و همچنین قله هایی که زمان رهاسازی آنها نزدیک به به, زیرا جداسازی آنها ممکن است کافی نباشد. معمولاً از پیک‌هایی با مقدار d"^0.5 استفاده می‌شود. بالاترین کارایی ستون با وارد کردن 10~ 5 -10~ 6 گرم ماده محلول در هر 1 گرم جاذب به دست می‌آید. هنگام معرفی مقادیر زیاد نمونه، وابستگی به ارتفاع پیک روی بار ممکن است غیرخطی باشد و ارزیابی کمی توسط مناطق اوج مورد نیاز است.

خطاهای مرتبط با تشخیص یا تقویت منجر به اعوجاج قابل توجهی در نتایج جداسازی کروماتوگرافی می شود. هر آشکارساز با ویژگی، خطی بودن و حساسیت مشخص می شود. تست گزینش به ویژه هنگام تجزیه و تحلیل ناخالصی های ردیابی مهم است. پاسخ آشکارسازهای UV می تواند با ضریب 104 نسبت به مواد با گروه های عملکردی مشابه متفاوت باشد. لازم است پاسخ آشکارساز برای هر آنالیت کالیبره شود. به طور طبیعی، موادی که در ناحیه UV جذب نمی شوند، هنگام استفاده به عنوان آشکارساز نور سنج، سیگنالی به ضبط کننده نمی دهند. هنگام استفاده از رفرکتومتر، ممکن است پیک های منفی ظاهر شوند. علاوه بر این، این آشکارساز باید دارای ترموستات باشد که برای آشکارساز UV نیازی نیست.

خطی بودن آشکارساز اندازه نمونه تزریق شده را تعیین می کند. مهم است که به یاد داشته باشید که سرعت جریان ستون، دمای ستون و آشکارساز، و طراحی آشکارساز همگی بر دقت تجزیه و تحلیل کمی تأثیر می‌گذارند. خطا در انتقال سیگنال الکتریکی به یک دستگاه خروجی (ضبط کننده)، یکپارچه ساز یا کامپیوتر می تواند به دلیل القای نویز، عدم اتصال به زمین، نوسانات ولتاژ در شبکه و غیره ایجاد شود.

4.2. اندازه گیری مساحت یا ارتفاع قله

ارتفاع قله ساعت (شکل 10.1) فاصله از بالای قله تا خط پایه است؛ این فاصله به صورت خطی یا با شمارش تعداد تقسیمات روی یک ضبط کننده اندازه گیری می شود. برخی از یکپارچه‌سازهای الکترونیکی و رایانه‌ها اطلاعاتی در مورد ارتفاعات قله ارائه می‌دهند. موقعیت خط پایه قله های جابجا شده با درون یابی مقادیر ارتین مربوط به ابتدا و انتهای پیک (قله) پیدا می شود. 1 و 3شکل را ببینید 10.1). برای بهبود دقت، لازم است یک خط پایه صاف و پایدار داشته باشید. در مورد قله‌های تقسیم نشده، خط مبنا بین شروع و انتهای پیک ترسیم می‌شود نه اینکه با یک خط صفر جایگزین شود. از آنجا که ارتفاع قله کمتر به تأثیر قله های همپوشانی مجاور وابسته است، تخمین ارتفاع قله دقیق تر است و تقریباً همیشه در تجزیه و تحلیل ردیابی استفاده می شود.

مساحت پیک را می توان به روش های مختلفی تعیین کرد. بیایید به برخی از آنها نگاه کنیم.

1. روش پلان سنجی شامل ردیابی قله با پلان متر دستی است که وسیله ای است که به صورت مکانیکی مساحت قله را تعیین می کند. روش دقیق است، اما کار فشرده و ضعیف است. این روش توصیه نمی شود.

2. روش شبح کاغذ - قله بریده شده و وزن می شود. این روش بسیار قابل تکرار است، اما کار فشرده است، و کروماتوگرام از بین می رود. کاربرد آن به یکنواختی نوار نمودار بستگی دارد. این روش همچنین نمی تواند به طور گسترده توصیه شود.

4. روش مثلث سازی شامل ساختن مثلث با کشیدن مماس به اضلاع قله است. بالای مثلث بالاتر از بالای قله است. افزایش سطح تشکیل شده توسط این راس توسعه یافته در سراسر کروماتوگرام ثابت خواهد بود و بر دقت تأثیر زیادی نخواهد داشت. علاوه بر این، مقداری از ناحیه از دست رفته هنگام ترسیم مماس جبران خواهد شد. قاعده مثلث با تقاطع مماس ها با خط مبنا و مساحت از حاصل ضرب 7 گرم قاعده و ارتفاع تعیین می شود. این روش بهترین روش برای تعیین نواحی قله های نامتقارن است. با این حال، تکرارپذیری هنگام ساخت مماس توسط عملگرهای مختلف متفاوت است و بنابراین; کم.

5. روش یکپارچه ساز دیسک بر اساس یک دستگاه الکترومکانیکی متصل به یک ضبط کننده است. قلم متصل به یکپارچه ساز در امتداد نواری در پایین نوار با سرعتی متناسب با حرکت قلم ضبط حرکت می کند.

همانند اندازه‌گیری‌های دستی، پیک باید در مقیاس ضبط‌کننده باقی بماند، اما تنظیمات برای جبران جابه‌جایی‌های پایه و جداسازی ناقص پیک‌های مجاور، قابلیت اطمینان را کاهش می‌دهد و زمان تحلیل را افزایش می‌دهد.

این روش از روش‌های اندازه‌گیری دستی، به ویژه برای پیک‌های نامتقارن، دقیق‌تر است و یک مزیت سرعت ارائه می‌دهد. علاوه بر این، یک رکورد کمی دائمی از تجزیه و تحلیل فراهم می کند.

6. روش‌هایی با استفاده از یکپارچه‌کننده‌های الکترونیکی که منطقه پیک را تعیین می‌کنند و اطلاعات چاپی مربوط به آن منطقه و زمان‌های ماندگاری را می‌توان شامل تصحیح جابجایی پایه و تعیین مساحت پیک‌های جزئی حل‌شده باشد. مزایای اصلی دقت، سرعت، استقلال عمل از عملکرد ضبط است. ادغام کننده ها دارای حافظه هستند و می توانند برای یک تحلیل خاص با استفاده از یک برنامه از پیش نصب شده برنامه ریزی شوند. مزایای یکپارچه ساز شامل توانایی آن در استفاده از فاکتورهای تصحیح برای پاسخ آشکارساز هنگام محاسبه مجدد داده های اصلی در مناطق پیک، جبران تفاوت در حساسیت آشکارساز به مواد مختلف است. چنین سیستم هایی در زمان صرفه جویی می کنند، دقت تحلیلی را بهبود می بخشند و برای تحلیل های تحلیلی معمولی مفید هستند.

7. در کروماتوگرافی مایع، کامپیوترها به طور گسترده ای برای اندازه گیری نواحی پیک استفاده می شوند. آنها یک پیام کامل شامل نام مواد، نواحی پیک، زمان ماندگاری، فاکتورهای تصحیح پاسخ آشکارساز و فراوانی (wt%) برای اجزای مختلف نمونه چاپ می‌کنند.