وابستگی سرعت واکنش آنزیمی به دما. سینتیک واکنش های آنزیمی وابستگی سرعت واکنش آنزیمی به مقدار آنزیم ها

سینتیک واکنش های آنزیمی

الگوهای جریان در زمان P-یونهای آنزیمی و همچنین مکانیسم آنها را مطالعه می کند. فصل سینتیک شیمیایی

کاتالیزوری چرخه تبدیل in-va S (سوبسترا) به محصول P تحت تأثیر آنزیم E با تشکیل یک واسطه ادامه می یابد. ارتباط ایکس من:

جایی که کی-ثابت های سرعت مراحل ابتدایی منفرد، تشکیل یک کمپلکس آنزیم-سوبسترا X 1 (ES، مجتمع Michaelis).

در یک t-re معین، سرعت p-tion به غلظت آنزیم، سوبسترا و ترکیب محیط بستگی دارد. سینتیک‌های ثابت، پیش‌ایستا و آرام‌سازی P-یون‌های آنزیمی وجود دارد.

سینتیک ثابتدر حالت ایستا در Comm میانی. (dX من/dt= 0، i = 1، ...، n) و با مازاد سوبسترا که [S] 0 و [E] 0 به ترتیب غلظت اولیه هستند. سوبسترا و آنزیم، سینتیک فرآیند با یک سطح ثابت و ثابت زمانی از غلظت ها در بین مشخص می شود. comp.، و بیان نرخ فرآیند v 0، تماس گرفت سرعت ثابت اولیه، به شکل (معادله مایکلیس-منتن):

(1)

که در آن مقادیر k cat و K m ->توابع ثابت سرعت مراحل ابتدایی و با معادلات داده می شود:

ارزش k cat تماس گرفت کاتالیزور کارآمد ثابت سرعت فرآیند، پارامتر K m ->ثابت مایکلیس ارزش k cat توسط مقادیر تعیین می شود حداکثر کاتالیزوری مراحل آهسته نواحی و گاهی نامیده می شود. تعداد چرخش آنزیم (سیستم آنزیمی)؛ k گربه تعداد کاتالیزور را مشخص می کند. چرخه هایی که توسط سیستم آنزیمی در واحد زمان انجام می شود. نایب معمولی که دارای مقدار k cat است. برای خاص بسترها در محدوده 10 2 -10 3 s -1 . مقادیر معمولی ثابت Michaelis در محدوده 10 -3 - 10 -4 M قرار دارد.

در غلظت‌های بالای زیرلایه، زمانی که چنین است، سرعت p-tion به غلظت زیرلایه بستگی ندارد و به یک مقدار ثابت می‌رسد که نامیده می‌شود. حداکثر سرعت. از نظر گرافیکی، معادله Michaelis-Menten یک هذلولی است. می توان آن را با استفاده از روش دوطرفه متقابل (روش Lineweaver-Burk)، یعنی ایجاد وابستگی 1/v به 1/[S] 0 یا روش های دیگر خطی کرد. شکل خطی معادله (1) به شکل زیر است:

(2)

این به شما امکان می دهد مقادیر را به صورت گرافیکی تعیین کنید K mو v max (شکل 1).

برنج. 1. نمودار تبدیل خطی معادله Michaelis - Menten در دو متقابل (طبق Lineweaver - Burke).

مقدار K m >از نظر عددی برابر با غلظت زیرلایه است که در آن نرخ p-tion برابر است، بنابراین K mاغلب به عنوان معیاری برای سنجش میل ترکیبی سوبسترا و آنزیم عمل می کند، اما این تنها در صورتی صادق است که

مقادیر K m >و بسته به مقادیر pH تغییر می کند. این به دلیل توانایی گروه‌های مولکول آنزیم درگیر در کاتالیز برای تغییر حالت یونیزاسیون و در نتیجه کاتالیزور آنها است. بهره وری. در ساده ترین حالت، تغییر در pH منجر به پروتونه شدن یا deprotonation حداقل دو گروه قابل یونیزاسیون آنزیم درگیر در کاتالیز می شود. اگر در این مورد تنها یک شکل از کمپلکس آنزیم-سوبسترا (به عنوان مثال ESH) از سه مورد ممکن (ES، ESH و ESH 2) بتواند به یک محصول محلول تبدیل شود، وابستگی نرخ به pH شرح داده می شود. توسط f-loy:

جایی که f= 1 + / و f" = 1 + +K" ب/>-تی تماس گرفت توابع pH مایکللیس، و ک الف، ک بو K" a، K" b ->ثابت های یونیزاسیون گروهی a و b به ترتیب. رایگان کمپلکس آنزیم و سوبسترای آنزیم. در مختصات ال جی - pH این وابستگی در شکل نشان داده شده است. 2 و مماس شیب مماس ها به شاخه های صعودی، مستقل از pH و نزولی منحنی باید به ترتیب 1+، 0 و 1- باشد. از روی چنین نموداری می توان مقادیر را تعیین کرد RK aگروه های درگیر در کاتالیز

برنج. 2. وابستگی کاتالیزور ثابت از pH تا لگاریتمی مختصات

سرعت p-tion آنزیمی همیشه تابع رابطه (1) نیست. یکی از شایع ترین موارد - مشارکت در منطقه آلوستریک است. آنزیم ها (نگاه کنید به تنظیم کننده آنزیم)برای to-rykh وابستگی درجه اشباع آنزیم به [S] 0 غیرهایپربولیک است. شخصیت (شکل 3). این پدیده به دلیل همکاری اتصال سوبسترا است، یعنی زمانی که اتصال یک سوبسترا به یکی از محل‌های ماکرومولکول آنزیمی افزایش می‌یابد (همکاری مثبت) یا کاهش می‌دهد (همکاری منفی) میل ترکیبی برای سوبسترای سایت دیگر.

برنج. H وابستگی درجه اشباع آنزیم با سوبسترا به غلظت سوبسترا با همکاری مثبت (I) و منفی (II) و همچنین در غیاب آن (III).

سینتیک قبل از خواب.با اختلاط سریع محلول های آنزیم و سوبسترا در بازه زمانی 10-6-10-10 ثانیه، می توان فرآیندهای گذرا را مشاهده کرد که قبل از تشکیل یک حالت ثابت پایدار است. در این حالت پیش ایستا، هنگام استفاده از مقدار زیادی از بستر، سیستم دیفرانسیل. ur-tion، که سینتیک فرآیندها را توصیف می کند، خطی است. حل این نوع سیستم از دیفرانسیل های خطی. ur-tion با مجموع عبارت های نمایی به دست می آید. بنابراین، برای جنبشی در طرح ارائه شده در بالا، سینتیک تجمع محصول به شکل زیر است:

جایی که A من ->, b و n ->توابع ثابت های نرخ اولیه؛ -ریشه های مشخصه مربوطه ur-tion.

متقابل از ، نامیده می شود. مشخصه زمان پردازش:

برای p-tion، جریان با مشارکت nintermediate. Comm.، شما می توانید مشخصه ها را دریافت کنید. بار.

مطالعه سینتیک ناحیه آنزیمی در حالت پیش ثابت به شما امکان می دهد تا ایده دقیق مکانیزم کاتالیزوری را بدست آورید. چرخه و ثابت های سرعت مراحل ابتدایی فرآیند را تعیین کنید.

به طور تجربی، سینتیک محلول آنزیمی در حالت پیش ثابت با استفاده از روش جت متوقف شده مورد مطالعه قرار می گیرد (شکل 2 را ببینید). روشهای جنبشی جت)اجازه می دهد تا اجزای ناحیه را در عرض 1 میلی ثانیه مخلوط کنید.

سینتیک آرامشبا یک اثر اغتشاشگر سریع بر روی سیستم (تغییرات در t-ry، فشار، میدان های الکتریکی)، مدت زمانی که سیستم طول می کشد تا به تعادل یا حالت ساکن جدید برسد، به سرعت فرآیندهایی که کاتالیزور را تعیین می کنند، بستگی دارد. چرخه آنزیمی

اگر جابجایی از موقعیت تعادل کم باشد، سیستم معادلات توصیف کننده سینتیک فرآیند خطی است. حل سیستم منجر به وابستگی غلظت اجزای تجزیه می شود. مراحل فرآیند به صورت مجموع اصطلاحات نمایی، که نماهای آن دارای ویژگی زمان آرامش هستند. نتیجه مطالعه طیف زمان های آرامش مربوط به تعداد فواصل است. درگیر در این فرآیند است. زمان آرامش به ثابت سرعت مراحل ابتدایی فرآیندها بستگی دارد.

روش های آرامش بخشسینتیک تعیین ثابت های سرعت مراحل ابتدایی منفرد تبدیل مواد واسطه را ممکن می سازد. روش های مطالعه سینتیک آرامش متفاوت است. وضوح: جذب اولتراسوند - 10 -6 -10 -10 s، پرش دما - 1O -4 -10 -6 ثانیه، روش الکتریکی. ضربه - 10 -4 -10 -6 ثانیه، پرش فشار - 10 -2 ثانیه. در مطالعه سینتیک یونهای آنزیمی، کاربرد با روش پرش دما پیدا شد.

ماکروکینتیک فرآیندهای آنزیمی.توسعه روش هایی برای به دست آوردن کاتالیزورهای ناهمگن با تثبیت آنزیم ها در decomp. رسانه ها (نگاه کنید به آنزیم های بی حرکت) تجزیه و تحلیل سینتیک فرآیندها را با در نظر گرفتن انتقال جرم زیرلایه ضروری می کند. قوانین سینتیک p-tions به صورت تئوری و تجربی، با در نظر گرفتن اثرات لایه انتشار و برای سیستم‌هایی با مشکلات intradiffusion در توزیع آنزیم در داخل حامل مورد مطالعه قرار گرفت.

تحت شرایطی که سینتیک فرآیند تحت تأثیر انتقال انتشار زیرلایه قرار می گیرد، کاتالیزوری. راندمان سیستم کاهش می یابد ضریب کارایی برابر است با نسبت چگالی جریان محصول در شرایط جریان ناحیه آنزیمی با غلظت بستر کاهش‌یافته به جریان، که در غیاب محدودیت‌های انتشار قابل تحقق است. در ناحیه انتشار محض، زمانی که نرخ فرآیند با انتقال جرم زیرلایه تعیین می‌شود، ضریب کارایی سیستم‌های دارای مهار انتشار خارجی با مدول انتشار نسبت معکوس دارد:

جایی که ضخامت لایه انتشار، ضریب D. انتشار بستر

برای سیستم هایی با کاهش سرعت درون انتشار در p-tion های مرتبه اول

جایی که f تی- ماژول بدون بعد (ماژول Thiele).

هنگام تجزیه و تحلیل جنبشی قوانین در راکتورهای تخمیر به صورت نظری و آزمایش کنید. مدل‌های «ایده‌آل» راکتورها، یک راکتور جریان (یک راکتور جریان اختلاط ایده‌آل)، یک راکتور جریان با جابجایی ایده‌آل، و یک راکتور غشایی، توسعه داده شده‌اند.

سینتیک فرآیندهای چند آنزیمی.در بدن (سلول)، آنزیم ها به صورت مجزا عمل نمی کنند، بلکه زنجیره های تبدیل مولکول ها را کاتالیز می کنند. R-tion در سیستم های پلی آنزیمی با جنبشی. دیدگاه ها را می توان منسجم دانست. فرآیندها، خاص یکی از ویژگی های to-rykh آنزیم های هر یک از مراحل است:

جایی که , پاسخ حداکثر، سرعت فرآیند و ثابت Michaelis منمرحله چهارم منطقه به ترتیب.

یکی از ویژگی های مهم فرآیند امکان تشکیل یک حالت ثابت پایدار است. شرط وقوع آن می تواند نابرابری باشد > v 0، که در آن v 0 نرخ مرحله محدود کننده است که با کوچکترین ثابت سرعت مشخص می شود و بنابراین نرخ کل دنباله را تعیین می کند. روند. در حالت ساکن، غلظت متابولیت ها پس از مرحله محدود کننده کمتر از ثابت Michaelis آنزیم مربوطه است.

خاص گروهی از سیستم های پلی آنزیمی از سیستم هایی تشکیل شده اند که اکسید کننده-بازگردانی را انجام می دهند. p-tion با مشارکت حامل های الکترون پروتئینی. حامل ها خاص هستند. ساختارها، کمپلکس هایی با توالی انتقال الکترون قطعی. جنبشی شرح چنین سیستم هایی به عنوان یک متغیر حالت مستقل از مدارها با decomp در نظر گرفته می شود. درجه جمعیت الکترون ها

کاربرد. F. r. به طور گسترده در عمل تحقیقاتی برای مطالعه مکانیسم های عمل آنزیم ها و سیستم های آنزیمی استفاده می شود. حوزه عملاً قابل توجه علم آنزیم است آنزیم شناسی مهندسی،با مفاهیم F.r عمل می کند. برای بهینه سازی بیوتکنول. فرآیندها

روشن: Poltorak O. M., Chukhrai E. S., Physical and chemical bases of enzymatic catalysis, M., 1971; Berezin IV، Martinek K، مبانی شیمی فیزیکی کاتالیز آنزیمی، M.، 1977; Varfolomeev S. D.، Zaitsev S. V.، روشهای جنبشی در تحقیقات بیوشیمیایی، M.. 1982. S. D. Varfolomeev.

دایره المعارف شیمی. - م.: دایره المعارف شوروی. اد. I. L. Knunyants. 1988 .

ببینید «سینتیک واکنش آنزیمی» در فرهنگ‌های دیگر چیست:

کاتالیزوری rtion چرخه ای فرآیندی متشکل از تعدادی جیره ابتدایی که سرعت آنها توسط قانون جرم عمل توصیف می شود. این قانون شکل ساده ای برای مخلوط های گازی ایده آل، خندق های p ایده آل و لایه های سطحی ایده آل دارد. دایره المعارف شیمی

سینتیک واکنش های شیمیایی، دکترین فرآیندهای شیمیایی، قوانین جریان آنها در زمان، سرعت ها و مکانیسم ها. مهم ترین حوزه های شیمی مدرن و شیمی ... ... با مطالعه سینتیک واکنش های شیمیایی مرتبط است. دایره المعارف بزرگ شوروی

سینتیک شیمیایی- (از جنبش یونانی. kinesis)، بخش شیمی نظری که به مطالعه قوانین شیمی اختصاص دارد. واکنش ها انواع مختلفی از شیمی وجود دارد. فعل و انفعالات و مهمتر از همه، تشخیص واکنش هایی که در یک محیط همگن (همگن) رخ می دهند از واکنش هایی که ... ... دایره المعارف بزرگ پزشکی

- (بیوکاتالیز)، تسریع بیوشیمیایی. جیره با مشارکت درشت مولکول های پروتئینی به نام آنزیم (آنزیم). F. to. نوعی کاتالیزور است، اگرچه اصطلاح تخمیر (تخمیر) از زمان های قدیم شناخته شده است، زمانی که مفهوم شیمیایی وجود نداشت. کاتالیزور اولین… … دایره المعارف شیمی

- (از پیشوند لاتین re به معنای عمل معکوس و عمل کنش)، تبدیل برخی در در (ترکیبات اولیه) به برخی دیگر (محصولات واکنش) با تغییر ناپذیری هسته اتم ها (بر خلاف واکنش های هسته ای). اتصالات اولیه در R. x. گاهی به نام...... دایره المعارف شیمی

- (از lat. fermentum خمیرمایه) (آنزیم)، پروتئین هایی که به عنوان کاتالیزور در موجودات زنده عمل می کنند. اصلی عملکرد F. برای تسریع تبدیل به، ورود به بدن و تشکیل شده در طول متابولیسم (تجدید ساختارهای سلولی، برای اطمینان از آن ... دایره المعارف شیمی

- (از داروی یونانی pharmakon و kinetikos setting in motion)، جنبشی را مطالعه می کند. الگوهای فرآیندهای رخ داده با لک. cfd در بدن اصلی فارماکوکینتیک فرآیندها: جذب، توزیع، متابولیسم و ​​دفع (دفع). دایره المعارف شیمی

در t=36-38 0 آنزیم بیشترین فعالیت را دارند. این دما را دمای بهینه می نامند:

با افزایش t 0 به حد مطلوب، فعالیت آنزیم ها افزایش می یابد.

t بالا باعث دناتوره شدن آنزیم می شود.

t کم باعث کاهش فعالیت آنزیم ها می شود.

