Acasă Motor Cromatografia HPLC. Cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC). Coloană de cromatografie de adsorbție lichidă

Motor

Cromatografia HPLC. Cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC). Coloană de cromatografie de adsorbție lichidă

9885 0

HPLC este o cromatografie pe coloană lichidă în care pot fi utilizate o varietate de mecanisme de sorbție. În esență, HPLC este o formă modernă de cromatografie clasică pe coloană lichidă. Unele dintre cele mai semnificative caracteristici de calitate ale HPLC sunt enumerate mai jos:
- viteza mare a procesului, care a făcut posibilă reducerea duratei de separare de la câteva ore și zile la minute;
- grad minim de estompare a zonelor cromatografice, ceea ce face posibilă separarea compușilor care diferă doar puțin în constantele de sorbție;
- un grad ridicat de mecanizare și automatizare a separării și procesării informațiilor, datorită căruia cromatografia lichidă pe coloană a atins un nou nivel de reproductibilitate și acuratețe.

Cercetările intense din ultimele decenii și cantitatea enormă de date experimentale acumulate ne permit acum să vorbim despre clasificarea variantelor în cadrul metodei cromatografiei lichide de înaltă performanță. Desigur, clasificarea după mecanismul de sorbție dat mai sus rămâne valabilă.

O clasificare comună se bazează pe polaritatea comparativă a fazelor mobile și staționare. În acest caz, se face o distincție între cromatografia în fază normală și cea inversă.

Cromatografia în fază normală (NPC) este o variantă a HPLC în care faza mobilă este mai puțin polară decât faza staționară și există motive de a crede că principalul factor care determină retenția este interacțiunea sorbaților direct cu suprafața sau volumul sorbantului.

Cromatografia în fază inversă (RPC) este o variantă a HPLC în care faza mobilă este mai polară decât faza staționară, iar retenția este determinată de contactul direct al moleculelor de sorbat cu suprafața sau volumul sorbantului; în acest caz, sorbații ionizați nu sunt schimbați cu ioni de fază mobilă absorbiți la suprafață.

Cromatografia cu schimb de ioni este o opțiune în care sorbția se realizează prin schimbul ionilor sorbiți ai fazei mobile cu ionii substanțelor care sunt cromatografiate; Cromatografia de schimb de ligand poate fi definită într-un mod complet analog.

Cromatografia pe adsorbanți modificați dinamic este o variantă a HPLC în care sorbatul nu interacționează direct cu suprafața sorbantului, ci intră în asociere cu moleculele straturilor de suprafață ale eluentului.
Cromatografia cu perechi de ioni este o variantă a cromatografiei în fază inversă a compușilor ionizați în care se adaugă un contraion hidrofob la faza mobilă, care modifică calitativ caracteristicile de sorbție ale sistemului.

Cromatografia de excludere a mărimii este o metodă de separare a compușilor după greutățile lor moleculare, bazată pe diferența în viteza de difuzie a moleculelor de diferite dimensiuni în porii fazei staționare.

Pentru HPLC, o caracteristică foarte importantă este dimensiunea absorbanților, de obicei 3-5 microni, acum până la 1,8 microni. Acest lucru permite ca amestecurile complexe de substanțe să fie separate rapid și complet (timp mediu de analiză de la 3 la 30 de minute).

Problema separării este rezolvată folosind o coloană cromatografică, care este un tub umplut cu un sorbant. La efectuarea unei analize, un lichid (eluent) cu o anumită compoziție este alimentat printr-o coloană cromatografică cu o viteză constantă. O doză de probă măsurată cu precizie este injectată în acest flux. Componentele unei probe introduse într-o coloană cromatografică, datorită afinităților diferite pentru sorbantul coloanei, se deplasează de-a lungul acesteia cu viteze diferite și ajung secvenţial la detector în momente diferite.

Astfel, coloana cromatografică este responsabilă de selectivitatea și eficiența separării componentelor. Prin selectarea diferitelor tipuri de coloane, se poate controla gradul de separare al analiților. Compușii sunt identificați după timpul lor de retenție. Determinarea cantitativă a fiecăreia dintre componente este calculată pe baza mărimii semnalului analitic măsurat folosind un detector conectat la ieșirea coloanei cromatografice.

Sorbenți. Dezvoltarea HPLC este în mare parte asociată cu crearea de noi generații de adsorbanți cu proprietăți cinetice bune și proprietăți termodinamice diverse. Principalul material pentru absorbanții în HPLC este silicagel. Este puternic mecanic și are o porozitate semnificativă, ceea ce conferă o capacitate mare de schimb cu dimensiuni mici ale coloanei. Dimensiunea cea mai comună a particulelor este de 5-10 microni. Cu cât este mai aproape de forma sferică a particulelor, cu atât rezistența la curgere este mai mică, cu atât eficiența este mai mare, mai ales dacă o fracțiune foarte îngustă este ecranată (de exemplu, 7 +1 microni).

Suprafața specifică a gelului de silice este de 10-600 m/g. Silicagelul poate fi modificat cu diferite grupări chimice grefate la suprafață (C-18, CN, NH2, SO3H), ceea ce permite utilizarea absorbanților pe baza acestuia pentru a separa o mare varietate de clase de compuși. Principalul dezavantaj al gelului de silice este rezistența chimică scăzută la pH< 2 и рН >9 (siliciul se dizolvă în alcalii și acizi). Prin urmare, în prezent există o căutare intensă de adsorbanți pe bază de polimeri stabili la pH de la 1 la 14, de exemplu, pe baza de metacrilat de polimetil, polistiren etc.

Sorbenți pentru cromatografie cu schimb de ioni. Datorită particularităților separării (în mediu acid sau alcalin), materialul principal este absorbant în polistiren cu divinilbenzen de diferite grade de reticulare cu SO3 -H+ (schimbătoare de cationi puternic acide) sau -COO-Naf (cation slab acid). schimbători), grupări -H2N+ (CH3) grefate pe suprafața lor 3Cl- (schimbătoare de anioni bazici puternici) sau -N+HR2Cl- (schimbătoare de anioni de bază slabe).