تغییر در t 0 منجر به اختلال در پیوندهایی می شود که ساختار پروتئین آنزیم ها (ثالثیه، چهارم) را تثبیت می کنند. باعث دناتوره شدن می شود.

دناتوراسیون برگشت پذیر با کاهش t 0 مشاهده می شود. این به شما امکان می دهد آنزیم ها، مایعات بدن، خون را ذخیره کنید.

افزایش دما به طور غیر قابل برگشتی ساختار پروتئین آنزیم را مختل می کند. از این خاصیت در استریل کردن مواد و ابزار استفاده می شود.

تب خاصیت محافظتی بدن است، زیرا. دناتوره شدن آنزیم های میکروارگانیسم ها وجود دارد و بنابراین استفاده از داروهای ضد تب نامناسب است.

وابستگی سرعت واکنش به pH

در نمودار، این وابستگی شبیه یک زنگ است. در بالای منحنی یک نقطه بهینه pH وجود دارد که آنزیم بالاترین فعالیت را دارد. pH بر میزان یونیزاسیون گروه های اسیدی و بازی تأثیر می گذارد. در مقادیر مختلف pH، مرکز فعال می تواند به صورت جزئی یونیزه یا غیریونیزه باشد که بر ساختار سوم مرکز فعال و تشکیل کمپلکس آنزیم-سوبسترا تأثیر می گذارد.

اثر pH

آنزیم ها، مانند همه پروتئین ها، حاوی بسیاری از گروه های آلوده مثبت و منفی (-NH 2، -COOH) هستند که بخشی از اسیدهای آمینه arg، lys، asp و glu هستند. کل شارژ بستگی به نسبت بین این گروه ها دارد. بار پروتئین آنزیم بسته به غلظت یون های هیدروژن در سلول تغییر می کند که گروه کربوکسیل را خنثی می کند (سرکوب می کند):

و گروه های بار مثبت تشکیل می دهند:

بنابراین افزایش بار مثبت یا کاهش بار منفی در سطح آنزیم به دلیل افزایش غلظت یون های هیدروژن است.

حالت یک مولکول پروتئین که در آن بار کل پروتئین 0 باشد، حالت ایزوالکتریک نامیده می شود.

مقدار pH که در آن بار یک مولکول پروتئین 0 است، نقطه ایزوالکتریک (IEP) نامیده می شود.

بیشتر آنزیم ها در اطراف نقطه ایزوالکتریک فعال و پایدار هستند.

نوسانات شدید pH باعث دناتوره شدن پروتئین می شود، به عنوان مثال. کاهش فعالیت آنزیمی

مقدار pH که در آن آنزیم حداکثر فعالیت را از خود نشان می دهد، pH بهینه نامیده می شود که مشخصه آنزیم معینی است که با یک بستر خاص واکنش می دهد.

آنزیم های درون سلولی معمولاً دارای pH بهینه مربوط به یک محیط خنثی (pH = 7) نزدیک به مقدار pH طبیعی مایعات بدن هستند. آنزیم هایی وجود دارند که pH بهینه آنها در یک محیط شدیدا اسیدی و به شدت قلیایی است.

طبقه بندی آنزیم ها

شش دسته از آنزیم ها وجود دارد:

1. هیدرولازها - آنزیم هایی که با مشارکت مولکول های آب، بستر را تجزیه می کنند.

2. لیازها - آنزیم هایی که مولکول های سوبسترا را بدون مشارکت آب تجزیه می کنند، در حالی که محصولات با وزن مولکولی پایین اغلب تشکیل می شوند - CO 2، NH 3، H 2 O.

3. ایزومرازها - آنزیم هایی که باعث دگرگونی های ایزومری در مولکول می شوند.

4. فرازها (ترانسفرازها) - آنزیم هایی که گروه ها را از یک مولکول به مولکول دیگر یا از یک موقعیت به موقعیت دیگر در یک مولکول منتقل می کنند.

5. اکسیدرودوکتازها - آنزیم هایی که انتقال پروتون ها و الکترون ها را کاتالیز می کنند (یعنی واکنش های ردوکس).

6. لیگازها (سینتازها) - آنزیم هایی که سنتز مولکول های بزرگ را از مولکول های کوچکتر کاتالیز می کنند.

نامگذاری آنزیم

نام کاری آنزیم شامل نام سوبسترا، نوع واکنش کاتالیز شده و پایان -aza است.

نام سیستماتیک شامل نام بسترها، نام نوع تبدیل شیمیایی کاتالیز شده و پایان -aza است.

نام کلاس نشان دهنده نوع واکنش شیمیایی است که توسط آنزیم ها کاتالیز می شود. طبقات به زیر کلاس ها تقسیم می شوند - عملکرد آنزیم را مشخص می کند، زیرا ماهیت گروه شیمیایی بستر مورد حمله آنزیم را نشان می دهد. زیر کلاس به زیر کلاس ها تقسیم می شود. زیرشاخه ها عملکرد آنزیم را مشخص می کنند و ماهیت پیوند بستر مورد حمله یا ماهیت پذیرنده را مشخص می کنند.

I. اکسیدرودوکتازها واکنش های ردوکس را کاتالیز می کنند. اکسیدرودوکتازها نیز دهیدروژناز یا ردوکتاز نامیده می شوند. اکسیدرودوکتازها حامل پروتون و الکترون هستند. اکسیدرودوکتازها به زیر کلاس های زیر تقسیم می شوند:

1. دهیدروژنازهای هوازی - پروتون ها و الکترون ها را به اکسیژن منتقل می کنند.

کوآنزیم های اکسیدوردوکتاز عبارتند از:

NAD - نیکوتین آمید آدنین دی نوکلئوتید - حاوی ویتامین B 5 - نیکوتین آمید است.

NADP - نیکوتین آمید آدنین دی نوکلئوتید فسفات، حاوی ویتامین B5 است.

FAD - فلاوین آدنین دی نوکلئوتید، حاوی ویتامین B2 - ریبوفلاوین است.

FMN - فلاوین مونوکلئوتید، حاوی ویتامین B2 - ریبوفلاوین است.

اکسیدرودوکتازها واکنش های هیدروژن زدایی را کاتالیز می کنند، به عنوان مثال. حذف هیدروژن

اکسیدرودوکتازها گروه های عاملی زیر را اکسید می کنند:

OH، -C \u003d O، -NH 2

کوآنزیم های دهیدروژناز پروتون ها و الکترون ها را به هم متصل می کنند.

دهیدروژنازهای وابسته به NAD گروه های عاملی زیر را اکسید می کنند: الکل هیدروکسیل (OH)، گروه آلدهید (COH)، گروه آمینه (NH2).

دهیدروژنازهای وابسته به NAD انواع واکنش‌های زیر را کاتالیز می‌کنند:

1. هیدروژن زدایی گروه های هیدروکسیل

| لاکتات دهیدروژناز |

COOH OVER + NADH + H + CH 3

لاکتات پیروات

اسید لاکتیک

2. هیدروژن زدایی گروه های آلدهیدی (دهیدروژناسیون گلیسرآلدئید - 3 - فسفات)

| + OVER + + H 3 RO 4 | + NADH + H +

CH 2 OPO 3 H 2 CH 2 OPO 3 H 2

گلیسرآلدئید-3-فسفات 1،3-بی فسفوگلیسریک اسید

3. هیدروژن زدایی گروه های آمینه

UNSD UNSD

CH 2 + OVER CH 2

| | + NADH + H +

CH 2 گلوتامات دهیدروژناز CH 2

اسید گلوتامیک

دهیدروژنازهای وابسته به FAD گروه های عاملی زیر را اکسید می کنند (هیدروژنه می کنند): حذف هیدروژن از گروه های -CH 2 - CH 2 - با تشکیل یک پیوند دوگانه.

UNSD UNSD

| FADH FADH 2 |

CH 2 سوکسینات دهیدروژناز CH

UNSD UNSD

فومارات سوکسینات

2. دهیدروژنازهای بی هوازی پروتون ها و الکترون ها را نه به اکسیژن، بلکه به سوبسترای دیگر منتقل می کنند. به این آنزیم ها اکسیژناز نیز می گویند.

II. ترانسفرازها آنزیم هایی هستند که انتقال گروه های مختلف از یک بستر به بستر دیگر را کاتالیز می کنند.

زیر کلاس های انتقالی:

1. آمینوترانسفرازها انتقال یک گروه آمینه از یک اسید آمینه به یک اسید کتو را انجام می دهند. واکنش ترانس آمیناسیون را کاتالیز کنید.

2. متیل ترانسفرازها انتقال گروه های متیل را کاتالیز می کنند (CH 3 -).

3. فسفوترانسفرازها انتقال باقیمانده اسید فسفریک را کاتالیز می کنند. یک زیرگروه از فسفوترانسفرازها شامل کینازهایی است که از ATP به عنوان اهداکننده باقی مانده فسفات استفاده می کنند.

III. لیازها آنزیم هایی هستند که پارگی پیوندهای C-O، C-C، C-N و سایر پیوندها و همچنین واکنش های برش برگشت پذیر گروه های مختلف را بدون مشارکت آب کاتالیز می کنند.

1. کربوکسیلاز - افزودن یک گروه کربوکسیل (CO 2).

2. دهیدراتاز - حذف یک مولکول آب از بستر.

3. آلدولازها - پیوند C-C را بشکنید.

4. هیدراتازها - آنزیم های آب روی یک پیوند دوگانه.

IV. ایزومرازها آنزیم هایی هستند که تبدیل در یک مولکول واحد را کاتالیز می کنند.

کاتالیز واکنش های ایزومریزاسیون زیرگروه ها: موتازها، توتومرازها، راسمازها، اپی مرازها، ایزومرازها.

V. هیدرالازها آنزیم هایی هستند که شکستن پیوندها را در حضور آب کاتالیز می کنند.

VI. لیگازها (سینتازها) آنزیم هایی هستند که با استفاده از انرژی پیوند فسفات ATP، اتحاد دو مولکول را کاتالیز می کنند.

تاثیر مواد کم مولکولی بر فعالیت آنزیم ها.

مواد با وزن مولکولی کم که سرعت واکنش های آنزیمی را تغییر می دهند به 2 گروه تقسیم می شوند:

1. فعال کننده - تسریع روند یک واکنش آنزیمی.

2. مهارکننده ها - روند واکنش های آنزیمی را کاهش می دهند.

فعال کننده ها به 2 گروه تقسیم می شوند:

1. می تواند به عنوان یک فعال کننده عمل کند کوآنزیم ها یا گروه پروتز(عمدتا ویتامین ها).

این گروه با همان الگوهایی که برای برهمکنش آنزیم توصیف شده است مشخص می شود و بستر F+S و A+Ko از الگوهای یکسانی تبعیت می کنند.

K m تعیین می کند که چه مقدار باید وارد شود.

2. فعال کننده هایی که رابط بین F و S (جهت گیری آنزیم و سوبسترا) هستند و برهمکنش آنزیم و بستر (F A S)، برهمکنش آپوآنزیم و کوفاکتور Apof A Ko را تضمین می کنند.

اغلب اینها یونهای Me-Co، Mn، Mg، Zn هستند.

اهمیت مهار فعالیت آنزیم

1. بازدارندگی زمینه ساز عمل داروها و عوامل سمی است.

2. بازداری یکی از رویکردهای مطالعه عمل آنزیمی (مثلاً ساختار مرکز فعال) است.

مهار دو نوع است:

1. برگشت ناپذیر

2. برگشت پذیر

مهار برگشت ناپذیر زمانی رخ می دهد که اتصال بازدارنده به آنزیم برگشت ناپذیر باشد.

به عنوان مثال: این عمل عوامل آلکیله کننده (پوداستامید) است که به طور برگشت ناپذیری بر روی گروه تیو آنزیم ها عمل می کند. برگشت ناپذیری به این دلیل است که تعادل به سمت راست منتقل می شود و به سمت تشکیل یک مشتق کووالانسی آنزیم می رود:

F-S-H + J-CH 2 CONH 2 F-S-CH 2 -CONH 2 + HJ

عملکرد ترکیبات سمی ارگانوفسفر که به آنها سم عصبی می گویند غیرقابل برگشت است، آنها استیل کولین استراز را که در انتقال تکانه های عصبی دخیل است، مهار می کنند.

مهار غیر قابل برگشت

بسیاری از مهارکننده‌ها به‌طور برگشت‌ناپذیر به E یا ES متصل می‌شوند، و از آنجایی که این روی V max تأثیر می‌گذارد، این مهار غیررقابتی در نظر گرفته می‌شود.

بازدارنده‌های این نوع اغلب به صورت کووالانسی به آنزیم یا کمپلکس آنزیم-سوبسترا متصل می‌شوند و به‌طور برگشت‌ناپذیری پیکربندی بومی را تغییر می‌دهند. این اثر سمی Hg 2 + ، Pb 2 + و ترکیبات آرسنیک را توضیح می دهد.

عمل پنی سیلین بر اساس مهار غیر قابل برگشت است. پنی سیلین از عملکرد یکی از آنزیم های دخیل در مونتاژ دیواره سلولی باکتری جلوگیری می کند. سلول هایی که دیواره سلولی ندارند به راحتی لیز می شوند.

عمل آسپرین بر اساس اصلاح کووالانسی آنزیم است. آسپرین سرعت سنتز پروستاگلاندین ها را کاهش می دهد و به عنوان یک مهارکننده جزء سیکلواکسیژناز در اندوپروکسید سنتتاز عمل می کند. اعتقاد بر این است که بروز درد، التهاب، درجه حرارت با پروستاگلاندین ها مرتبط است.

در صورت مسمومیت، اتصال سم یا جابجایی آن از مجموعه آنزیم-بازدارنده با کمک فعال کننده ها یا پادزهرها امکان پذیر است. اینها شامل تمام کمپلکس های حاوی SH (سیستئین، دیمرکاپتوپروپانول)، اسید سیتریک است.

مهار برگشت پذیر دو نوع است:

1. رقابتی

2. غیر رقابتی

مهار رقابتی برگشت پذیر - فعالیت آنزیم پس از حذف بازدارنده با افزایش غلظت سوبسترا بازیابی می شود.

ویژگی متمایز یک بازدارنده رقابتی این است که بازدارنده رقابتی از نظر ساختاری شبیه به بستر است. یک مهارکننده رقابتی با سوبسترا برای محل فعال آنزیم رقابت می کند.

مثال: سوکسینات دهیدروژناز تبدیل سوکسینات به فومارات را کاتالیز می کند. یک مهارکننده رقابتی سوکسینات دهیدروژناز اسید مالونیک است که حاوی یک گروه CH2 کمتر از سوکسینات است.

COOH COOH COOH

CH 2 CH CH 2

CH 2 CH COOH

| | اسید مالونیک

UNSD UNSD

سوکسینات و مالونیک اسید آنالوگ های ساختاری هستند و برای مکان فعال آنزیم با هم رقابت می کنند. (این تاییدی است بر این که سایت فعال یک سازند سفت و سخت و مناسب برای زیرلایه نیست، مانند یک قفل کلید.)

با مهار رقابتی، درجه مهار آنزیم به غلظت مطلق بازدارنده بستگی ندارد، بلکه به نسبت بازدارنده و سوبسترا بستگی دارد، اگر این نسبت J:S=1:50 باشد، فعالیت آنزیم توسط مهارکننده مهار می شود. 50 درصد

عمل یک بازدارنده رقابتی با افزایش غلظت سوبسترا حذف می شود، زیرا میل ترکیبی آنزیم و سوبسترا بیشتر از میل ترکیبی آنزیم و بازدارنده است.

Km F و S و Km F و J متفاوت هستند و این با ترسیم Michaelis-Menten و Lineever-Burk مشخص می شود.

Vmax - همان

Km با مهار کننده افزایش می یابد.

عمل بسیاری از عوامل شیمی درمانی مبتنی بر مهار رقابتی است. به عنوان مثال، آماده سازی سولفانیلامید که برای درمان بیماری های ناشی از عفونت های میکروبی استفاده می شود. ترکیبات سولفانیلامید از نظر ساختاری شبیه اسید p-aminobenzoic هستند. PABA یک پیش ماده در سنتز میکروبیولوژیکی اسید فولیک است که کوآنزیم از آن برای سنتز اسیدهای نوکلئیک میکروارگانیسم ها ضروری است. با معرفی فرآورده های سولفانیلامید، مهار آنزیم و مرگ میکروارگانیسم ها مشاهده می شود.

استفاده از فلوئورواوراسیل که در درمان سرطان استفاده می شود نیز بر اساس مهار رقابتی است.

مهار غیر رقابتی و برگشت پذیر.

عمل یک بازدارنده غیررقابتی را نمی توان با افزایش غلظت سوبسترا از بین برد.

مهار کننده غیر رقابتی نهبه محل فعال متصل می شود، می تواند به آنزیم آزاد، یا به کمپلکس FS یا هر دو متصل شود، اما هر دو شکل JF و JFS غیر فعال هستند.

K m - تغییر نمی کند، زیرا بدون اتصال سایت فعال

Vmax - کاهش می یابد.

رایج ترین نوع مهار غیر رقابتی تحت عمل معرف هایی رخ می دهد که به طور برگشت پذیر گروه های SH سیس واقع در مرکز کاتالیزوری یا نزدیک به آن را متصل می کنند. اینها یونهای Cu 2 + ، Hg 2 + ، Ag + و مشتقات آنها با تشکیل مرکاپتیدها هستند:

آنزیم هایی که برای فعال شدن به یون Me نیاز دارند به این ترتیب توسط عواملی که به این یون ها متصل می شوند مهار می شوند:

فرو یا فروسیانید

تنظیم فعالیت آنزیم

استفاده از آنزیم ها در داروسازی، پزشکی.

انواع تنظیم فعالیت آنزیم:

1. اصلاح آلوستریک.

2. فعال سازی زیموژن ها.

3. تنظیم با اصلاح شیمیایی.

پایان کار -

این موضوع متعلق به:

ساختار، خواص و عملکرد پروتئین ها

توضیح ساختار پروتئین ها یکی از مشکلات اصلی بیوشیمی مدرن است. مولکول های پروتئین ترکیبات مولکولی بالا هستند. بیشتر پروتئین ها دارای سطحی از سازماندهی ساختار مولکول پروتئین هستند.

اگر به مطالب اضافی در مورد این موضوع نیاز دارید یا آنچه را که به دنبال آن بودید پیدا نکردید، توصیه می کنیم از جستجو در پایگاه داده آثار ما استفاده کنید:

با مطالب دریافتی چه خواهیم کرد:

اگر این مطالب برای شما مفید بود، می توانید آن را در صفحه خود در شبکه های اجتماعی ذخیره کنید:

کار دوره

سینتیک واکنش های آنزیمی

معرفی

اساس زندگی هر موجودی فرآیندهای شیمیایی است. تقریباً تمام واکنش ها در یک موجود زنده با مشارکت بیوکاتالیست های طبیعی - آنزیم ها انجام می شود.

برزلیوس در سال 1835 برای اولین بار پیشنهاد کرد که واکنش های یک موجود زنده به دلیل نیروی جدیدی انجام می شود که او آن را "کاتالیزوری" نامید. او این ایده را عمدتاً با یک مشاهده تجربی اثبات کرد: دیاستاز حاصل از سیب زمینی نشاسته را سریعتر از اسید سولفوریک هیدرولیز می کند. کوهنه در اوایل سال 1878، ماده ای را که دارای قدرت کاتالیزوری در موجود زنده است آنزیم نامید.

سینتیک عمل آنزیم شاخه ای از مطالعات آنزیمی است که وابستگی سرعت واکنش کاتالیز شده توسط آنزیم ها را به ماهیت شیمیایی و شرایط برهمکنش سوبسترا با آنزیم و همچنین به عوامل محیطی مطالعه می کند. به عبارت دیگر، سینتیک آنزیم ها درک ماهیت مکانیسم های مولکولی اثر عوامل موثر بر سرعت کاتالیز آنزیمی را ممکن می سازد. این بخش در تقاطع علومی مانند بیوشیمی، فیزیک و ریاضیات تشکیل شد. اولین تلاش برای توصیف ریاضی واکنش های آنزیمی توسط دوکلوس در سال 1898 انجام شد.

در واقع، این بخش در مورد مطالعه آنزیم ها در زمان ما بسیار مهم است، یعنی برای پزشکی عملی. این ابزاری را به داروشناسان می دهد تا متابولیسم سلولی ، تعداد زیادی دارو و سموم مختلف را تغییر دهند - اینها مهارکننده های آنزیم هستند.

هدف از این کار بررسی وابستگی سرعت واکنش به عوامل مختلف، چگونگی کنترل سرعت واکنش و تعیین آن است.

1. سینتیک Michaelis-Menten

آزمایش‌های اولیه بر روی مطالعه سینتیک واکنش‌های آنزیمی نشان داد که سرعت واکنش، برخلاف انتظارات نظری، به غلظت آنزیم (E) و سوبسترا (S) به همان روشی که در مورد یک معمولی وجود دارد، بستگی ندارد. واکنش مرتبه دوم

براون و مستقل از او، هانری اولین کسانی بودند که فرضیه ای در مورد تشکیل کمپلکس آنزیم-سوبسترا در طول واکنش مطرح کردند. سپس این فرض با سه واقعیت تجربی تأیید شد:

الف) پاپائین یک ترکیب نامحلول با فیبرین تشکیل داد (Wurtz, 1880).

ب) ساکارز سوبسترای اینورتاز می تواند از آنزیم در برابر دناتوره شدن حرارتی محافظت کند (O'Sullivan and Thompson, 1890).

ج) نشان داده شده است که آنزیم ها کاتالیزورهای خاص استریوشیمیایی هستند (فیشر، 1898-1899).

آنها مفهوم حداکثر سرعت را معرفی کردند و نشان دادند منحنی اشباع(یعنی وابستگی سرعت واکنش به غلظت زیرلایه) یک هذلولی متساوی الساقین است. آنها ثابت کردند که حداکثر سرعت مشاهده شده یکی از مجانب منحنی است، و قطعه بر روی محور x (در ناحیه مقادیر منفی آن) توسط مجانب دوم قطع می شود، یعنی. ثابت در معادله سرعت، در مقدار مطلق برابر با غلظت بستر مورد نیاز برای دستیابی به نیمی از حداکثر سرعت.

مایکلیس و منتن پیشنهاد کردند که سرعت واکنش با تجزیه کمپلکس ES تعیین می‌شود، یعنی. ثابت k 2 . این فقط در شرایطی امکان پذیر است که k 2 کوچکترین ثابت نرخ است. در این حالت تعادل بین کمپلکس آنزیم- سوبسترا، آنزیم آزاد و سوبسترا در مقایسه با سرعت واکنش (تعادل سریع) به سرعت برقرار می شود.

سرعت واکنش اولیه را می توان با فرمول زیر بیان کرد:

v = k2

از آنجایی که ثابت تفکیک کمپلکس آنزیم- سوبسترا است

K S \u003d [E] [S] / \u003d k -1 / k 1

سپس غلظت آنزیم آزاد را می توان به صورت بیان کرد

[E]=K S / [S]

غلظت کل آنزیم در مخلوط واکنش با فرمول تعیین می شود

[E] t = [E] + [ES] = K S [ES] / [S] + [ES]

واکنش زمانی به حداکثر سرعت خود می رسد که غلظت سوبسترا به اندازه کافی بالا باشد به طوری که تمام مولکول های آنزیم به شکل یک کمپلکس ES (بی نهایت زیاد سوبسترا) باشند. نسبت سرعت اولیه به حداکثر سرعت ممکن تئوری برابر است با نسبت [ES] به [E] t:

v / V max = / [E] t = / (K S / [S] + ) = 1 / (K S + [S] +1)

این معادله کلاسیک است مایکلیسو منتن،که از زمان انتشار آن در سال 1913، برای چندین دهه اصل اساسی تمام مطالعات سینتیکی آنزیم بوده و با برخی محدودیت‌ها، تا به امروز باقی مانده است.

بعداً نشان داده شد که معادله اصلی مایکلیس-منتن دارای چندین محدودیت است. منصفانه است، یعنی سینتیک واکنش کاتالیز شده توسط این آنزیم را فقط در صورتی به درستی توصیف می کند که همه شرایط محدود کننده زیر رعایت شوند:

) یک کمپلکس آنزیم-سوبسترا از نظر جنبشی پایدار تشکیل می شود.

) ثابت K S ثابت تفکیک کمپلکس آنزیم-سوبسترا است: این تنها در صورتی صادق است که ;

) غلظت سوبسترا در طول واکنش تغییر نمی کند، یعنی. غلظت بستر آزاد برابر با غلظت اولیه آن است.

) محصول واکنش به سرعت از آنزیم جدا می شود، یعنی. هیچ مقدار جنبشی قابل توجهی از کمپلکس ES تشکیل نمی شود.

) مرحله دوم واکنش برگشت ناپذیر است. به طور دقیق تر، ما فقط سرعت اولیه را در نظر می گیریم، زمانی که واکنش برگشتی (به دلیل کمبود واقعی محصول) هنوز نادیده گرفته شود.

) تنها یک مولکول سوبسترا به هر محل فعال آنزیم متصل می شود.

) برای همه واکنش دهنده ها می توان از غلظت آنها به جای فعالیت استفاده کرد.

معادله Michaelis-Menten به عنوان نقطه شروع برای هرگونه توصیف کمی از عملکرد آنزیم ها عمل می کند. باید تاکید کرد که رفتار جنبشی بیشتر آنزیم‌ها بسیار پیچیده‌تر از آن چیزی است که از طرح ایده‌آلی زیربنای معادله Michaelis-Menten به دست می‌آید. در استخراج این معادله فرض بر این است که تنها یک کمپلکس آنزیم-سوبسترا وجود دارد. در همین حال، در واقعیت، در اکثر واکنش های آنزیمی، حداقل دو یا سه کمپلکس از این قبیل تشکیل می شود که در یک توالی مشخص به وجود می آیند.

در اینجا EZ کمپلکس مربوط به حالت گذار واقعی را نشان می‌دهد و EP نشان‌دهنده کمپلکس بین آنزیم و محصول واکنش است. همچنین می توان به این نکته اشاره کرد که در اکثر واکنش های آنزیمی به ترتیب بیش از یک سوبسترا درگیر و دو یا چند محصول تشکیل می شود. در واکنش با دو سوبسترا، S 1 و S 2، می توان سه کمپلکس آنزیم - سوبسترا به نام های ES 1، ES 2 و ES 1 S 2 تشکیل داد. اگر واکنش دو محصول P 1 و P 2 تولید کند، ممکن است حداقل سه کمپلکس اضافی EP 1، EP 2 و EP 1 P 2 وجود داشته باشد. در چنین واکنش هایی، مراحل میانی زیادی وجود دارد که هر کدام با ثابت سرعت خاص خود مشخص می شوند. تجزیه و تحلیل جنبشی واکنش های آنزیمی شامل دو یا چند واکنش دهنده اغلب بسیار پیچیده است و نیاز به استفاده از رایانه های الکترونیکی دارد. با این حال، هنگام تجزیه و تحلیل سینتیک تمام واکنش های آنزیمی، نقطه شروع همیشه معادله Michaelis-Menten است که در بالا مورد بحث قرار گرفت.

1.1 ماهیت ثابتکدر معادله

معادله سینتیک واکنش آنزیمی

فرض دوم بیان می کند که ثابت K S در معادله ثابت تفکیک کمپلکس آنزیم- سوبسترا است.

بریگز و هالدن در سال 1925 ثابت کردند که معادله اصلی مایکلیس-منتن فقط برای , یعنی. زمانی که تعادل مرحله ابتدایی E+S ES در مقایسه با سرعت مرحله بعدی خیلی سریع برقرار می شود. بنابراین، چنین مکانیسم های جنبشی (اطاعت از شرط اولیه Michaelis-Menten و داشتن یک مرحله ابتدایی آهسته، که با توجه به آن تعادل در تمام مراحل ابتدایی دیگر به سرعت برقرار می شود) راضی کننده فرض "تعادل سریع" نامیده می شود. اما اگر k 2 به ترتیب قدر با k -1 قابل مقایسه باشد , تغییر در غلظت کمپلکس آنزیم- سوبسترا در طول زمان را می توان با معادله دیفرانسیل زیر بیان کرد:

d / dt \u003d k 1 [E] [S] - k -1 - k 2

از آنجایی که ما سرعت واکنش اولیه را در نظر می گیریم، یعنی. لحظه ای که واکنش معکوس هنوز رخ نداده است و مرحله پیش ایستایی قبلاً سپری شده است، به دلیل وجود بیش از حد بستر، مقدار کمپلکس آنزیم-سوبسترای تشکیل شده برابر با مقدار تجزیه شده است. (اصل ایستایی یا سینتیک بریگز و هالدن یا اصل بودنشتاین در سینتیک شیمیایی) و درست است که

d/dt=0

با جایگزینی آن در معادله دیفرانسیل، عبارتی برای غلظت آنزیم آزاد به دست می آوریم:

[E] \u003d (k -1 + k 2) / k 1 [S]

[E] T = [E] + = [(k -1 + k 2) / k -1 [S] + 1] =

= (k -1 + k 2 + k -1 [S]) / k 1 [S]

معادله حالت پایدار:

K 1 [S] [E] T / (k -1 + k 2 + k 1 [S])

زیرا v = k 2 ، سپس آن را دریافت می کنیم

v = k 1 k 2 [S] [E] T / (k -1 + k 2 + k 1 [S]) = k 2 [S] [E] T / [(k -1 + k 2) / k 1 + [S]]

در این مورد

V max = k 2 [E] T

و برابر است با حداکثر سرعت به دست آمده از معادله Michaelis-Menten. با این حال، ثابت در مخرج معادله Michaelis-Menten K S نیست , آن ها نه ثابت تفکیک مجتمع آنزیم-سوبسترا، بلکه به اصطلاح ثابت مایکلیس:

K m \u003d (k -1 + k 2) / k 1

K m برابر با K S فقط در صورتی است که .

در صورتی که ثابت در مخرج معادله سرعت با فرمول بیان می شود

K k \u003d k 2 / k 1

و به گفته ون اسلایک نامیده می شود ثابت جنبشی

معادله حالت پایدار را می توان از معادله دیفرانسیل نیز بدون این فرض که d / dt = 0 به دست آورد. اگر مقدار [E] = [E] T - را جایگزین معادله دیفرانسیل کنیم، پس از تبدیل ها به دست می آید.

= (k 1 [S] [E] T - d / dt) / (k 1 [S] + k -1 + k 2)

برای به دست آوردن معادله حالت پایدار از این معادله، لازم نیست d / dt = 0 باشد. کافی است که نابرابری d / dt باشد.<< k 1 [S] [E] T . Этим объясняется, почему можно достичь хорошего приближения в течение длительного времени при использовании принципа стационарности.