Absorbanți pentru cromatografia de permeație cu gel. Tipul principal este stirenul-DVB. De asemenea, se folosesc sticle macroporoase, metacrilat de metil și silicagel. Aceiași adsorbanți sunt utilizați pentru cromatografia de excludere ionică.
Pompe. Pentru a asigura debitul fazei mobile (MP) prin coloana cu parametrii specificați, se folosesc pompe de înaltă presiune. Cele mai importante caracteristici tehnice ale pompelor LC includ: intervalul de debit; presiunea maximă de lucru; reproductibilitatea fluxului; intervalul de pulsații de alimentare cu solvent.

În funcție de natura alimentării cu solvent, pompele pot fi de alimentare (debit) și presiune constantă. Practic, în timpul lucrului analitic, se utilizează un mod de debit constant, iar la umplerea coloanelor, se utilizează un mod de presiune constantă. Pe baza principiului lor de funcționare, pompele sunt împărțite în pompe cu seringă și pompe cu piston alternativ.

Pompe cu seringi. Pompele de acest tip se caracterizează printr-o absență aproape completă a pulsațiilor în fluxul fazei mobile în timpul funcționării. Dezavantaje ale pompei: a) consum mare de timp si solvent pentru spalare la schimbarea solventului; b) suspendarea separării în timpul umplerii pompei; c) dimensiuni și greutate mari, asigurând în același timp debit și presiune ridicate (este nevoie de un motor puternic și de o forță mare a pistonului cu suprafața sa mare).

Pompe cu piston alternativ. Pompele de acest tip asigură o alimentare volumetrică constantă a fazei mobile pentru o perioadă lungă de timp. Presiune maximă de lucru 300-500 atm, debit 0,01-10 ml/min. Reproductibilitatea debitului volumic este de 0,5%. Principalul dezavantaj este că solventul este furnizat sistemului sub forma unei serii de impulsuri succesive, deci există pulsații de presiune și debit.

Acesta este motivul principal pentru zgomotul crescut și sensibilitatea redusă a aproape tuturor detectorilor utilizați în LC, în special a celor electrochimici. Modalități de combatere a pulsațiilor: folosind pompe duble sau o pompă Bag-Lai cu piston dublu, folosind dispozitive de amortizare și dispozitive electronice.

Cantitatea de alimentare volumetrică este determinată de trei parametri: diametrul pistonului (de obicei 3,13; 5,0; 7,0 mm), amplitudinea acestuia (12-18 mm) și frecvența (care depinde de viteza de rotație a motorului și a cutiei de viteze).

Dozatoare. Scopul dozatorului este de a transfera o probă la presiunea atmosferică la intrarea unei coloane la o presiune de până la câteva atmosfere. Este important ca în dozator să nu existe volume „mort” care să nu poată fi spălate de faza mobilă și să nu existe erodare a probei în timpul dozării. La început, dozatoarele LC erau similare cu dozatoarele de gaz cu o perforare a membranei. Cu toate acestea, membranele nu rezistă la mai mult de 50-100 atm; rezistența lor chimică este insuficientă; piesele lor contaminează filtrele coloanei și capilarele.

Faza lichidă are o rată de difuzie mult mai mică decât faza gazoasă. Prin urmare, puteți doza prin oprirea fluxului - proba nu are timp să se erodeze în dozator. În timp ce proba este introdusă în dozator, o supapă specială oprește fluxul de solvent. Presiunea la intrarea în coloană scade rapid; după câteva secunde, proba poate fi injectată în camera dozatorului cu o microseringă convențională. Apoi, dozatorul este blocat, fluxul de solvent este pornit și are loc separarea.

Presiunea pe care o deține acest robinet este de până la 500-800 atm. Dar atunci când fluxul se oprește, echilibrul în coloană este perturbat, ceea ce poate duce la apariția unor vârfuri suplimentare „vacante”.

Dozatoarele cu buclă sunt cele mai utilizate. Când dozatorul este umplut, orificiile de admisie 1, 2 și canalul dintre ele sunt sub presiune ridicată. Intrările 3-6, canalele dintre ele și bucla de dozare sunt sub presiune atmosferică, ceea ce vă permite să umpleți bucla folosind o seringă sau o pompă. Când distribuitorul este rotit, fluxul fazei mobile deplasează proba în coloană. Pentru a reduce eroarea, bucla este spălată cu de 5-10 ori volumul probei. Dacă proba este mică, poate fi injectată în buclă cu o microseringă. Volumul buclei este de obicei de 5-50 µl.

PE. Voinov, T.G. Volova

Coloană de cromatografie de adsorbție lichidă

Separarea unui amestec de substanțe într-o coloană de adsorbție are loc ca urmare a diferenței lor de sorbție pe un adsorbant dat (în conformitate cu legea substituției adsorbției stabilită de M. S. Tsvet).

Adsorbanții sunt corpuri poroase cu o suprafață internă foarte dezvoltată care rețin lichidele folosind fenomene intermoleculare și de suprafață. Aceștia pot fi compuși anorganici și organici polari și nepolari. Adsorbanții polari includ silicagel (dioxid de siliciu gelatinos uscat), oxid de aluminiu, carbonat de calciu, celuloză, amidon etc. Adsorbanți nepolari - cărbune activ, pulbere de cauciuc și multe altele obținute sintetic.

Adsorbanților li se impun următoarele cerințe: S nu trebuie să intre în reacții chimice cu faza mobilă și substanțele separate; S trebuie să aibă rezistență mecanică; S granulele adsorbante trebuie să fie de același grad de dispersie.

La alegerea condițiilor pentru procesul cromatografic se iau în considerare proprietățile substanțelor adsorbante și adsorbite.

În versiunea clasică a cromatografiei pe coloană lichidă (LCC), un eluent (SF) este trecut printr-o coloană cromatografică, care este un tub de sticlă cu un diametru de 0,5 - 5 cm și o lungime de 20 - 100 cm, umplut cu un sorbant. (SF). Eluentul se deplasează sub influența gravitației. Viteza de mișcare a acestuia poate fi reglată folosind robinetul situat în partea de jos a coloanei. Amestecul de analizat este plasat în partea de sus a coloanei. Pe măsură ce proba se deplasează prin coloană, componentele se separă. La anumite intervale se selectează fracții din eluantul eliberat din coloană, care sunt analizate printr-o metodă care permite măsurarea concentrațiilor substanțelor aflate în determinare.