معادله حالت پایدار متمایز به صورت زیر است:

d / dt \u003d T / (k 1 [S] + k -1 + k 2) 2] (d [S] / dt)

این عبارت بدیهی است که برابر با 0 نیست.

1.2 تبدیل معادله Michaelis-Menten

معادله اصلی Michaelis-Menten یک معادله هذلولی است که در آن یکی از ثابت ها (V max) مجانب منحنی است. ثابت دیگر (Km) که مقدار منفی آن توسط مجانب دوم تعیین می شود، برابر با غلظت بستر مورد نیاز برای دستیابی به V max / 2 است. تأیید این امر آسان است، زیرا اگر

v=Vmax / 2، سپس

Vmax / 2 = Vmax [S] / (Km + [S])

V max / V max = 1 = 2 [S] / (K m + [S]) m + [S] = 2 [S]، یعنی. [S] = K m برای v = V max /2.

معادله Michaelis-Menten را می توان از نظر جبری به اشکال دیگری تبدیل کرد که برای نمایش گرافیکی داده های تجربی راحت تر است. یکی از متداول‌ترین تبدیل‌ها، معادل کردن دو طرف چپ و راست معادله است.

در نتیجه تبدیل، عبارت را به دست می آوریم

که این نام را یدک می کشد معادلات لاین ویور-برک. بر اساس این معادله، نموداری که در مختصات 1/[S] و 1/v رسم می‌شود، خطی مستقیم است که شیب آن برابر با Km/V max و قطعه قطع شده روی محور y برابر است. حداکثر تا 1/V چنین نمودار متقابل دوگانه این مزیت را دارد که تعیین V max را با دقت بیشتری امکان پذیر می کند. در یک منحنی ترسیم شده در مختصات [S] و v، V max یک کمیت مجانبی است و با دقت بسیار کمتری تعیین می شود. قطعه قطع شده روی محور x در نمودار Lineweaver-Burk برابر با -1/Km است. اطلاعات ارزشمندی در مورد مهار آنزیم نیز از این نمودار قابل استخراج است.

تبدیل دیگر معادله Michaelis-Menten این است که هر دو طرف معادله Lineweaver-Burk در V max *v ضرب می شوند و پس از چند تبدیل اضافی به دست می آوریم.

نمودار مربوطه در مختصات v و ​​v/[S] نشان دهنده با است e 4، شکل. یکی]. چنین نموداری ( نمودار Edie-Hofsty) نه تنها به راحتی مقادیر V max و Km را تعیین می کند، بلکه به شما امکان می دهد انحرافات احتمالی از خطی بودن را که در نمودار Lineweaver-Burk شناسایی نمی شوند، شناسایی کنید.

معادله را می توان به شکل دیگری نیز خطی کرد

[S] / v = K m / V حداکثر + [S] / V حداکثر

در این مورد، وابستگی [S] / v به [S] باید ساخته شود. شیب خط مستقیم حاصل حداکثر 1/V است. قطعات بریده شده بر روی محور ارتین و آبسیسا به ترتیب برابر با (K m / V max) و (- Km) است. این نمودار به نام نویسنده نامگذاری شده است نمودار هاینز.

تجزیه و تحلیل آماری نشان داده است که روش های ادی هافستی و هاینس نتایج دقیق تری نسبت به روش Lineweaver-Burk ارائه می دهند. دلیل این امر این است که در نمودارهای Edie - Hofstee و Haynes، هر دو متغیر وابسته و مستقل در مقادیر رسم شده در هر دو محور مختصات گنجانده شده اند.

1.3 اثر غلظت سوبسترا بر سینتیک واکنش

در بسیاری از موارد، شرط غلظت ثابت بستر برآورده نمی شود. از یک طرف، در واکنش آزمایشگاهی با برخی از آنزیم‌ها، به دلیل ممانعت اغلب از فعالیت آنزیمی سوبسترا، از مقدار اضافی سوبسترا استفاده نمی‌شود. در این مورد، تنها غلظت بهینه آن می تواند مورد استفاده قرار گیرد، و این همیشه مازاد بستر لازم برای برآوردن معادلات جنبشی مکانیسم های مورد بحث در بالا را فراهم نمی کند. علاوه بر این، در سلول in vivo، مازاد سوبسترای مورد نیاز برای انجام این شرایط معمولاً به دست نمی آید.

در واکنش‌های آنزیمی که سوبسترا بیش از حد نیست و در نتیجه غلظت آن در طول واکنش تغییر می‌کند، ثابت تفکیک کمپلکس آنزیم- سوبسترا است.

K S = ([S] 0 - - [P]) [E] T - )/

([S] 0 - غلظت سوبسترا در t = 0). در این حالت، سرعت واکنش اولیه (در حالت پایدار) با استفاده از

v= V max / (K m + )

غلظت زیرلایه در یک نقطه از زمان کجاست.

با این حال، می توان برای دو مورد که [S] o = : یک راه حل تقریبی نوشت:

) اگر این نابرابری به دلیل مقادیر زیاد t برآورده شود، یعنی. هنگامی که بیش از 5٪ از غلظت اولیه بستر در طول واکنش مصرف شد.

) اگر غلظت آنزیم را نمی توان در مقایسه با غلظت سوبسترا نادیده گرفت و بنابراین باید غلظت کمپلکس آنزیم - سوبسترا را در نظر گرفت.

اگر t بزرگ باشد و غلظت آن در مقایسه با [S] 0 ناچیز باشد، آنگاه معادله ثابت تفکیک کمپلکس آنزیم-سوبسترا به صورت زیر در می‌آید:

K S = ([S] 0 - [P]) ([E] T - ) /

برای مقدار غلظت، که در طول واکنش تغییر می کند، مقدار ([S] 0 + )/2 به عنوان یک تقریب رضایت بخش عمل می کند. از آنجایی که = [S] 0 - [P]، سرعت متوسط. را می توان به صورت بیان کرد

جایگزینی این عبارت و مقدار تقریبی در

v= V max / (K m +)،

ما گرفتیم:

هنگام مقایسه مقادیر محاسبه شده بر اساس این تقریب با مقادیر به دست آمده از معادله دقیق و یکپارچه Michaelis-Menten، مشخص می شود که خطا در تعیین Km در هنگام مصرف 30 و 50 درصد از بستر به ترتیب 1 و 4 درصد است. بنابراین، خطا در این تقریب در مقایسه با خطای اندازه گیری ناچیز است.

هنگامی که مصرف سوبسترا از 5% غلظت اولیه تجاوز نمی کند، اما غلظت آنزیم آنقدر زیاد است که در مقایسه با [S] 0، نمی توان آن را نادیده گرفت، ثابت تفکیک کمپلکس آنزیم- بستر برابر است. به:

K s = ([S] 0 - ) ([E] T - ) /

راه حل او در مورد می دهد

از بین دو راه حل ممکن، تنها جواب منفی را می توان انتخاب کرد، زیرا فقط آن شرایط اولیه را برآورده می کند: = 0 در [S] 0 = 0 یا [E] T = 0. بر اساس قیاس با معادله نسبت v/V. حداکثر، معادله سرعت اولیه را به دست آورده ایم. معادله درجه دوم به دست آمده از معادله ثابت تفکیک مجتمع آنزیم-سوبسترا، که دقیقاً در بالا یافت می شود، با استفاده از فرمول های v \u003d k 2 و V max \u003d k 2 [E] T، می تواند به شکل زیر کاهش یابد:

[S] 0 V max / V = ​​K s V max / (V max - V) + [E] T

دو مورد محدود کننده باید در نظر گرفته شود. در مورد اول [S]<

v = (Vmax / Km) [S] = k[S]

بنابراین، ما واکنش مرتبه اول ظاهری و k=V max /K m - ثابت جنبشی مرتبه اول ظاهری را به دست آورده‌ایم. بعد واقعی آن زمان -1 است، اما ترکیبی از ثابت های سرعت مرتبه اول و دوم چندین مرحله ابتدایی است، به عنوان مثال. k 1 k 2 [E] T /(k -1 + k 2) . تحت شرایط ظاهری مرتبه اول k اندازه گیری پیشرفت واکنش است.

مورد محدود کننده دیگر: [S] >> K m در اینجا ثابت K m در مقایسه با [S] ناچیز است، و بنابراین ما v = V max را دریافت می کنیم.

1.4 تشکیل یک کمپلکس آنزیم-محصول از نظر جنبشی پایدار

اگر در طی واکنش یک کمپلکس آنزیم-محصول از نظر جنبشی پایدار تشکیل شود، مکانیسم واکنش به شرح زیر است:

با استفاده از فرض حالت پایدار، می توانیم معادلات دیفرانسیل را بنویسیم:

d / dt = k 1 [E] [S] + k -2 - (k -1 + k 2) = 0 / dt = k 2 - (k -2 + k 3) = 0

از این معادلات نتیجه می شود که

= [(k -2 + k 3) / k 2]

[E] = [(k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 k 2 [S]]

از آنجایی که v = k 3

و [E] T = [E] + + =

= [(k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 k 2 [S] + (k -2 + k 3) / k 2 + 1] =

= ( (k -2 + k 3) + k 1 k 2 [S]] / k 1 k 2 [S])

ما گرفتیم

K 1 k 2 [S] [E] T / (k -2 + k 3 + k 2)] = k 1 k 2 k 3 [S] [E] T / (k -2 + k 3 + k 2) ]=

= [E] T [S] / [(k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 (k -2 + k 3 + k 2) + [S]]

به این معنا که

V max \u003d [E] Tm \u003d (k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 (k -2 + k 3 + k 2)

در این مورد، محاسبه مقادیر خاص ثابت های نرخ فردی بسیار دشوار است، زیرا فقط نسبت آنها را می توان مستقیماً اندازه گیری کرد. زمانی که مکانیسم واکنش آنزیمی پیچیده‌تر می‌شود، زمانی که بیش از دو کمپلکس در واکنش شرکت می‌کنند، وضعیت پیچیده‌تر می‌شود، زیرا تعداد ثابت‌های سرعت در معادله طبیعتاً بسیار بیشتر است و نسبت‌های آنها نیز پیچیده‌تر است.

با این حال، اگر پس از واکنش برگشت پذیر تشکیل اولین کمپلکس، مراحل ابتدایی بعدی غیرقابل برگشت باشد، وضعیت ساده می شود. نمایندگان مهم آنزیم هایی که از این مکانیسم پیروی می کنند، آنزیم های پروتئولیتیک و استرازها هستند. مکانیسم واکنش آنها را می توان به صورت زیر نوشت:

که در آن ES یک واسطه آنزیم آسیل است که در مواجهه با آب تجزیه می شود. ما میتوانیم بنویسیم

V max \u003d k 2 k 3 [E] 0 / (k 2 + k 3) \u003d k cat [E] 0m \u003d k 3 (k -1 + k 2) / (k 2 + k 3) k 1 گربه / K m \u003d k 2 k 1 / (k -1 + k 2) \u003d k 2 / k m '

ثابت Michaelis مرحله اسیلاسیون Km "K s است. هر چه نسبت k cat / K m بیشتر باشد، ویژگی بستر بالاتر است.

تعیین ثابت ها بسیار ساده می شود اگر آزمایش در حضور یک عامل هسته دوست (N) که قادر به رقابت با آب است انجام شود. سپس

k 3 \u003d k 3' و P i (i \u003d 1، 2، 3) محصولات هستند.

vi = k گربه، i [S] / (K m + [S]) گربه، 1 = k 2 (k 3 + k 4 [N]) / (k 2 + k 3 + k 4 [N]) گربه، 2 = k 2 k 3 / (k 2 + k 3 + k 4 [N]) گربه، 3 = k 2 k 4 [N] / (k 2 + k 3 + k 4 [N]) m = K s ( k 3 + k 4 [N]) / (k 2 + k 3 + k 4 [N])

/v N = K s (k 3 + k 4 [N]) / k 2 k 3 [S] + (k 2 + k 3 + k 4 [N]) / k 2 k 3

از آنجایی که مشخص است که K s / k 2 = K m / k گربه، و اگر هسته دوست وجود نداشته باشد، پس

1/v = K s / k 2 [S] + (k 2 + k 3) / k 2 k 3

و برای تعیین ثابت ها می توان از نقطه تقاطع خطوط در مختصات 1/v N (و 1/v) - 1/[S] استفاده کرد. دو خط مستقیم در مختصات معکوس دوگانه در ربع دوم قطع می شوند. در غیاب یک هسته دوست، نقطه تلاقی خط با محور عمودی به صورت 1/V max و 1/k cat و با محور افقی به صورت -1/Km تعریف می شود. مختصات نقطه تقاطع دو خط: -1/K s و 1/k 3 . فاصله بین 1/V max و 1/k 3 1/k2 است.

1.5 تجزیه و تحلیل منحنی جنبشی کامل واکنش

معادله Michaelis - Menten در شکل اصلی خود فقط به واکنش های برگشت ناپذیر اشاره دارد، یعنی. به واکنش هایی که فقط سرعت اولیه در نظر گرفته می شود و واکنش معکوس به دلیل مقدار ناکافی محصول ظاهر نمی شود و بر سرعت واکنش تأثیر نمی گذارد. در مورد یک واکنش برگشت ناپذیر، منحنی جنبشی کامل را می توان به راحتی آنالیز کرد (برای یک بازه زمانی دلخواه t ), ادغام معادله اصلی Michaelis-Menten. بنابراین، در این مورد، این فرض باقی می ماند که تنها یک کمپلکس میانی آنزیم- سوبسترا در جریان واکنش تشکیل می شود. از آنجایی که برای بازه زمانی t هیچ محدودیتی وجود ندارد، غلظت بستر در زمان تجزیه و تحلیل نمی تواند برابر با غلظت اولیه معرفی شده باشد. بنابراین، همچنین لازم است که تغییر [S] در طول واکنش در نظر گرفته شود. فرض کنید S 0 غلظت اولیه زیرلایه باشد (S 0 - y ) - تمرکز در زمان t . سپس، بر اساس معادله اصلی Michaelis-Menten (اگر y مقدار زیرلایه تبدیل شده است)، می توانیم بنویسیم

dy / dt \u003d V max (S 0 - y) / (K m + S 0 - y)

با گرفتن حرکات متقابل و تقسیم متغیرها، روی y ادغام می کنیم بین 0 و y (V max به صورت نشان داده شده است V):

(2.303 / تن) lg = V / Km - (1 / Km) (y / t)

بنابراین، با ترسیم وابستگی سمت چپ معادله به y / t (مختصات فاستر-نیمان) , دریافت یک خط مستقیم با شیب (-1/Km) , قطعه برش در محور y (V/K m) , و در محور آبسیسا - قطعه V. معادله انتگرال را می توان به روش دیگری خطی کرد:

t / 2.3031 lg = y / 2.303 V lg + Km / V

یا t/y = 2.3031 Km Lg / V y +1/V

اگر در حال مطالعه یک واکنش برگشت پذیر هستیم، باید توجه داشت که با چه بازه زمانی سروکار داریم. در لحظه اختلاط آنزیم با بستر، به اصطلاح فاز پیش ایستا شروع می شود که چندین میکرو یا میلی ثانیه طول می کشد و در طی آن کمپلکس های آنزیم- بستر مربوط به حالت ساکن تشکیل می شود. در مطالعه واکنش‌های برگشت‌پذیر در فواصل زمانی کافی، این مرحله نقش مهمی ایفا نمی‌کند، زیرا در این مرحله واکنش در هیچ یک از جهت‌ها با سرعت کامل پیش نمی‌رود.

برای واکنشی که از چپ به راست ادامه می‌یابد، کمپلکس‌های سوبسترای آنزیم درگیر در واکنش به غلظت محدودکننده سرعت فقط در پایان مرحله پیش‌استیشن می‌رسند. حالت شبه ساکن, که در آن غلظت کمپلکس‌های آنزیم سوبسترای تعیین‌کننده سرعت به حداکثر مقادیر غلظت در حالت پایدار نزدیک می‌شود، چند دهم ثانیه یا یک ثانیه طول می‌کشد. در طول این مرحله، سرعت تشکیل محصول (یا مصرف بستر) از نظر زمانی تقریباً خطی است. از نظر تئوری، تشکیل محصول هنوز در اینجا رخ نداده است، اما در عمل غلظت آن به قدری کم است که سرعت واکنش معکوس بر سرعت واکنش مستقیم تأثیر نمی گذارد. این فاز خطی را سرعت واکنش اولیه می نامند و تا کنون فقط آن را در نظر گرفته ایم.

واکنش از راست به چپ در فاز بعدی نیز به دلیل افزایش تدریجی غلظت محصول تسریع می شود. (وضعیت گذار؛خطی بودن مشاهده شده تا کنون در زمان ناپدید می شود). این مرحله تا زمانی ادامه می یابد که سرعت واکنش از چپ به راست با سرعت واکنش از راست به چپ برابر شود. این دولت است تعادل پویا،زیرا واکنش در هر دو جهت با سرعت یکسان ادامه می یابد.

2. عواملی که سرعت واکنش آنزیمی به آنها بستگی دارد

.1 وابستگی سرعت واکنش آنزیمی به دما

با افزایش دمای محیط، سرعت واکنش آنزیمی افزایش می یابد و در دمای بهینه به حداکثر می رسد و سپس به صفر می رسد. برای واکنش های شیمیایی، قانونی وجود دارد که با افزایش دما به میزان 10 درجه سانتیگراد، سرعت واکنش دو تا سه برابر افزایش می یابد. برای واکنش های آنزیمی، این ضریب دما کمتر است: برای هر 10 درجه سانتیگراد، سرعت واکنش 2 یا حتی کمتر افزایش می یابد. کاهش بعدی در سرعت واکنش به صفر نشان دهنده دناتوره شدن بلوک آنزیمی است. مقادیر دمای بهینه برای اکثر آنزیم ها در محدوده 20 تا 40 درجه سانتیگراد است. حرارت پذیری آنزیم ها با ساختار پروتئین آنها مرتبط است. برخی از آنزیم ها قبلاً در دمای حدود 40 درجه سانتیگراد دناتوره شده اند، اما بیشتر آنها در دمای بالای 40 - 50 درجه سانتیگراد غیرفعال می شوند. برخی از آنزیم ها در اثر سرما غیرفعال می شوند. در دمای نزدیک به 0 درجه سانتیگراد، دناتوره شدن رخ می دهد.

افزایش دمای بدن (تب) واکنش های بیوشیمیایی کاتالیز شده توسط آنزیم ها را تسریع می کند. به راحتی می توان محاسبه کرد که افزایش دمای بدن برای هر درجه سرعت واکنش را حدود 20٪ افزایش می دهد. در دمای بالای 39-40 درجه سانتیگراد، استفاده بیهوده از سوبستراهای درون زا در سلولهای یک ارگانیسم بیمار برای پر کردن مجدد دریافتی آنها با غذا ضروری است. علاوه بر این، در دمای حدود 40 درجه سانتیگراد، برخی از آنزیم های بسیار حساس به حرارت می توانند دناتوره شوند، که روند طبیعی فرآیندهای بیوشیمیایی را مختل می کند.

دمای پایین باعث غیرفعال شدن برگشت پذیر آنزیم ها به دلیل تغییر جزئی در ساختار فضایی آن می شود، اما برای برهم زدن پیکربندی مربوطه مرکز فعال و مولکول های بستر کافی است.

2.2 وابستگی سرعت واکنش به pH محیط

برای اکثر آنزیم ها، مقدار pH خاصی وجود دارد که در آن فعالیت آنها حداکثر است. بالاتر و کمتر از این مقدار pH، فعالیت این آنزیم ها کاهش می یابد. با این حال، در همه موارد منحنی‌هایی که وابستگی فعالیت آنزیم به pH را توصیف می‌کنند، زنگ‌شکل نیستند. گاهی اوقات این وابستگی را می توان مستقیماً نیز بیان کرد. وابستگی سرعت واکنش آنزیمی به pH عمدتاً وضعیت گروه های عملکردی مرکز فعال آنزیم را نشان می دهد. تغییر pH محیط بر یونیزاسیون گروه‌های اسیدی و بازی بقایای اسید آمینه مرکز فعال تأثیر می‌گذارد که یا در اتصال بستر (در ناحیه تماس) و یا در تبدیل آن (در ناحیه کاتالیزوری) نقش دارند. بنابراین، اثر خاص pH می‌تواند به دلیل تغییر در میل ترکیبی سوبسترا به آنزیم، یا تغییر در فعالیت کاتالیزوری آنزیم یا هر دو ایجاد شود.

اکثر بسترها دارای گروه های اسیدی یا بازی هستند، بنابراین pH بر درجه یونیزه شدن بستر تأثیر می گذارد. آنزیم ترجیحاً به شکل یونیزه یا غیریونیزه سوبسترا متصل می شود. بدیهی است که در pH بهینه، هر دو گروه عاملی مرکز فعال در واکنش پذیرترین حالت هستند و سوبسترا به شکلی است که برای اتصال توسط این گروه های آنزیم ترجیح داده می شود.

هنگام ساخت منحنی هایی که وابستگی فعالیت آنزیم به pH را توصیف می کنند، اندازه گیری در تمام مقادیر pH معمولاً در شرایط اشباع آنزیم با بستر انجام می شود، زیرا مقدار Km برای بسیاری از آنزیم ها با pH تغییر می کند.

منحنی که وابستگی فعالیت آنزیم به pH را مشخص می‌کند می‌تواند در مواردی که آنزیم بر روی بسترهای خنثی الکترواستاتیکی یا بسترهایی که در آن گروه‌های باردار نقش مهمی در عمل کاتالیزوری ندارند، عمل می‌کند، شکل ساده‌ای داشته باشد. نمونه ای از این آنزیم ها پاپائین و همچنین اینورتاز است که هیدرولیز مولکول های ساکارز خنثی را کاتالیز می کند و فعالیت ثابتی را در محدوده pH 3.0-7.5 حفظ می کند.

مقدار pH مربوط به حداکثر فعالیت آنزیم لزوماً با مقدار pH مشخصه محیط طبیعی درون سلولی این آنزیم منطبق نیست. مورد دوم می تواند هم بالاتر و هم پایین تر از pH بهینه باشد. این نشان می دهد که اثر pH بر فعالیت آنزیم ممکن است یکی از عوامل مسئول تنظیم فعالیت آنزیمی در سلول باشد. از آنجایی که سلول حاوی صدها آنزیم است و هر یک از آنها واکنش های متفاوتی به تغییرات pH نشان می دهند، مقدار pH داخل سلول شاید یکی از عناصر مهم در سیستم پیچیده تنظیم متابولیسم سلولی باشد.

2.3 تعیین مقدار آنزیم با فعالیت آن

استوکیومتری کل واکنش کاتالیز شده.

) نیاز احتمالی به کوفاکتورها - در یون های فلزی یا کوآنزیم ها.

) وابستگی فعالیت آنزیم به غلظت سوبسترا و کوفاکتور، یعنی. مقادیر Km هم برای بستر و هم برای کوفاکتور؛

) مقدار pH مربوط به حداکثر فعالیت آنزیم.

) محدوده دمایی که آنزیم در آن پایدار است و فعالیت بالایی را حفظ می کند.

علاوه بر این، لازم است برخی از تکنیک های تحلیلی نسبتاً ساده را در اختیار داشته باشید که به شما امکان می دهد میزان ناپدید شدن بستر یا سرعت ظاهر محصولات واکنش را تعیین کنید.

در صورت امکان، تجزیه و تحلیل آنزیم تحت شرایط استاندارد انجام می شود که pH بهینه را حفظ می کند و غلظت سوبسترا را بالاتر از غلظت اشباع حفظ می کند. در این حالت، سرعت اولیه مربوط به مرتبه صفر واکنش نسبت به بستر است و تنها با غلظت آنزیم متناسب است. برای آنزیم هایی که به کوفاکتور، یون فلز یا کوآنزیم نیاز دارند، غلظت این کوفاکتورها نیز باید از غلظت اشباع بیشتر شود تا غلظت آنزیم عامل محدود کننده سرعت باشد. به طور کلی، اندازه گیری سرعت تشکیل محصول واکنش را می توان با دقت بیشتری نسبت به اندازه گیری سرعت ناپدید شدن بستر انجام داد، زیرا بستر به طور کلی باید در غلظت های نسبتاً بالایی برای حفظ سینتیک مرتبه صفر وجود داشته باشد. سرعت تشکیل محصول (یا محصولات) واکنش را می توان با روش های شیمیایی یا طیف فتومتری اندازه گیری کرد. روش دوم راحت تر است، زیرا به شما امکان می دهد به طور مداوم روند واکنش را روی کنه ضبط کننده ضبط کنید.

طبق توافق بین‌المللی، واحد فعالیت آنزیمی مقدار آنزیمی است که قادر به تبدیل یک میکرومول از سوبسترا در دقیقه در دمای 25 درجه سانتی‌گراد در شرایط بهینه است. فعالیت خاصآنزیم تعداد واحدهای فعالیت آنزیمی در 1 میلی گرم پروتئین است. این مقدار به عنوان معیاری برای خلوص آماده سازی آنزیم استفاده می شود. با خالص شدن آنزیم افزایش می یابد و به حداکثر مقدار خود برای یک آماده سازی خالص ایده آل می رسد. زیر تعداد انقلابدر شرایطی که سرعت واکنش توسط غلظت آنزیم محدود می‌شود، تعداد مولکول‌های سوبسترا را که در واحد زمان در هر یک مولکول آنزیم (یا در هر مرکز فعال) تغییر شکل می‌دهند، درک کنید.

2.4 فعال سازی آنزیم

تنظیم آنزیم ها را می توان با برهمکنش اجزای مختلف بیولوژیکی یا ترکیبات خارجی (مثلاً داروها و سموم) با آنها انجام داد که معمولاً به آنها گفته می شود. اصلاح کننده هایا تنظیم کننده ها آنزیم هاتحت تأثیر اصلاح کننده ها بر روی آنزیم، واکنش می تواند تسریع شود (فعال کننده) یا کند شود. (مهارکننده ها).

فعال شدن آنزیم ها با تسریع واکنش های بیوشیمیایی که پس از عمل اصلاح کننده رخ می دهد تعیین می شود. یک گروه از فعال کننده ها شامل موادی هستند که بر ناحیه محل فعال آنزیم تأثیر می گذارند. اینها شامل کوفاکتورها و سوبستراهای آنزیمی است. کوفاکتورها (یون های فلزی و کوآنزیم ها) نه تنها عناصر ساختاری اجباری آنزیم های پیچیده هستند، بلکه اساساً فعال کننده های آنها نیز هستند.

یون های فلزی فعال کننده های کاملاً خاصی هستند. اغلب، برخی از آنزیم ها به یون های نه یک، بلکه چندین فلز نیاز دارند. به عنوان مثال، برای Na +، K + -ATPase که کاتیون های تک ظرفیتی را از طریق غشای سلولی منتقل می کند، یون های منیزیم، سدیم و پتاسیم به عنوان فعال کننده ضروری هستند.

فعال سازی با کمک یون های فلزی با مکانیسم های مختلفی انجام می شود. در برخی از آنزیم ها بخشی از سایت کاتالیزوری هستند. در برخی موارد، یون های فلزی اتصال سوبسترا به مرکز فعال آنزیم را تسهیل می کنند و نوعی پل را تشکیل می دهند. اغلب، فلز نه با آنزیم، بلکه با سوبسترا ترکیب می‌شود و یک کمپلکس فلز- بستر تشکیل می‌دهد که برای عملکرد آنزیم ترجیح داده می‌شود.

ویژگی مشارکت کوآنزیم ها در اتصال و کاتالیز سوبسترا، فعال شدن واکنش های آنزیمی توسط آنها را توضیح می دهد. اثر فعال کننده کوفاکتورها به ویژه در هنگام اثر بر روی آنزیمی که از کوفاکتورها اشباع نشده است قابل توجه است.

این بستر همچنین یک فعال کننده در محدوده غلظت شناخته شده است. پس از رسیدن به غلظت های اشباع سوبسترا، فعالیت آنزیم افزایش نمی یابد. سوبسترا پایداری آنزیم را افزایش می دهد و تشکیل ترکیب مورد نظر در محل فعال آنزیم را تسهیل می کند.

یون های فلزی، کوآنزیم ها و پیش سازها و آنالوگ های فعال آنها،

سوبستراها را می توان در عمل به عنوان آماده سازی هایی که آنزیم ها را فعال می کنند استفاده کرد.

فعال شدن برخی از آنزیم ها را می توان با تغییراتی انجام داد که بر مرکز فعال مولکول های آنها تأثیر نمی گذارد. چندین تغییر ممکن است:

1) فعال سازی یک سلف غیرفعال - پروآنزیم،یا زیموژن. به عنوان مثال، تبدیل پپسینوژن به پپسین ;

2) فعال سازی با اتصال هر گروه اصلاح کننده خاص به مولکول آنزیم.

3) فعال شدن با تفکیک یک پروتئین پیچیده غیر فعال - آنزیم فعال.

2.5 مهار آنزیم

معرف هایی وجود دارند که می توانند کم و بیش به طور خاص با یک یا آن زنجیره جانبی پروتئین ها تعامل داشته باشند که منجر به مهار فعالیت آنزیم می شود. این پدیده امکان مطالعه ماهیت باقی مانده های اسید آمینه درگیر در این واکنش آنزیمی را فراهم می کند. با این حال، در عمل، باید ظرافت های متعددی را در نظر گرفت که تفسیر بدون ابهام از نتایج به دست آمده با بازدارنده های خاص را دشوار و اغلب مشکوک می کند. اول از همه، برای اینکه واکنش با یک بازدارنده برای مطالعه ماهیت زنجیره های جانبی درگیر در واکنش مناسب باشد، باید معیارهای زیر را برآورده کند:

) خاص باشد، یعنی. مهار کننده باید فقط گروه های مورد نظر را مسدود کند.

) فعالیت آنزیم را مهار می کند و این مهار باید با افزایش تعداد گروه های اصلاح شده کامل شود.

) معرف نباید باعث دناتوراسیون غیر اختصاصی پروتئین شود.

2 گروه از مهار کننده ها وجود دارد: اثر برگشت پذیر و غیر قابل برگشت. این تقسیم بندی بر اساس معیار بازیابی فعالیت آنزیم پس از دیالیز یا رقت قوی محلول آنزیم با یک مهارکننده است.

با توجه به مکانیسم اثر، مهار رقابتی، غیر رقابتی، غیر رقابتی، سوبسترا و مهار آلوستریک متمایز می شود.

بازداری رقابتی

مهار رقابتی در مطالعه مهار ناشی از آنالوگ های بستر کشف شد. این مهار واکنش آنزیمی ناشی از اتصال به مرکز فعال آنزیم یک بازدارنده مشابه ساختار بستر و جلوگیری از تشکیل کمپلکس آنزیم-سوبسترا است. در مهار رقابتی، بازدارنده و سوبسترا که از نظر ساختار مشابه هستند، برای مکان فعال آنزیم با هم رقابت می کنند. ترکیب مولکول ها که بزرگتر است به مرکز فعال متصل می شود.