Cromatografia de adsorbție pe coloană este utilizată în prezent, în principal nu ca metodă independentă de analiză, ci ca metodă de separare preliminară (uneori finală) a amestecurilor complexe în altele mai simple, de exemplu. pentru pregătirea pentru analiză prin alte metode (inclusiv cromatografice). De exemplu, un amestec de tocoferoli este separat pe o coloană de alumină, eluentul este trecut și fracția de a-tocoferol este colectată pentru determinarea ulterioară prin metoda fotometrică.

Separarea cromatografică a unui amestec pe o coloană din cauza progresului lent al PF necesită mult timp. Pentru a accelera procesul, cromatografia se efectuează sub presiune. Această metodă se numește cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC)

Modernizarea echipamentelor utilizate în cromatografia clasică în coloană lichidă a făcut din aceasta una dintre cele mai promițătoare și moderne metode de analiză. Cromatografia lichidă de înaltă performanță este o metodă convenabilă pentru separarea, izolarea preparativă și analiza calitativă și cantitativă a compușilor termolabili nevolatili cu greutate moleculară mică și mare.

În funcție de tipul de sorbent utilizat, această metodă folosește 2 opțiuni de cromatografie: pe un sorbent polar folosind un eluent nepolar (opțiune cu fază directă) și pe un sorbent nepolar cu un eluant polar - așa-numitul înalt cu fază inversă. -cromatografie lichidă de performanţă (RPHLC).

Când eluentul trece la eluent, echilibrul este stabilit în condiții RPLC de multe ori mai rapid decât în condițiile sorbanților polari și PF-urilor neapoase. Ca urmare a acestui fapt, precum și confortul de a lucra cu eluanți apoși și apos-alcool, OFVLC a câștigat acum o mare popularitate. Majoritatea analizelor HPLC sunt efectuate folosind această metodă.

Echipament pentru HPLC

Un set de echipamente moderne pentru HPLC, de regulă, constă din două pompe 3,4 (Fig. 7.1.1.1), controlate de un microprocesor 5 și care furnizează eluent conform unui program specific. Pompele creează o presiune de până la 40 MPa. Proba este introdusă printr-un dispozitiv special (injector) 7 direct în fluxul de eluant. După trecerea prin coloana cromatografică 8, substanțele sunt detectate de un detector de flux 9 foarte sensibil, al cărui semnal este înregistrat și procesat de un microcalculator 11. Dacă este necesar, fracțiile sunt selectate automat în momentul în care apare vârful.

Coloanele pentru HPLC sunt realizate din oțel inoxidabil cu un diametru interior de 2–6 mm și o lungime de 10–25 cm.Coloanele sunt umplute cu sorbant (SF). Ca NF se folosesc silicagel, oxid de aluminiu sau adsorbanți modificați. Silicagelul este de obicei modificat prin introducerea chimică a diferitelor grupe funcționale pe suprafața sa.

Detectoare. Ieșirea unei componente individuale din coloană este înregistrată cu ajutorul unui detector. Pentru înregistrare, puteți utiliza o modificare a oricărui semnal analitic provenit din faza mobilă și asociată cu natura și cantitatea componentului amestecului. Cromatografia lichidă folosește semnale analitice precum absorbția luminii sau emisia de lumină a soluției de ieșire (detectori fotometrici și fluorimetrici), indicele de refracție (detectori refractometrici), conductivitatea potențială și electrică (detectori electrochimici) etc.

Semnalul detectat continuu este înregistrat de un reportofon. O cromatogramă este o secvență de semnale de detectoare înregistrate pe o bandă de înregistrare, generată atunci când componentele individuale ale unui amestec părăsesc coloana. Dacă amestecul este separat, vârfurile individuale sunt vizibile pe cromatograma externă. Poziția vârfului pe cromatogramă este utilizată în scopul identificării substanței, a înălțimii sau a zonei vârfului - în scopul determinării cantitative.

Analiza calitativa

Cele mai importante caracteristici ale cromatogramei - timpul de retenție tR și volumul reținut asociat - reflectă natura substanțelor, capacitatea lor de sorbție pe materialul în fază staționară și, prin urmare, în condiții de cromatografie constantă, reprezintă un mijloc de identificare a substanței. Pentru o coloană dată cu un anumit debit și temperatură, timpul de retenție al fiecărui compus este constant (Fig. 7.1.1.2), unde t.R(A) este timpul de retenție al componentului A al amestecului analizat din momentul intrării în coloana până când la ieșirea din coloană apare vârful maxim, 1K( hs) este timpul de retenție al etalonului intern (substanța inițial absentă din amestecul analizat), h este înălțimea vârfului (mm), cenușa este vârful lățime la jumătatea înălțimii, mm.

Pentru a identifica o substanță dintr-o cromatogramă, se folosesc de obicei eșantioane standard sau substanțe pure. Comparați timpul de retenție al componentei necunoscute IR* cu timpul de retenție IRCT al substanțelor cunoscute. Dar identificarea este mai fiabilă prin măsurarea timpului relativ de retenție

În acest caz, se introduce mai întâi în coloană o substanță cunoscută (standard intern) și se măsoară timpul de retenție al acesteia tR(Bc), apoi se separă cromatografic (cromatografiat) amestecul studiat, la care se adaugă mai întâi etalonul intern. Timpul de retenție relativ este determinat prin formula (7.1.1.1).

Analiza cantitativa

Această analiză se bazează pe dependența înălțimii vârfului h sau a ariei sale S de cantitatea de substanță. Pentru vârfurile înguste, este de preferat să se măsoare h, pentru vârfurile largi neclare - S. Aria vârfului se măsoară în diferite moduri: prin înmulțirea înălțimii vârfului (h) cu lățimea acestuia (ai/2), măsurată la jumătatea acestuia. înălțimea (Fig. 7.2.3); planificare; folosind un integrator. Cromatografele moderne sunt echipate cu integratoare electrice sau electronice.