چنین ایده‌هایی در مورد مکانیسم بازداری با آزمایش‌هایی بر روی سینتیک واکنش‌های بازداری رقابتی تأیید شد. بنابراین، نشان داده شد که، در مورد مهار رقابتی، آنالوگ سوبسترا بر سرعت تجزیه کمپلکس آنزیم-سوبسترا از قبل تشکیل شده تأثیر نمی‌گذارد. هنگام استفاده از بیش از حد "بی نهایت زیاد" از بستر، حداکثر نرخ یکسانی هم در حضور و هم در غیاب یک بازدارنده به دست می آید. در مقابل، بازدارنده بر مقدار ثابت تفکیک و ثابت Michaelis تأثیر می گذارد. از این نتیجه می‌توان نتیجه گرفت که بازدارنده با گروه‌های پروتئینی که به روشی درگیر در اتصال سوبسترا هستند، واکنش نشان می‌دهد، بنابراین، به دلیل تعامل با این گروه‌ها، قدرت اتصال سوبسترا کاهش می‌یابد (یعنی تعداد مولکول‌های آنزیمی که قادر به اتصال بستر کاهش می یابد).

بعداً نشان داده شد که مهار رقابتی جنبشی می‌تواند نه تنها توسط آنالوگ‌های بستر، بلکه توسط سایر معرف‌ها نیز ایجاد شود که ساختار شیمیایی آنها کاملاً متفاوت از زیرلایه است. در این موارد، همچنین فرض بر این بود که این معرف با گروهی که مسئول اتصال بستر است، تعامل دارد.

از نظر تئوری دو احتمال برای مهار رقابتی وجود دارد:

1) محل های اتصال و کاتالیزوری آنزیم همپوشانی دارند. بازدارنده به آنها متصل می شود، اما فقط بر گروه های مرکز اتصال تأثیر می گذارد.

2) مرکز اتصال و مرکز کاتالیزوری در مولکول آنزیم از نظر مکانی جدا شده اند. بازدارنده با محل اتصال تعامل دارد.

جایی که I یک بازدارنده است و KI ثابت تفکیک کمپلکس آنزیم-بازدارنده است.

سرعت نسبی (نسبت سرعت واکنش آنزیمی اندازه گیری شده در حضور یک بازدارنده (v i) , به حداکثر سرعت) برابر است با

v i / V = ​​/ [E] T

زیرا برای غلظت کل آنزیم درست است

[E]T = [E] + +

سپس 1 / v i = (K s / V[S]) (1 + [I] / K I) + 1 / V

بدیهی است که اگر [I] = K I باشد , سپس شیب خط مستقیم دو برابر بیشتر از وابستگی 1/v 0 به [S] می شود (v 0 سرعت واکنش آنزیمی در غیاب یک بازدارنده است).

نوع مهار معمولاً به صورت گرافیکی تعیین می شود. بازداری رقابتی با ترسیم نمودارهای Lineweaver-Burk به راحتی تشخیص داده می شود (یعنی نمودارها در 1/v i و 1/[S]) در غلظت های مختلف بازدارنده. با مهار رقابتی واقعی، مجموعه ای از خطوط مستقیم به دست می آید که در مماس زاویه شیب متفاوت هستند و محور y را قطع می کنند (محور 1/v i) در یک نقطه در هر غلظتی از بازدارنده، می توان از غلظت بالایی از سوبسترا استفاده کرد که فعالیت آنزیم حداکثر باشد.

یک مثال از مهار رقابتی، تأثیر مواد مختلف بر فعالیت سوکسینات دهیدروژناز است. این آنزیم بخشی از سیستم حلقوی آنزیمی - چرخه کربس است. سوبسترای طبیعی آن سوکسینات است و بازدارنده رقابتی آن اگزالواستات است، یک محصول میانی از همان چرخه کربس:

یک مهارکننده رقابتی مشابه سوکسینات دهیدروژناز اسید مالونیک است که اغلب در تحقیقات بیوشیمیایی استفاده می شود.

عمل بسیاری از آماده سازی های دارویی، آفت کش های مورد استفاده برای از بین بردن آفات کشاورزی و عوامل جنگ شیمیایی بر اساس اصل بازداری رقابتی است.

به عنوان مثال، گروهی از داروهای آنتی کولین استراز، که شامل مشتقات بازهای آمونیوم چهارتایی و ترکیبات ارگانوفسفر هستند، مهارکننده های رقابتی آنزیم کولین استراز با توجه به سوبسترای آن استیل کولین هستند. کولین استراز هیدرولیز استیل کولین، یک واسطه سیستم های کولینرژیک (سیناپس های عصبی عضلانی، سیستم پاراسمپاتیک و غیره) را کاتالیز می کند. مواد آنتی کولین استراز برای جایگاه فعال آنزیم با استیل کولین رقابت می کنند، به آن متصل می شوند و فعالیت کاتالیزوری آنزیم را خاموش می کنند. داروهایی مانند پروزرین، فیزوستیگمین، سوین به طور برگشت پذیر آنزیم را مهار می کنند، در حالی که داروهای ارگانوفسفره مانند آرمین، نیبوفین، کلروفوس، سومان به طور برگشت ناپذیر عمل می کنند و گروه کاتالیزوری آنزیم را فسفریله می کنند. در نتیجه عمل آنها، استیل کولین در سیناپس هایی که واسطه تحریک عصبی است، تجمع می یابد، یعنی. ارگانیسم توسط استیل کولین انباشته شده مسموم می شود. عمل مهارکننده های برگشت پذیر به تدریج ناپدید می شود، زیرا هر چه استیل کولین بیشتر جمع شود، سریعتر مهار کننده را از مرکز فعال کولین استراز جابجا می کند. سمیت بازدارنده های برگشت ناپذیر به طور غیر قابل مقایسه ای بالاتر است؛ بنابراین از آنها برای مبارزه با آفات کشاورزی، حشرات خانگی و جوندگان (به عنوان مثال کلروفوس) و به عنوان عوامل جنگ شیمیایی (به عنوان مثال سارین، سومان و غیره) استفاده می شود.

مهار غیر رقابتی

در مهار غیر رقابتی، یک بازدارنده خاص بر ثابت تفکیک کمپلکس آنزیم-سوبسترا تأثیر نمی گذارد. از سوی دیگر، حداکثر سرعت واکنش قابل دستیابی در حضور یک بازدارنده کمتر از عدم وجود آن است، حتی در بیش از حد بی نهایت زیاد از بستر. وجود مهار ثابت می کند که مهار کننده به پروتئین متصل می شود. تغییر ناپذیری ثابت تفکیک هم در حضور و هم در غیاب بازدارنده، به نوبه خود نشان می دهد که بر خلاف بستر، بازدارنده به گروه دیگری متصل می شود. از دیدگاه نظری، مکانیسم چنین بازداری را می توان به روش های مختلفی تفسیر کرد.

الف) محل اتصال و محل کاتالیزوری آنزیم متفاوت است. در این حالت، بازدارنده مرتبط با مرکز کاتالیزوری، فعالیت آنزیم را کاهش داده و حداکثر دستیابی به آن را کاهش می دهد.
سرعت بدون تأثیر بر تشکیل کمپلکس آنزیم-سوبسترا.

ب) محل اتصال و محل کاتالیزوری روی هم همپوشانی دارند
سطح آنزیم، و مهار کننده به گروه های دیگر پروتئین متصل می شود. به دلیل اتصال بازدارنده به سطح آنزیم، اطلاعات پروتئین تغییر می کند و برای اجرای کاتالیز نامطلوب می شود.

ج) بازدارنده نه به محل کاتالیزوری و نه به محل اتصال متصل نمی شود و در نتیجه روی ترکیب پروتئین تأثیر نمی گذارد. با این حال، می تواند به طور موضعی توزیع بار را در ناحیه ای از سطح پروتئین تغییر دهد. مهار فعالیت همچنین می تواند در این مورد اتفاق بیفتد اگر به عنوان مثال یونیزاسیون گروه های ضروری برای تجلی فعالیت غیرممکن شود، یا اگر برعکس، یونیزاسیون گروه های فعال فقط به شکل غیر یونیزه اتفاق بیفتد. این پدیده عمدتاً هنگام استفاده از معرف های اسیدی یا قلیایی قوی مشاهده می شود.

بازدارنده و سوبسترا بر اتصال یکدیگر به آنزیم تأثیر نمی‌گذارند، اما کمپلکس‌های آنزیمی حاوی بازدارنده کاملاً غیرفعال هستند. در این مورد، مراحل ابتدایی زیر را می توان فرض کرد:

v i / V = ​​/ [E] T

[E] T = [E] + + +

/ v i = (K s / V [S]) (1 + [I] / K I) + (1 / V) (1 + [I] / K I)

اگر [I] = K I، شیب خطوط مستقیم و مختصات نقطه تقاطع با محور عمودی در مقایسه با 1/v 0 دو برابر می شود.

مهارکننده های غیر رقابتی، به عنوان مثال، سیانیدها هستند که به شدت با آهن فریک مرتبط هستند، که بخشی از سایت کاتالیزوری آنزیم هیمین - سیتوکروم اکسیداز است. مسدود شدن این آنزیم زنجیره تنفسی را خاموش می کند و سلول می میرد. مهارکننده‌های غیررقابتی آنزیم شامل یون‌های فلزات سنگین و ترکیبات آلی آن‌ها هستند. بنابراین یون های فلزات سنگین جیوه، سرب، کادمیوم، آرسنیک و غیره بسیار سمی هستند. برای مثال، گروه‌های SH موجود در محل کاتالیزوری آنزیم را مسدود می‌کنند.

مهارکننده های غیررقابتی سیانیدها هستند که به شدت با آهن فریک مرتبط هستند که بخشی از محل کاتالیزوری آنزیم همیک - سیتوکروم اکسیداز است. مسدود شدن این آنزیم زنجیره تنفسی را خاموش می کند و سلول می میرد. حذف عمل یک بازدارنده غیر رقابتی با بیش از حد بستر (به عنوان عملکرد یک ماده رقابتی) غیرممکن است، اما فقط با موادی که بازدارنده - فعال کننده ها را متصل می کنند.

مهار کننده های غیر رقابتی به عنوان عوامل دارویی، مواد سمی برای کنترل آفات در کشاورزی و برای اهداف نظامی استفاده می شوند. در پزشکی از فرآورده های حاوی جیوه، آرسنیک، بیسموت استفاده می شود که به طور غیر رقابتی آنزیم های موجود در سلول های بدن یا باکتری های بیماری زا را مهار می کند که یکی از اثرات آنها را تعیین می کند. در صورت مسمومیت، اتصال سم یا جابجایی آن از مجموعه آنزیم-بازدارنده با کمک فعال کننده ها امکان پذیر است. اینها شامل تمام کمپلکس های حاوی SH (سیستئین، دیمرکاپتوپروپانول)، اسید سیتریک، اتیلن دی آمین تتراستیک اسید و غیره است.

مهار غیر رقابتی

به این نوع بازداری در ادبیات، بازداری ضد رقابتی نیز گفته می شود. یا مهار مرتبط , با این حال، اصطلاح "بازداری غیررقابتی" بیشترین استفاده را دارد. ویژگی این نوع مهار این است که بازدارنده قادر به اتصال به آنزیم نیست، اما به کمپلکس آنزیم - سوبسترا متصل می شود.

در مورد مهار غیر رقابتی، کمپلکس حاوی بازدارنده غیرفعال است:

v i / V = ​​/ [E]

[E]T = [E] + +

/ v i = Ks / V[S] + (1 / V) (1 + [I] / K I)

مهار بستر

مهار سوبسترا، مهار یک واکنش آنزیمی است که در اثر افزایش بیش از حد سوبسترا ایجاد می شود. چنین مهاری به دلیل تشکیل کمپلکس آنزیم-سوبسترا رخ می دهد که قادر به انجام تحولات کاتالیزوری نیست. کمپلکس ES 2 غیرمولد است و مولکول آنزیم را غیرفعال می کند. مهار سوبسترا به دلیل وجود بیش از حد بستر ایجاد می شود، بنابراین با کاهش غلظت آن حذف می شود.

مهار آلوستریک

تنظیم آلوستریک فقط برای گروه خاصی از آنزیم ها با ساختار چهارتایی مشخص است که دارای مراکز تنظیمی برای اتصال افکتورهای آلوستریک هستند. عوامل منفی که تبدیل سوبسترا در محل فعال آنزیم را مهار می کنند به عنوان بازدارنده آلوستریک عمل می کنند. برعکس، تأثیرگذارهای مثبت آلوستریک، واکنش آنزیمی را تسریع می‌کنند و به همین دلیل به آنها فعال‌کننده آلوستریک می‌گویند. عوامل آلوستریک آنزیم ها اغلب متابولیت های مختلف و همچنین هورمون ها، یون های فلزی و کوآنزیم ها هستند. در موارد نادر، مولکول های سوبسترا نقش یک عامل آلوستریک آنزیم ها را بازی می کنند.

مکانیسم اثر مهارکننده های آلوستریک بر روی آنزیم، تغییر ساختار محل فعال است. کاهش سرعت واکنش آنزیمی یا نتیجه افزایش Km یا کاهش حداکثر سرعت V max در همان غلظت‌های زیرلایه اشباع است. آنزیم تا حدی بیکار است.

آنزیم های آلوستریک از نظر منحنی S شکل ویژه سرعت واکنش در مقابل غلظت سوبسترا با سایر آنزیم ها متفاوت هستند. این منحنی شبیه منحنی اشباع اکسیژن هموگلوبین است؛ این نشان می‌دهد که مراکز فعال زیرواحدها به طور مستقل عمل نمی‌کنند، بلکه به صورت مشارکتی عمل می‌کنند. میل ترکیبی هر مرکز فعال بعدی برای زیرلایه با درجه اشباع مراکز قبلی تعیین می شود. کار هماهنگ مراکز توسط افکتورهای آلوستریک تعیین می شود.

تنظیم آلوستریک خود را به شکل مهار توسط محصول نهایی اولین آنزیم در زنجیره نشان می دهد. ساختار محصول نهایی پس از یک سری دگرگونی های ماده اولیه (سوبسترا) مشابه زیرلایه نیست، بنابراین محصول نهایی تنها به عنوان یک بازدارنده آلوستریک (افکتور) می تواند بر روی آنزیم اولیه زنجیره عمل کند. از نظر ظاهری ، چنین تنظیمی شبیه به تنظیم توسط مکانیسم بازخورد است و به شما امکان می دهد خروجی محصول نهایی را کنترل کنید ، در صورت انباشته شدن آن ، کار اولین آنزیم در زنجیره متوقف می شود. به عنوان مثال، آسپارتات کاربامویل ترانسفراز (ACTase) اولین واکنش از شش واکنش در سنتز سیتیدین تری فسفات (CTP) را کاتالیز می کند. CTP یک مهارکننده آلوستریک AKTase است. بنابراین، هنگامی که CTP تجمع می یابد، مهار AKTase رخ می دهد و سنتز بیشتر CTP متوقف می شود. تنظیم آلوستریک آنزیم ها با کمک هورمون ها کشف شده است. به عنوان مثال، استروژن ها یک مهارکننده آلوستریک آنزیم گلوتامات دهیدروژناز هستند که باعث کاتالیز کردن دآمیناسیون اسید گلوتامیک می شود.

بنابراین، حتی ساده ترین معادله جنبشی برای یک واکنش آنزیمی حاوی چندین پارامتر جنبشی است که هر کدام به دما و محیطی که واکنش در آن انجام می شود بستگی دارد.

مهارکننده ها نه تنها درک ماهیت کاتالیز آنزیمی را امکان پذیر می کنند، بلکه نوعی ابزار برای مطالعه نقش واکنش های شیمیایی فردی هستند که می توانند به طور خاص با کمک یک بازدارنده آنزیم معین خاموش شوند.

3. برخی از وسایل مفید برای تعیین سرعت واکنش اولیه

بسیاری از مشکلات سینتیک آنزیمی منجر به تعیین سرعت واکنش اولیه (v 0) می شود. مزیت اصلی این روش این است که مقادیر v0 تعیین شده در لحظه اولیه زمان دقیق ترین نمایش را از فعالیت آنزیم های مورد مطالعه ارائه می دهد، زیرا محصولات واکنش انباشته شده هنوز زمان لازم برای اعمال یک اثر بازدارنده را ندارند. بر روی آنزیم و علاوه بر این، سیستم واکنش دهنده در حالت تعادل ساکن است.

با این حال، در عمل آزمایشگاهی، هنگام استفاده از روش‌های معمولی اسپکتروفتومتری، تیتریمتری یا سایر تکنیک‌ها برای ثبت پیشرفت چنین واکنش‌هایی، در بهترین حالت، حداکثر تا 15 تا 20 ثانیه از زمان اولیه برای معرفی آنزیم به بستر، مخلوط کردن سیستم واکنش‌دهنده، راه اندازی سلول و غیره از بین می رود. و این غیر قابل قبول است، زیرا در این مورد مماس به نقطه ای می رسد که tg ά 2< tg ά 1 . Не компенсируется потеря начального времени и при математической обработке таких кривых при записи выхода v 0 на максимальный уровень (V). Кроме того, протекание реакций без اختلاط ثابت با نوسانات در غلظت معرف ها بر حسب حجم پیچیده تر می شود.

دستگاه‌های ساده‌ای که در زیر برای اسپکتروفتومتر، pH متر و مواردی از این دست پیشنهاد شده‌اند، کاهش چشمگیر منابع خطاهای نشان‌داده‌شده در تعیین v 0 را ممکن می‌سازند.

3.1 دستگاه به اسپکتروفتومتر

دستگاه اسپکتروفتومتر از یک دیسپنسر 1، یک نخ تفلون دوار 2 (همزن) و یک کلاه ثابت 3 تشکیل شده است.

تلگراف یک میکروپیپت است که یک سر آن با سوزن 4 تشکیل شده است، دیگری - با گشاد شدن 5 (برای جلوگیری از ورود آنزیم به نوک لاستیکی 6).

پوشش تفلون 3 که کووت طیفی 7 را می پوشاند دارای دو سوراخ است: یکی (8) در مرکز پوشش، دومی (9) بالای وسط شکاف بین دیواره مات کووت 7 و پرتو نور 10. تفلون. لوله 11 (قطر داخلی 1-1.5 میلی متر) در یک انتها در سوراخ 9 ثابت شده است، طرف دیگر - روی لبه ثابت 12 در جلوی روتور موتور 13. موضوع تفلون 2 در داخل لوله قرار داده شده است (ضخامت نخ 0.5-0.6 میلی متر ). یک سر نخ روی روتور چرخان موتور 13 ثابت می شود، دومی - که به داخل کووت 7 منتقل می شود - به شکل مارپیچ (برای تقویت مخلوط کردن) شکل می گیرد. موقعیت نخ بدون توجه به فاصله موتور توسط درپوش ثابت 3 تعیین می شود که هنگام کار که نیاز به تغییر مکرر کووت ها دارد راحت است.

اصل عملیات.کووت کوارتز اسپکتروفتومتر 7 با زیرلایه 14 (حدود 1.5-2.0 میلی لیتر) پر شده است، که در نگهدارنده کووت ترموستاتیک اسپکتروفتومتر قرار داده شده است، با درب 3 با نخ تفلون دوار 2، که در زیر استرا غوطه ور است، بسته می شود. و تمام عملیات بعدی قبلاً در پرتو نور اسپکتروفتومتر انجام شده و روی ضبط کننده ثبت می شود.

در ابتدای کار، بستر مخلوط می شود و قلم ضبط کننده یک خط صاف افقی (یا "صفر") می نویسد. دیسپنسر (همراه با آنزیم) در سوراخ 8 وارد می شود (سوزن در محلول بستر 14 غوطه ور می شود)، با فشردن سریع نوک 6، آنزیم (معمولاً حدود 0.03-0.05 میلی لیتر) به زیرلایه وارد می شود و تلگراف کننده حذف شده است. اختلاط اجزا در 2.5-3 ثانیه به پایان می رسد و قلم ضبط کننده شروع واکنش را با انحراف منحنی چگالی نوری (ΔA) در مقابل زمان ثابت می کند.

چنین دستگاهی همچنین امکان گرفتن نمونه از سیستم واکنش را برای تجزیه و تحلیل فراهم می کند. بازدارنده ها و فعال کننده ها را به سیستم اضافه کنید. تغییر شرایط واکنش (تغییر pH، قدرت یونی و غیره) بدون ایجاد اختلال در ثبت دوره واکنش، که بسیار راحت است، به عنوان مثال، هنگام مطالعه شکاف. n-NFF فسفاتازهای "اسیدی"، که در آن رخ می دهد n-NFF در pH 5.0 (یا pH 6-7) انجام می شود و فعالیت آنزیم ها با تجمع تعیین می شود. nیون های نیتروفنولات در pH 9.5-10.0.

چنین دستگاهی همچنین برای انجام تیتراسیون اسپکتروفتومتری آنزیم ها و غیره مناسب است.

3.2 دستگاه pH متر

دستگاه pH متر از یک نوک اصلاح شده الکترود جریان 1، یک نیمه میکروسل 2، یک دیسپنسر 3 و یک مدار الکترونیکی برای اتصال pH متر به ضبط کننده تشکیل شده است. علاوه بر این، دستگاه شامل یک الکترود pH متر استاندارد (4)، یک پوشش نگهدارنده سلول (5)، یک محفظه جریان ترموستاتیک (6)، یک محلول بستر (7)، یک آهنربای غیرفعال (8) و یک آهنربای فعال ( 9).

نوک استاندارد الکترود جریان pH متر (LPU-01) با یک لوله تفلون 1 (قطر داخلی 1.3-1.5 میلی متر)، پر شده با نخ آزبست، از قبل با محلول KCl اشباع شده جایگزین می شود. چگالی پر شدن رزوه به گونه ای کنترل می شود که سرعت جریان محلول KCl از طریق لوله به سرعت جریان الکترود اولیه اصلاح نشده نزدیک باشد. این جایگزینی نوک این امکان را فراهم می کند که اندازه سلول کار اصلی را از 20-25 به 2 میلی لیتر کاهش دهید، که امکان مدیریت با حداقل حجم (1.5 میلی لیتر) محلول های آماده سازی بیوشیمیایی گران قیمت را فراهم می کند.

مدار الکترونیکی برای اتصال pH متر (LPU-01) به ضبط کننده شامل یک منبع تغذیه (باتری DC 12 ولت)، یک مقاومت سیم متغیر R 1 (10 - 100 اهم) است که ولتاژ 9 ولت را در دیود زنر D809 با توجه به قرائت ولت متر، یک مقاومت سیم متغیر R 2 (15-150 اهم)، که تنظیم "صفر" (نقطه مرجع) خوانش pH متر در مقیاس ضبط کننده و سیم متغیر را تنظیم می کند. مقاومت R 3 (35-500 اهم)، که مقیاس انبساط (تقویت) قرائت مقیاس pH - متر روی ضبط کننده را تنظیم می کند. مدار تا زمانی که ولتاژ منبع به زیر 9 ولت کاهش یابد به طور قابل اعتماد کار می کند.

اصل عملیات. 1.5 میلی لیتر از بستر به سلول وارد می شود (یک استوانه شیشه ای 1.7x2.4 سانتی متر) و سلول روی درپوش ثابت 5 ثابت می شود. همزن 9 روشن می شود و قلم ضبط کننده یک عدد یکنواخت (پایه) را می نویسد. خط مرجع. با کمک یک دیسپنسر، 0.03 میلی‌لیتر از محلول آنزیم وارد بستر می‌شود و قلم ضبط‌کننده شروع واکنش را با انحراف منحنی pH در مقابل زمان (t) ثابت می‌کند.

چنین دستگاهی جایگزین آمار pH نمی شود، اما با در نظر گرفتن امکان گسترش مقیاس pH متر، به شما امکان می دهد تا تغییرات جزئی را در pH 0.004-0.005 به طور قابل اعتماد ثبت کنید.

3.3 خط کش های نوموگرام، مناسب برای تعیین سرعت اولیه

پیچیدگی قابل توجه تعیین سرعت اولیه در روش مماس ها، محاسبه نسبت تغییرات غلظت معرف ها (Δ[S]) در واحد زمان (Δt) است، یعنی. بیان v 0 در M/min از شرایطی که

v 0 = lim Δ[S] / Δt، در، t 0.

در عمل، چنین رویه‌ای معمولاً از سه یا چهار عملیات مجزا تشکیل می‌شود: یک مماس به بخش اولیه منحنی واکنش رسم می‌شود، سپس تعداد واحدهای مقدار ثبت‌شده (چگالی نوری، زاویه چرخش، و غیره) در هر یک معین. فاصله زمانی شمارش می شود و این منجر به واحد زمان می شود و در نهایت خوانش های ضبط کننده برای تغییر غلظت معرف به مدت 1 دقیقه (M/min) دوباره محاسبه می شود. دو نوع خط کش پیشنهادی نوموگرام، ساده کردن این روش را ممکن می سازد.

خط کش مستطیلی. v 0 نسبت Δ[S]/Δt است، یعنی. tg ά، که در آن ά زاویه میل مماس بر محور زمانی t است. همین مماس نیز افت مثلث قائم الزاویه مربوطه با پاهای [S] و t است. هر چه v 0 بزرگتر باشد، شیب مماس تندتر است. بنابراین، اگر خودمان را به یک بازه زمانی معین، مثلاً 1 دقیقه محدود کنیم، یک سری مثلث قائم الزاویه با مقادیر مختلف ساق [S] به دست خواهیم آورد (در واقع مقادیر مختلف v 0) . با این حال، اگر هر دو پایه درجه بندی شوند: افقی - بر حسب واحد زمان مرجع (1 دقیقه)، و عمودی - در واحدهای تغییر در غلظت معرف، به عنوان مثال، برحسب میلی مول (میلی مولار)، و بخش های حاصل را در قالب مناسب اعمال کنید. از یک ماده شفاف (پلکسی گلاس با ضخامت حدود 2 میلی متر)، سپس می توانید یک خط کش مناسب برای تعیین سرعت واکنش اولیه دریافت کنید. تمام اعداد و خطوط در سمت عقب خط کش چاپ می شوند تا خطاهای اختلاف منظر هنگام تعیین v 0 حذف شوند.

روش تعیین v 0 در این مورد به دو عمل ساده کاهش می یابد: یک مماس به بخش اولیه منحنی جنبشی t رسم می شود. 2 و نقطه صفر پای افقی t خط کش را با ابتدای مماس ترکیب کنید، ادامه مماس اکنون از مقیاس غلظت [S] در نقطه ای که مقدار v 0 را در M/min تعیین می کند (زمانی که پایه t افقی است، هیچ عملیات اضافی مورد نیاز نیست.

خط قوس.اگر مقیاس غلظت در امتداد قوس با شعاع معین رسم شود، روند تعیین v 0 را می توان به یک عملیات ساده کرد.

یک خط مستقیم ("پایه") 2 روی صفحه ای از مواد شفاف اعمال می شود (همه اعداد و خطوط نیز در سمت عقب خط کش اعمال می شوند) و از نقطه صفر (t=0, min) این خط با یک شعاع برابر طول پا t=1 min [ ، یک قوس [S] بکشید، از بالا به پایین که در امتداد آن مقیاس تغییرات در غلظت معرف (به عنوان مثال، بستر در میلی مولار) قرار می گیرد.

انواع خط کش توصیف شده، دستگاهی برای اسپکتروفتومتر و pH متر چندین سال است که برای تعیین سرعت واکنش اولیه (v 0)، در مطالعه ویژگی سوبسترای آنزیم ها، برای تیتراسیون اسپکتروفتومتری و غیره استفاده می شود.

نتیجه

در این مقاله، بخشی از آنزیم شناسی در نظر گرفته شد که به بررسی وابستگی سرعت واکنش های شیمیایی کاتالیز شده توسط آنزیم ها به تعدادی از عوامل محیطی می پردازد. بنیانگذاران این علم را میکایلیس و منتن می دانند که نظریه مکانیزم کلی خود را منتشر کردند واکنش های آنزیمی، معادله ای مشتق شده است که به اصل اساسی تمام مطالعات جنبشی آنزیم ها تبدیل شده است، به عنوان نقطه شروع برای هر گونه توصیف کمی از عملکرد آنزیم ها عمل می کند. معادله اصلی Michaelis-Menten یک معادله هذلولی است. Lineweaver و Burke با تبدیل معادله Michaelis-Menten و به دست آوردن نموداری از یک خط مستقیم که مقدار V max را می توان با بیشترین دقت تعیین کرد، به سینتیک کمک کردند.

با گذشت زمان، تغییر در سرعت واکنش آنزیمی در واکنش آنزیمی در شرایط تجربی کاهش می یابد. کاهش سرعت می تواند به دلیل عوامل متعددی رخ دهد: کاهش غلظت بستر، افزایش غلظت محصول که می تواند اثر بازدارندگی داشته باشد، تغییر در pH محلول، و تغییر در دمای محیط ممکن است رخ دهد. بنابراین، به ازای هر 10 درجه سانتیگراد افزایش دما، سرعت واکنش دو برابر یا حتی کمتر می شود. دمای پایین به طور برگشت پذیر آنزیم ها را غیرفعال می کند. وابستگی سرعت واکنش آنزیمی به pH نشان دهنده وضعیت گروه های عملکردی مرکز فعال آنزیم است. هر آنزیم به طور متفاوتی به تغییرات pH واکنش نشان می دهد. واکنش های شیمیایی را می توان با اثر بر روی آنها با انواع مختلف بازدارندگی متوقف کرد. سرعت واکنش اولیه را می توان با کمک دستگاه هایی مانند خط کش های نوموگرام، دستگاه اسپکتروفتومتر و PH متر به سرعت و با دقت تعیین کرد. این امکان نمایش دقیق ترین فعالیت آنزیم های مورد مطالعه را فراهم می کند.

همه اینها امروزه به طور فعال در عمل پزشکی استفاده می شود.

فهرست منابع استفاده شده

1. Belyasova N.A. بیوشیمی و زیست شناسی مولکولی. - مینسک: خانه کتاب، 2004. - 416 ص.، ill.

Keleti T. مبانی سینتیک آنزیمی: Per. از انگلیسی. - م.: میر، 1369. -350 ص.، بدخیم.

3. Knorre D.G. شیمی بیولوژیکی: Proc. برای مواد شیمیایی، زیستی و عسل متخصص. دانشگاه ها. - چاپ سوم، کشیش. - م.: بالاتر. مدرسه 2002. - 479 ص: بیمار.

4. کروپیاننکو V.I. روش برداری برای نمایش واکنش های آنزیمی. - M.: Nauka، 1990. - 144 ص.

5. Lehninger A. بیوشیمی. پایه های مولکولی ساختار و عملکرد سلول: Per. از انگلیسی. - م.: میر، 1353.

6. Stroev E.A. شیمی زیستی: کتاب درسی برای داروسازی. in-tov و pharmac. جعلی عسل. در رفیق - م.: دبیرستان، 1986. - 479 ص.، بیمار.

Severin E.S. بیوشیمی. آ. - ویرایش پنجم - م.: GEOTAR - رسانه، 2009. - 786 ص.، ill.

این بخش از آنزیم شناسی تأثیر عوامل مختلف را بر سرعت یک واکنش آنزیمی مطالعه می کند. با در نظر گرفتن معادله کلی کاتالیز آنزیمی واکنش برگشت پذیر تبدیل یک بستر به یک محصول (1)،

عوامل اصلی مؤثر بر سرعت یک واکنش آنزیمی را باید نام برد: غلظت سوبسترا [S]، غلظت آنزیم [E]، و غلظت محصول واکنش [P].

تعامل برخی از آنزیم ها با بستر آنها را می توان با یک منحنی هذلولی از وابستگی سرعت واکنش آنزیمی V به غلظت بستر [S] توصیف کرد (شکل 19):

شکل 19. وابستگی سرعت واکنش آنزیمی به غلظت سوبسترا.