Pentru a determina conținutul de substanțe dintr-o probă, se folosesc în principal trei metode: metoda de calibrare absolută, metoda de normalizare internă și metoda standard intern.

Metoda de calibrare absolută se bazează pe determinarea preliminară a relației dintre cantitatea de substanță introdusă și aria sau înălțimea vârfului din cromatogramă. O cantitate cunoscută din amestecul de calibrare este introdusă în cromatogramă și se determină zonele sau înălțimile vârfurilor rezultate. Construiți un grafic al dependenței zonei sau înălțimii vârfului de cantitatea de substanță administrată. Se analizează eșantionul de testat, se măsoară aria sau înălțimea vârfului componentei care se determină, iar cantitatea acesteia este calculată pe baza graficului de calibrare.

Această metodă oferă informații numai despre conținutul relativ al componentului din amestec, dar nu permite determinarea valorii sale absolute.

Metoda standard intern se bazează pe compararea unui parametru de vârf selectat al analitului cu același parametru al unei substanțe standard introdus în probă într-o cantitate cunoscută. O cantitate cunoscută dintr-o astfel de substanță standard este introdusă în proba de testat, al cărei vârf este destul de bine separat de vârfurile componentelor amestecului de testat.

Ultimele două metode necesită introducerea unor factori de corecție care caracterizează sensibilitatea detectorilor utilizați la substanțele analizate. Pentru diferite tipuri de detectoare și diferite substanțe, coeficientul de sensibilitate este determinat experimental.

Cromatografia de adsorbție lichidă folosește și analiza fracțiilor de soluție colectate în momentul în care substanța părăsește coloana. Analiza poate fi efectuată folosind diferite metode fizico-chimice.

Cromatografia de adsorbție lichidă este utilizată în primul rând pentru separarea substanțelor organice. Această metodă are mare succes în studierea compoziției uleiului, hidrocarburilor, separând eficient izomerii trans și cis, alcaloizii etc. Folosind HPLC, puteți determina coloranți, acizi organici, aminoacizi, zaharuri, impurități ale pesticidelor și erbicidelor, medicamentelor. substanțe și alți poluanți din produsele alimentare.

În cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC), natura proceselor care au loc în coloana cromatografică este în general identică cu procesele din cromatografia în gaz. Singura diferență este în utilizarea lichidului ca fază staționară. Datorită densității mari a fazelor mobile lichide și rezistenței mari a coloanelor, cromatografia de gaz și lichid diferă foarte mult în instrumentație.

În HPLC, solvenții puri sau amestecurile acestora sunt de obicei utilizați ca faze mobile.

Pentru a crea un flux de solvent pur (sau amestecuri de solvenți), numit eluent în cromatografia lichidă, se folosesc pompe incluse în sistemul hidraulic al cromatografului.

Cromatografia de adsorbție este efectuată ca urmare a interacțiunii unei substanțe cu adsorbanți, cum ar fi silicagel sau oxid de aluminiu, care au centrii activi la suprafață. Diferența în capacitatea de a interacționa cu centrele de adsorbție ale diferitelor molecule de probă duce la separarea acestora în zone în timpul mișcării cu faza mobilă de-a lungul coloanei. Separarea zonei a componentelor realizată în acest caz depinde de interacțiunea atât cu solventul, cât și cu adsorbantul.

Cele mai utilizate în HPLC sunt adsorbanții de silicagel cu diferite volume, suprafețe și diametre ale porilor. Oxidul de aluminiu și alți adsorbanți sunt folosiți mult mai rar. Motivul principal pentru aceasta:

rezistență mecanică insuficientă, care nu permite ambalarea și utilizarea la presiuni mari caracteristice HPLC;

silicagel, în comparație cu oxidul de aluminiu, are o gamă mai largă de porozitate, suprafață și diametru al porilor; Activitatea catalitică semnificativ mai mare a oxidului de aluminiu duce la denaturarea rezultatelor analizei din cauza descompunerii componentelor probei sau a chimiosorbției ireversibile a acestora.

Detectoare pentru HPLC

Cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC) este utilizată pentru a detecta substanțe polare nevolatile care, din anumite motive, nu pot fi transformate într-o formă adecvată pentru cromatografia în gaz, chiar și sub formă de derivați. Astfel de substanțe, în special, includ acizi sulfonici, coloranți solubili în apă și unele pesticide, de exemplu derivați de fenil-uree.

Detectoare:

Detector UV pe o matrice de diode. O „matrice” de fotodiode (mai mult de două sute dintre ele) înregistrează în mod constant semnale în regiunile UV și vizibile ale spectrului, oferind astfel înregistrarea spectrelor UV-B în modul de scanare. Acest lucru vă permite să înregistrați continuu, la sensibilitate ridicată, spectre nedistorsionate ale componentelor care trec rapid printr-o celulă specială.

În comparație cu detecția cu o singură lungime de undă, care nu oferă informații despre puritatea maximă, capacitatea de a compara spectre complete ale unei rețele de diode oferă un grad mult mai mare de încredere în rezultatul identificării.

Detector de fluorescență. Marea popularitate a detectorilor fluorescenți se datorează selectivității și sensibilității lor foarte ridicate, precum și faptului că mulți poluanți ai mediului fluoresc (ex. hidrocarburi poliaromatice).

Detector electrochimic utilizat pentru detectarea substanțelor care se oxidează sau se reduc cu ușurință: fenoli, mercaptani, amine, derivați aromatici de azot și halogen, aldehide, cetone, benzidine.

În timpul tranziției de la eluent la eluent, echilibrul în condiții HPLC este stabilit de multe ori mai repede decât în condițiile de adsorbanți polari și PF-uri neapoase. Ca urmare a acestui fapt, precum și confortul de a lucra cu eluanți apoși și apos-alcool, OFVLC a câștigat acum o mare popularitate. Majoritatea analizelor HPLC sunt efectuate folosind această metodă.

Detectoare. Ieșirea unei componente individuale din coloană este înregistrată cu ajutorul unui detector. Pentru înregistrare, puteți utiliza o modificare a oricărui semnal analitic provenit din faza mobilă și asociată cu natura și cantitatea componentului amestecului. Cromatografia lichidă folosește semnale analitice precum absorbția luminii sau emisia de lumină a soluției de ieșire (detectori fotometrici și fluorimetrici), indicele de refracție (detectori refractometrici), conductivitatea potențială și electrică (detectori electrochimici) etc.

Semnalul detectat continuu este înregistrat de un reportofon. O cromatogramă este o secvență de semnale de detectoare înregistrate pe o bandă de înregistrare, generată atunci când componentele individuale ale unui amestec părăsesc coloana. Dacă amestecul este separat, vârfurile individuale sunt vizibile pe cromatograma externă. Poziția vârfului în cromatogramă este utilizată în scopul identificării substanței, a înălțimii sau a zonei vârfului - în scopul determinării cantitative.

„Cromatografie lichidă de înaltă performanță a poluanților din apele naturale și uzate”

Introducere

Capitolul 1. Concepte de bază și clasificare a metodelor de cromatografie lichidă

1.1 Echipamente pentru cromatografie lichidă

Capitolul 2. Esența HPLC

2.1 Aplicare

Capitolul 3. Exemple de utilizare a HPLC în analiza obiectelor din mediu

Capitolul 4. Echipamente HPLC

Literatură

Aplicație

Introducere

Metode cromatografice adesea se dovedesc indispensabile pentru identificarea și cuantificarea substanțelor organice cu structuri similare. Cu toate acestea, cromatografia de gaze și cromatografia lichidă de înaltă performanță sunt cele mai utilizate pe scară largă pentru analiza de rutină a poluanților de mediu. Analiza cromatografică gazoasă a poluanților organici din apele potabile și uzate s-a bazat inițial pe utilizarea coloanelor împachetate, iar ulterior coloanele capilare de cuarț au devenit larg răspândite. Diametrul intern al coloanelor capilare este de obicei de 0,20-0,75 mm, lungime - 30-105 m. Rezultatele optime la analiza poluanților din apă sunt cel mai adesea obținute la utilizarea coloanelor capilare cu grosimi diferite de film de siliconi metilfenil cu un conținut de grupe fenil de 5 si 50%. Punctul slab al tehnicilor cromatografice care folosesc coloane capilare este adesea sistemul de introducere a probei. Sistemele de introducere a probelor pot fi împărțite în două grupe: universale și selective. Cele universale includ sisteme de injecție split și splitless, injecție „rece” în coloană și evaporare cu programare de temperatură. Când este utilizată intrare selectivă, purjare cu captură intermediară într-o capcană, analiza spațiului de cap etc. Când se utilizează sisteme de injecție universale, întreaga probă intră în coloană; în cazul injecției selective, se introduce doar o anumită fracțiune. Rezultatele obținute cu injecția selectivă sunt semnificativ mai precise, deoarece fracția care intră în coloană conține doar substanțe volatile, iar tehnica poate fi complet automatizată.

Detectoarele gaz-cromatografice utilizate în monitorizarea poluanților sunt adesea împărțite în universale, care răspund la fiecare componentă în faza mobilă, și selective, care răspund la prezența în faza mobilă a unui anumit grup de substanțe cu caracteristici chimice similare. Detectoarele universale includ ionizare cu flacără, emisie atomică, detectoare cu spectrometrie de masă și spectrometrie în infraroșu. Detectoarele selective utilizate în analiza apei sunt captarea de electroni (selectivă pentru substanțele care conțin atomi de halogen), termoionică (selectivă pentru compușii care conțin azot și fosfor), fotoionizarea (selectivă pentru hidrocarburi aromatice), detectorul de conductivitate electrolitică (selectiv pentru compușii care conțin atomi de halogeni). , sulf și azot). Cantitățile minime detectabile de substanțe variază de la nanograme la picograme pe secundă.

Cromatografie lichidă de înaltă performanță(HPLC) este o metodă ideală pentru determinarea unui număr mare de compuși labili din punct de vedere termic care nu pot fi analizați prin cromatografie gazoasă. Produsele agrochimice moderne, care includ carbonați de metil și insecticide organofosforice și alte substanțe nevolatile, sunt adesea obiectul analizei prin cromatografia lichidă. Cromatografia lichidă de înaltă performanță devine din ce în ce mai răspândită printre alte metode utilizate în monitorizarea mediului, și pentru că are perspective strălucitoare în ceea ce privește automatizarea pregătirii probelor.

CAPITOLUL 1. CONCEPTE DE BAZĂ ȘI CLASIFICAREA METODELOR DE CROMATOGRAFIE LICHIDĂ

Cromatografia lichidă este împărțită în mai multe clase în funcție de tipul de purtător de fază staționară. Simpla instrumentare a cromatografiei pe hârtie și în strat subțire a condus la utilizarea pe scară largă a acestor metode în practica analitică. Cu toate acestea, marile capacități ale cromatografiei lichide pe coloană au stimulat îmbunătățirea echipamentelor pentru această metodă clasică și au condus la introducerea rapidă a HPLC. Trecerea eluentului prin coloană sub presiune înaltă a făcut posibilă creșterea dramatică a vitezei de analiză și creșterea semnificativă a eficienței separării datorită utilizării sorbantului fin dispersat. Metoda HPLC permite în prezent izolarea, analiza cantitativă și calitativă a amestecurilor complexe de compuși organici.

Pe baza mecanismului de interacțiune a substanței care este separată (eluat) cu faza staționară, se disting cromatografia de adsorbție, partiție, schimb ionic, excludere, pereche de ioni, schimb de liganzi și cromatografia de afinitate.

Cromatografia de adsorbție. Separarea prin cromatografie de adsorbție se realizează ca urmare a interacțiunii substanței care este separată cu un adsorbant, cum ar fi oxid de aluminiu sau silicagel, care are centri polari activi la suprafață. Solventul (eluentul) este un lichid nepolar. Mecanismul de sorbție constă într-o interacțiune specifică între suprafața polară a sorbantului și secțiunile polare (sau capabile de polarizare) ale moleculelor componentei analizate (Fig. 1).

Orez. 1. Cromatografia lichidă de adsorbție.