سه بخش را می توان در این منحنی متمایز کرد که می توان آن را با موقعیت مکانیزم تعامل آنزیم با بستر توضیح داد: OA بخشی از وابستگی مستقیم V به [S]، مکان های فعال آنزیم است. با تشکیل یک ES پیچیده ناپایدار به تدریج با مولکول های بستر پر می شوند. بخش AB - وابستگی منحنی V به [S]، اشباع کامل مراکز فعال آنزیم با مولکول‌های سوبسترا هنوز به دست نیامده است. مجتمع ES قبل از رسیدن به حالت گذار ناپایدار است، احتمال تفکیک برگشتی به E و S هنوز زیاد است. بخش قبل از میلاد - وابستگی با یک معادله مرتبه صفر توصیف می شود، بخش موازی با محور [S] است، اشباع کامل آنزیم های فعال با مولکول های بستر حاصل می شود، V=V max .

شکل مشخصه منحنی به صورت ریاضی با معادله بریگز-هالدن توصیف می شود:

V=V حداکثر ● [S]/ کیلومتر + [S] (2)،

که در آن Km ثابت Michaelis-Menten است که از نظر عددی برابر با غلظت سوبسترا است که در آن سرعت واکنش آنزیمی برابر با نیم V max است.

هر چه Km آنزیم کمتر باشد، میل ترکیبی آنزیم به سوبسترا بیشتر می شود، سریعتر به حالت گذار برای سوبسترا می رسد و به محصول واکنش تبدیل می شود. جستجوی مقادیر کیلومتر برای هر یک از سوبستراهای آنزیم با ویژگی گروهی در تعیین نقش بیولوژیکی این آنزیم در سلول مهم است.

برای اکثر آنزیم ها، ساختن یک منحنی هذلولی غیرممکن است (شکل 19) در این مورد از روش متقابل دوگانه (Lineweaver-Burk) استفاده می شود، یعنی. یک وابستگی گرافیکی 1/[V] به 1/[S] رسم شده است (شکل 20). روش ساخت چنین منحنی هایی در آزمایش هنگام مطالعه تأثیر انواع مختلف بازدارنده ها بر فعالیت آنزیم ها بسیار راحت است (متن زیر را ببینید).

شکل 20. نمودار 1/[V] در مقابل 1/[S] (روش Lineweaver-Burk)،

که در آن ناحیه برش y - و x - ناحیه برش - مماس زاویه α - .

وابستگی سرعت واکنش آنزیمی V به غلظت آنزیم [E].

این وابستگی گرافیکی (شکل 21) در دمای بهینه و pH محیط، در غلظت‌های سوبسترا که به طور قابل توجهی بالاتر از غلظت اشباع مکان‌های فعال آنزیم است، در نظر گرفته می‌شود.

برنج. 21. تأثیر غلظت آنزیم بر سرعت واکنش آنزیمی.

وابستگی سرعت واکنش آنزیمی به غلظت کوفاکتور یا کوآنزیم.برای آنزیم های پیچیده، باید در نظر داشت که کمبود اشکال کوآنزیمی ویتامین ها در هیپوویتامینوز، نقض ورود یون های فلزی به بدن لزوماً منجر به کاهش غلظت آنزیم های مربوطه لازم برای دوره متابولیک می شود. فرآیندها بنابراین باید نتیجه گرفت که فعالیت آنزیم به طور مستقیم به غلظت کوفاکتور یا کوآنزیم وابسته است.

تأثیر غلظت محصولات بر سرعت واکنش آنزیمی.برای واکنش‌های برگشت‌پذیری که در بدن انسان اتفاق می‌افتد، باید در نظر گرفت که محصولات حاصل از واکنش مستقیم می‌تواند توسط آنزیم به عنوان سوبسترا برای واکنش معکوس استفاده شود. بنابراین جهت جریان و لحظه رسیدن به V max به نسبت غلظت زیرلایه های اولیه و محصولات واکنش بستگی دارد. به عنوان مثال، فعالیت آلانین آمینوترانسفراز، که تبدیل را کاتالیز می کند:

آلانین + آلفا کتوگلوتارات ↔ پیروات + گلوتامات

در سلول به نسبت غلظت بستگی دارد:

[آلانین + آلفا کتوگلوتارات] / [پیروات + گلوتامات].

مکانیسم عمل آنزیم. نظریه های کاتالیز آنزیمی

آنزیم ها، مانند کاتالیزورهای غیر پروتئینی، به دلیل توانایی آنها در کاهش انرژی فعال سازی آن واکنش، سرعت یک واکنش شیمیایی را افزایش می دهند. انرژی فعال سازی یک واکنش آنزیمی به عنوان تفاوت بین مقدار انرژی در سیستم واکنش در حال انجام که به حالت گذار رسیده است و انرژی تعیین شده در ابتدای واکنش محاسبه می شود (به وابستگی گرافیکی در شکل 22 مراجعه کنید).

برنج. 22. وابستگی گرافیکی حالت انرژی یک واکنش شیمیایی بدون آنزیم (1) و در حضور آنزیم (2) به زمان واکنش.

کارهای V. Henry و به ویژه L. Michaelis, M. Menten در مورد مطالعه مکانیسم واکنش های آنزیمی برگشت پذیر تک سوبسترا این امکان را فراهم می کند که فرض کنیم آنزیم E ابتدا به طور برگشت پذیر و نسبتاً سریع با بستر S خود ترکیب می شود و تشکیل می شود. یک کمپلکس آنزیم سوبسترا (ES):

E+S<=>ES (1)

تشکیل ES به دلیل پیوندهای هیدروژنی، برهمکنش های الکترواستاتیک، آبگریز، در برخی موارد کووالانسی، پیوندهای هماهنگی بین رادیکال های جانبی بقایای اسید آمینه مرکز فعال و گروه های عاملی بستر رخ می دهد. در آنزیم های پیچیده، بخش غیر پروتئینی ساختار نیز می تواند عملکرد تماس با بستر را انجام دهد.

سپس کمپلکس آنزیم-سوبسترا در یک واکنش برگشت پذیر دوم کندتر تجزیه می شود و محصول واکنش P و آنزیم آزاد E را تشکیل می دهد:

ES<=>EP<=>E + P (2)

در حال حاضر به لطف کار دانشمندان فوق الذکر و همچنین Kaylin D., Chance B., Koshland D. (نظریه "انطباق القایی") مفاد نظری در مورد چهار نکته اصلی در مکانیسم وجود دارد. اثر آنزیمی بر روی بستر، که توانایی آنزیم ها را در تسریع واکنش های شیمیایی تعیین می کند.

1. جهت گیری و نزدیکی . آنزیم قادر است مولکول سوبسترا را به گونه ای متصل کند که پیوند مورد حمله آنزیم نه تنها در مجاورت گروه کاتالیزوری قرار گیرد، بلکه نسبت به آن به درستی جهت گیری کند. احتمال اینکه کمپلکس ES به دلیل جهت گیری و رویکرد به حالت گذار برسد بسیار افزایش می یابد.

2. استرس و فشار : برازنده. چسباندن یک بستر می‌تواند باعث تغییرات ساختاری در مولکول آنزیم شود که منجر به تنش در ساختار محل فعال می‌شود و همچنین تا حدودی بستر محدود شده را تغییر شکل می‌دهد و در نتیجه دستیابی به حالت گذار توسط کمپلکس ES را تسهیل می‌کند. بین مولکول های E و S به اصطلاح مطابقت القایی وجود دارد.

سینتیک آنزیمی سرعت واکنش های کاتالیز شده توسط آنزیم ها را بسته به شرایط مختلف (غلظت، دما، pH و غیره) برهمکنش آنها با بستر مطالعه می کند.

با این حال، آنزیم ها پروتئین هایی هستند که به تأثیرات مختلف خارجی حساس هستند. بنابراین هنگام مطالعه سرعت واکنش های آنزیمی، عمدتاً غلظت واکنش دهنده ها در نظر گرفته می شود و سعی می شود تأثیر دما، pH محیط، فعال کننده ها، بازدارنده ها و سایر عوامل به حداقل برسد و شرایط استاندارد ایجاد شود. اول، این مقدار pH بهینه محیط برای این آنزیم است. ثانیاً توصیه می شود در صورت امکان دما را در 25 درجه سانتیگراد نگه دارید. ثالثاً اشباع کامل آنزیم با سوبسترا حاصل می شود. این نکته به ویژه مهم است، زیرا در غلظت کم سوبسترا، همه مولکول های آنزیم در واکنش شرکت نمی کنند (شکل 6.5، آ) به این معنی که نتیجه از حداکثر ممکن دور خواهد بود. بالاترین قدرت واکنش کاتالیز شده، با مساوی بودن سایر چیزها، در صورتی به دست می آید که هر مولکول آنزیم در دگرگونی دخیل باشد، یعنی. در غلظت بالایی از کمپلکس آنزیم-سوبسترا (شکل 6.5، v).اگر غلظت سوبسترا اشباع کامل آنزیم را تضمین نکند (شکل 6.5، ب، سپس سرعت واکنش ادامه دار به حداکثر مقدار نمی رسد.

برنج. 65.

آ -در غلظت کم بستر؛ 6 - با غلظت ناکافی بستر؛ v -زمانی که آنزیم کاملاً از سوبسترا اشباع شود

سرعت یک واکنش آنزیمی که در شرایط فوق اندازه گیری می شود و اشباع کامل آنزیم از سوبسترا نامیده می شود. حداکثر سرعت واکنش آنزیمی (V).

سرعت واکنش آنزیمی، زمانی که آنزیم به طور کامل از سوبسترا اشباع نشده است، تعیین می شود. v

کاتالیز آنزیمی را می توان به طور ساده با این طرح توصیف کرد

جایی که F یک آنزیم است. S - بستر؛ FS - کمپلکس آنزیم-سوبسترا.

هر مرحله از این فرآیند با سرعت خاصی مشخص می شود. واحد اندازه گیری سرعت یک واکنش آنزیمی، تعداد مول های زیرلایه تبدیل شده به واحد زمان است.(مثل سرعت یک واکنش عادی).

برهمکنش آنزیم با سوبسترا منجر به تشکیل کمپلکس آنزیم- سوبسترا می شود، اما این فرآیند برگشت پذیر است. سرعت واکنش های رو به جلو و معکوس به غلظت واکنش دهنده ها بستگی دارد و با معادلات مربوطه توصیف می شود:

معادله (6.3) در حالت تعادل معتبر است، زیرا سرعت واکنش های رو به جلو و معکوس برابر است.

با جایگزینی سرعت واکنش های مستقیم (6.1) و معکوس (6.2) به معادله (6.3)، برابری را به دست می آوریم:

حالت تعادل با متناظر مشخص می شود ثابت تعادل K pبرابر با نسبت ثابت های واکنش های مستقیم و معکوس (6.5). متقابل ثابت تعادل نامیده می شود K s ثابت بستر،یا ثابت تفکیک کمپلکس آنزیم-سوبسترا:

از معادله (6.6) واضح است که ثابت سوبسترا در غلظت بالایی از کمپلکس آنزیم- بستر کاهش می یابد، یعنی. با ثبات عالی بنابراین، ثابت سوبسترا، میل ترکیبی آنزیم و بستر و نسبت ثابت‌های سرعت برای تشکیل و تفکیک کمپلکس آنزیم-سوبسترا را مشخص می‌کند.

پدیده اشباع آنزیم با یک سوبسترا توسط Leonor Michaelis و Maud Mepten مورد مطالعه قرار گرفت. بر اساس پردازش ریاضی نتایج، معادله (6.7) را به دست آوردند که نام خود را دریافت کرد، که از آن مشخص است که در غلظت بالای بستر و مقدار کم ثابت بستر، سرعت واکنش آنزیمی تمایل دارد. به حداکثر برسد. با این حال، این معادله محدود است زیرا تمام پارامترها را در نظر نمی گیرد:

کمپلکس آنزیم-سوبسترا در طول واکنش می تواند در جهات مختلف تغییر شکل دهد:

• تفکیک به مواد اصلی؛
• به محصولی تبدیل شود که آنزیم بدون تغییر از آن جدا شود.

بنابراین، برای توصیف اثر کلی فرآیند آنزیمی، مفهوم ثابت مایکلیس K t،که رابطه ثابت های سرعت هر سه واکنش کاتالیز آنزیمی را بیان می کند (6.8). اگر هر دو عبارت بر ثابت سرعت واکنش تشکیل کمپلکس آنزیم- سوبسترا تقسیم شوند، عبارت (6.9) به دست می آید:

یک نتیجه مهم از رابطه (9.6) به دست می آید: ثابت مایکلیس همیشه از ثابت زیرلایه بزرگتر است k 2 / kv

به صورت عددی K tبرابر با چنین غلظتی از بستر است که در آن سرعت واکنش نصف حداکثر سرعت ممکن است و مطابق با چنین اشباع آنزیم با سوبسترا است، همانطور که در شکل. 6.5، باز آنجایی که در عمل همیشه رسیدن به اشباع کامل آنزیم با سوبسترا امکان پذیر نیست K tبرای مقایسه ویژگی های جنبشی آنزیم ها استفاده می شود.

سرعت واکنش آنزیمی در صورت اشباع ناقص آنزیم با سوبسترا (6.10) به غلظت کمپلکس آنزیم - سوبسترا بستگی دارد. ضریب تناسب ثابت واکنش برای آزادسازی آنزیم و محصول است، زیرا این امر غلظت کمپلکس آنزیم-سوبسترا را تغییر می دهد:

پس از تبدیل ها، با در نظر گرفتن وابستگی های ارائه شده در بالا، سرعت واکنش آنزیمی در صورت اشباع ناقص آنزیم با سوبسترا با معادله (6.11) توصیف می شود. به غلظت آنزیم، سوبسترا و میل ترکیبی آنها بستگی دارد Ks:

وابستگی گرافیکی سرعت واکنش آنزیمی به غلظت سوبسترا خطی نیست. همانطور که از شکل مشخص است. 6.6، با افزایش غلظت سوبسترا، افزایش فعالیت آنزیم مشاهده می شود. با این حال، هنگامی که حداکثر اشباع آنزیم با سوبسترا به دست می آید، سرعت واکنش آنزیمی به حداکثر می رسد. بنابراین، عامل محدود کننده سرعت واکنش، تشکیل کمپلکس آنزیم- سوبسترا است.

تمرین نشان داده است که غلظت بسترها، به عنوان یک قاعده، در مقادیر بسیار کمتر از واحد (10 6 -10 3 مول) بیان می شود. عمل کردن با چنین مقادیری در محاسبات بسیار دشوار است. بنابراین، G. Lineweaver و D. Burke پیشنهاد کردند که وابستگی گرافیکی سرعت واکنش آنزیمی را نه در مختصات مستقیم، بلکه در مختصات معکوس بیان کنند. آنها از این فرض برداشت کردند که برای مقادیر مساوی، متقابل آنها نیز برابر است:

برنج. 6.6.

پس از تبدیل عبارت (6.13)، عبارتی به دست می آید که نامیده می شود معادله لاین ویور-برک (6.14):

وابستگی گرافیکی معادله Lineweaver-Burk خطی است (شکل 6.7). خصوصیات جنبشی آنزیم به شرح زیر تعیین می شود:

• قطعه قطع شده روی محور y برابر است با 1/V;
• قطعه قطع شده روی محور x برابر 1- است /K t.

برنج. 6.7.

اعتقاد بر این است که روش Lineweaver - Burke به شما امکان می دهد حداکثر سرعت واکنش را با دقت بیشتری نسبت به مختصات مستقیم تعیین کنید. اطلاعات ارزشمندی در مورد مهار آنزیم نیز از این نمودار قابل استخراج است.

راه های دیگری برای تبدیل معادله Michaelis-Menten وجود دارد. وابستگی های گرافیکی در مطالعه تأثیر تأثیرات مختلف خارجی بر فرآیند آنزیمی استفاده می شود.