Cromatografia de partiție. În varianta de distribuție a cromatografiei lichide, separarea unui amestec de substanțe se realizează datorită diferenței dintre coeficienții lor de distribuție între două faze nemiscibile - eluantul (fază mobilă) și faza situată pe sorbent (faza staționară).

La faza normala Cromatografia lichidă de partiție utilizează un eluent nepolar și grupări polare grefate pe suprafața sorbantului (cel mai adesea silicagel). Alchilclorosilanii substituiți care conțin grupări polare cum ar fi nitril, grupare amino etc. sunt utilizați ca modificatori de suprafață de silicagel (faze grefate) (Fig. 2). Utilizarea fazelor altoite face posibilă controlul fin al proprietăților de sorbție ale suprafeței fazei staționare și obținerea unei eficiențe ridicate de separare.

Orez. 2. Cromatografia de partiție cu fază grefată (opțiune de fază normală).

Faza inversata cromatografia lichidă se bazează pe distribuția componentelor amestecului între un eluent polar și grupări nepolare (lanțuri lungi de alchil) grefate pe suprafața sorbantului (Fig. 3).

Orez. 3. Cromatografia de partiție cu fază grefată (opțiune cu fază inversă).

O variantă mai puțin utilizată a cromatografiei lichide în fază suportată este cea în care o fază staționară lichidă este depusă pe un suport staționar.

Exclusiv (pentru gel) cromatografia este o variantă a cromatografiei lichide în care separarea substanțelor are loc datorită distribuției moleculelor între solventul situat în porii sorbentului și solventul care curge între particulele acestuia.

Afină cromatografia se bazează pe interacțiuni specifice ale proteinelor separate (anticorpi) cu substanțe (antigene) grefate pe suprafața sorbantului (rășină sintetică), care formează selectiv complexe (conjugate) cu proteine.

Schimbul de ioni, perechea de ioni și cromatografia de schimb de liganzi sunt utilizate în principal în analiza anorganică.

Parametrii de bază ai separării cromatografice.

Principalii parametri ai separării cromatografice sunt volumul de retenție și timpul de retenție al componentei amestecului (Fig. 4).

Timpul de retenție tR este timpul scurs din momentul introducerii probei în coloană până la eliberarea maximului vârfului corespunzător. Înmulțind timpul de retenție cu viteza volumetrică a eluentului F, obținem volumul de retenție VR:

Timpul de retenție corectat este timpul scurs de la apariția vârfului maxim al componentei nesorbite până la vârful compusului corespunzător:

tR" = tR - t0 ;

Volumul de retenție normalizat sau corectat este volumul de retenție corectat pentru volumul mort al coloanei V0, adică volumul de retenție al componentei nesorbite:

VR" = VR - V0;

O caracteristică a retenției este și coeficientul de capacitate k", definit ca raportul dintre masa unei substanțe în faza staționară și masa unei substanțe în faza mobilă: k" = mn / mp;

Valoarea k" poate fi determinată cu ușurință din cromatogramă:

Cei mai importanți parametri ai separării cromatografice sunt eficiența și selectivitatea acesteia.

Eficiența coloanei, măsurată prin înălțimea plăcilor teoretice (HETP) și invers proporțională cu numărul acestora (N), este mai mare, cu cât vârful substanței eliberate în același timp de retenție este mai îngust. Valoarea eficienței poate fi calculată din cromatogramă folosind următoarea formulă:

N = 5,54. (tR / 1/2) 2 ,

Unde tR- timp de retenție,

w 1/2 - lățimea vârfului la jumătatea înălțimii

Cunoscând numărul de plăci teoretice pe coloană, lungimea coloanei L și diametrul mediu al granulelor de absorbant dc, este ușor de obținut valorile înălțimii echivalente cu placa teoretică (HETT) și înălțimea redusă (RHETT):

HETT = L/N PVET = HETT/d c

Aceste caracteristici fac posibilă compararea eficienței diferitelor tipuri de coloane, evaluarea calității sorbantului și a calității umplerii coloanelor.

Selectivitatea pentru separarea a două substanțe este determinată de ecuația:

Când luăm în considerare separarea unui amestec de două componente, gradul de separare RS este, de asemenea, un parametru important:

;

Vârfurile sunt considerate rezolvate dacă valoarea RS este mai mare sau egală cu 1,5.

Principalii parametri cromatografici sunt legați de următoarea ecuație pentru rezoluție:

;

Factorii care determină selectivitatea separării sunt:

1) natura chimică a sorbantului;

2) compoziția solventului și a modificatorilor săi;

3) structura chimică și proprietățile componentelor amestecului care se separă;

4) temperatura coloanei

1.1 Echipamente pentru cromatografie lichidă

În cromatografia lichidă modernă, sunt utilizate instrumente de diferite grade de complexitate - de la cele mai simple sisteme până la cromatografe de înaltă clasă echipate cu diferite dispozitive suplimentare.

În fig. 4. Se prezintă o schemă bloc a unui cromatograf lichid, care conține setul minim necesar de componente, într-o formă sau alta, prezente în orice sistem cromatografic.

Orez. 4. Schema bloc a unui cromatograf lichid.

Pompa (2) este proiectată pentru a crea un debit constant de solvent. Designul său este determinat în primul rând de presiunea de funcționare din sistem. Pentru a funcționa în intervalul 10-500 MPa, se folosesc pompe de tip piston (seringă) sau cu piston. Dezavantajul primului este necesitatea opririlor periodice pentru umplerea cu eluent, iar al doilea este complexitatea mai mare a designului și, în consecință, prețul ridicat. Pentru sistemele simple cu presiuni de funcționare scăzute de 1-5 MPa, se folosesc cu succes pompe peristaltice ieftine, dar deoarece este dificil să se obțină o presiune și un debit constant, utilizarea lor este limitată la sarcini pregătitoare.

Injectorul (3) asigură introducerea în coloană a unei probe dintr-un amestec de componente care se separă cu o reproductibilitate destul de ridicată. Sistemele simple de injectare a probei „stop-flow” necesită oprirea pompei și, prin urmare, sunt mai puțin convenabile decât pipetele cu buclă dezvoltate de Reodyne.

Coloanele HPLC (4) sunt tuburi din oțel inoxidabil cu pereți groși care pot rezista la presiuni mari. Densitatea și uniformitatea ambalării coloanei cu sorbant joacă un rol important. Coloanele de sticlă cu pereți groși sunt utilizate cu succes pentru cromatografia lichidă la presiune joasă. Temperatura constantă este asigurată de un termostat (5).

Detectoarele (6) pentru cromatografie lichidă au o celulă de curgere în care are loc o măsurare continuă a unei proprietăți a eluentului care curge. Cele mai populare tipuri de detectoare de uz general sunt refractometrele, care măsoară indicele de refracție și detectoarele spectrofotometrice, care măsoară absorbanța unui solvent la o lungime de undă fixă (de obicei în regiunea ultravioletă). Avantajele refractometrelor (și dezavantajele spectrofotometrelor) includ sensibilitatea scăzută la tipul de compus determinat, care poate să nu conțină grupări cromofore. Pe de altă parte, utilizarea refractometrelor este limitată la sisteme izocratice (cu o compoziție de eluent constantă), astfel încât utilizarea unui gradient de solvent în acest caz este imposibilă.

Coloanele HPLC, care sunt cele mai des utilizate în analiza poluanților de mediu, au 25 cm lungime și un diametru interior de 4,6 mm și sunt împachetate cu particule sferice de silicagel de 5-10 µm grefate cu grupări octadecil. În ultimii ani, au devenit disponibile coloane cu diametre interne mai mici umplute cu particule mai mici. Utilizarea unor astfel de coloane duce la o reducere a consumului de solvenți și a timpului de analiză, o creștere a sensibilității și a eficienței separării și, de asemenea, simplifică problema conectării coloanelor la detectoarele spectrale. Coloanele cu diametrul interior de 3,1 mm sunt echipate cu un cartus de siguranta (precoloana) pentru a creste durata de viata si a imbunatati reproductibilitatea analitica.

Detectoarele utilizate în instrumentele HPLC moderne sunt de obicei un detector cu matrice de diode UV, un detector fluorescent și un detector electrochimic.

Trebuie avut în vedere că în munca practică, separarea are loc adesea nu printr-unul, ci prin mai multe mecanisme simultan. Astfel, separarea prin excludere poate fi complicată de efectele de adsorbție, separarea prin adsorbție prin efectele de distribuție și invers. Mai mult, cu cât diferența dintre substanțele din probă este mai mare în ceea ce privește gradul de ionizare, bazicitate sau aciditate, greutate moleculară, polarizabilitate și alți parametri, cu atât este mai mare probabilitatea unui mecanism de separare diferit pentru astfel de substanțe.

În practică, cea mai răspândită este cromatografia în „fază inversă” (distribuție), în care faza staționară nu este polară, dar faza mobilă este polară (adică inversul cromatografia în „fază directă”).

În majoritatea laboratoarelor din întreaga lume, un grup de 16 HAP prioritare sunt analizate prin HPLC sau CMS.

CAPITOLUL 2. ESENȚA HPLC

În HPLC, solvenții puri sau amestecurile acestora sunt de obicei utilizați ca faze mobile.

Pentru a crea un flux de solvent pur (sau amestecuri de solvenți), numit eluent în cromatografia lichidă, se folosesc pompe incluse în sistemul hidraulic al cromatografului.

Rezistenta mecanica insuficienta, care nu permite ambalarea si utilizarea la presiuni mari caracteristice HPLC;

silicagel, în comparație cu oxidul de aluminiu, are o gamă mai largă de porozitate, suprafață și diametru al porilor; Activitatea catalitică semnificativ mai mare a oxidului de aluminiu duce la denaturarea rezultatelor analizei din cauza descompunerii componentelor probei sau a chimiosorbției ireversibile a acestora.

Detectoare pentru HPLC

Detectoare:

Detector de fluorescență. Marea popularitate a detectorilor fluorescenți se datorează selectivității și sensibilității lor foarte ridicate, precum și faptului că mulți poluanți ai mediului fluoresc (ex. hidrocarburi poliaromatice).

Un detector electrochimic este utilizat pentru a detecta substanțe care se oxidează sau se reduc cu ușurință: fenoli, mercaptani, amine, derivați aromatici nitro și halogen, aldehide, cetone, benzidine.

Semnalul detectat continuu este înregistrat de un reportofon. O cromatogramă este o secvență de semnale de detectoare înregistrate pe o bandă de înregistrare, generată atunci când componentele individuale ale unui amestec părăsesc coloana. Dacă amestecul este separat, vârfurile individuale sunt vizibile pe cromatograma externă. Poziția vârfului în cromatogramă este utilizată în scopul identificării substanței, a înălțimii sau a zonei vârfului - în scopul determinării cantitative.

2.1 Aplicare

HPLC este utilizat pe scară largă în următoarele domenii de analiză chimică (sunt evidențiate obiectele de analiză în care HPLC practic nu are concurență):

· Controlul calitatii alimentelor - aditivi tonici si aromatizanti, aldehide, cetone, vitamine, zaharuri, coloranti, conservanti, medicamente hormonale, antibiotice, triazine, carbamat si alte pesticide, micotoxine, nitrozamine, hidrocarburi aromatice policiclice etc.

· Protecția mediului - fenoli, compuși organici nitro, hidrocarburi aromatice mono- și policiclice, o serie de pesticide, anioni și cationi principali.

· Criminalistică - droguri, explozivi organici și coloranți, produse farmaceutice puternice.

· Industria farmaceutică - hormoni steroizi, aproape toate produsele de sinteză organică, antibiotice, preparate polimerice, vitamine, preparate proteice.

· Medicină - substanțele biochimice și medicinale enumerate și metaboliții acestora din fluidele biologice (aminoacizi, purine și pirimidine, hormoni steroizi, lipide) în diagnosticarea bolilor, determinarea ratei de eliminare a medicamentelor din organism în scopul dozării lor individuale.

· Agricultura – determinarea nitraților și fosfatului în sol pentru determinarea cantității necesare de îngrășăminte aplicate, determinarea valorii nutritive a furajelor (aminoacizi și vitamine), analiza pesticidelor din sol, apă și produse agricole.

· Biochimie, chimie bioorganică, inginerie genetică, biotehnologie - zaharuri, lipide, steroizi, proteine, aminoacizi, nucleozide și derivații acestora, vitamine, peptide, oligonucleotide, porfirine etc.

· Chimie organică - toți produsele stabile de sinteză organică, coloranți, compuși termolabili, compuși nevolatili; chimie anorganică (aproape toți compușii solubili sub formă de ioni și compuși complecși).

· controlul calității și siguranței alimentelor, băuturilor alcoolice și nealcoolice, apei potabile, substanțelor chimice de uz casnic, parfumurilor în toate etapele producției acestora;

· determinarea naturii poluării la locul unui dezastru provocat de om sau al unei urgențe;

· detectarea și analiza substanțelor narcotice, puternice, otrăvitoare și explozive;

· determinarea prezenței substanțelor nocive (hidrocarburi policiclice și alte aromatice, fenoli, pesticide, coloranți organici, ioni de metale grele, alcaline și alcalino-pământoase) în efluenții lichizi, emisiile atmosferice și deșeurile solide din întreprinderi și în organismele vii;

· monitorizarea proceselor de sinteza organica, rafinarea petrolului si carbunelui, productia biochimica si microbiologica;

analiza calității solului pentru fertilizare, prezența pesticidelor și erbicidelor în sol, apă și produse, precum și valoarea nutritivă a furajelor; sarcini complexe de cercetare analitică; obţinerea de microcantităţi de substanţe ultrapure.

CAPITOLUL 3. EXEMPLE DE UTILIZARE HPLC ÎN ANALIZA OBIECTELOR DE MEDIU

HPLC este o metodă de monitorizare a HAP în obiectele din mediu

Pentru hidrocarburile aromatice policiclice (HAP), substanțele ecotoxice din clasa I de pericol, au fost stabilite niveluri extrem de scăzute ale concentrațiilor maxime admisibile (MAC) în obiectele naturale. Determinarea HAP la nivelul MPC și mai jos este una dintre cele mai complexe probleme analitice, iar pentru rezolvarea acestora sunt folosite metode analitice de înaltă tehnologie (GC-MS, GC, HPLC). La alegerea unei metode de monitorizare, la principalele caracteristici luate în considerare se adaugă sensibilitatea și selectivitatea, viteza și eficiența, deoarece monitorizarea presupune analize în serie. Opțiunea HPLC pe coloane scurte, cu diametru mic, îndeplinește în mare măsură aceste cerințe. Folosind această metodă, autorii au dezvoltat și certificat metode de monitorizare a benzo[a]pirenului în trei medii naturale: aerosoli, strat de zăpadă și apă de suprafață. Metodele se caracterizează prin: prepararea simplă a probelor standardizate, inclusiv extracția HAP cu solvenți organici și concentrarea extractului, introducerea directă a extractului concentrat într-o coloană cromatografică, utilizarea detectiei fotometrice cu lungimi de undă multiple în regiunea UV a spectrului, identificarea vârfurilor PAH în cromatograme folosind doi parametri, timpul de retenție și raportul spectral. Eroarea totală nu depășește 10% la determinarea benzo[a]pirenului în aerosol în intervalul de concentrație de la 0,3 la 450 ng/m3, în apa de suprafață în intervalul de concentrație de la 10 la 1000 ng/l, în stratul de zăpadă de suprafață interval de densitate de la 0,5 până la 50 μg/m2. Pentru cazul determinării simultane a HAP prioritare (până la 12 compuși) și înregistrarea vârfurilor neomogene de analiți, s-a propus separarea repetată a extractului prin modificarea selectivității fazei mobile, a lungimii de undă de detecție și a temperaturii coloanei, ținând cont de individualitatea. se determină proprietăţile HAP.

1 . Calitatea aerului ambiental. Concentrația în masă a benzo[a]pirenului. Metodologie de realizare a măsurătorilor prin metoda HPLC. Certificat de certificare MVI nr. 01-2000.

2 . Calitatea apelor uzate de suprafață și tratate. Concentrația în masă a benzo[a]pirenului. Metodologie de realizare a măsurătorilor prin metoda HPLC. Certificat de certificare MVI nr. 01-2001.

3 . Calitatea stratului de zăpadă. Concentrația în masă a benzo[a]pirenului. Metodologie de realizare a măsurătorilor prin metoda HPLC. Certificat de certificare MVI nr. 02-2001.

Îndepărtarea anilinei din soluțiile apoase folosind deșeuri de la reducerea aluminotermă a calcarului de cupru

Problema eliminării hidrocarburilor din apele uzate este o sarcină urgentă. În multe industrii chimice, petrochimice și alte industrii se formează anilina și derivații săi, care sunt substanțe toxice. Anilina este o substanță foarte toxică, MPC - 0,1 mg/m 3. Anilina și derivații săi sunt solubili în apă și, prin urmare, nu pot fi îndepărtați prin sedimentare gravitațională.

Una dintre cele mai bune metode de tratare a apelor uzate din poluanți organici este utilizarea adsorbanților anorganici și organici care pot fi regenerați (aluminosilicați, argile modificate, lemn, fibre etc.) și incapabili de regenerare (cărbune activ, materiale polimerice macroporoase etc.). ).

Adsorbanții regenerabili pot elimina din apă substanțele organice cu polarități diferite. Căutarea adsorbanților eficienți este o sarcină urgentă.

Acest raport prezintă rezultatele unui studiu în domeniul utilizării cântarilor de cupru laminat de la Uzina de cabluri din Erevan (OPMOErKZ) ca absorbanți de anilină.

Studiile cromatografice au fost efectuate pe un cromatograf HPLC / cromatografie lichidă de înaltă performanță / sisteme (Waters 486 - detector, Waters 600S - controler, Waters 626 - Pompă), pe o coloană de 250 x 4 mm umplută cu absorbanții studiati, mobilul viteza de fază a fost de 1 ml/m / faza mobilă sunt solvenții pe care îi studiem/, detectorul este UV-254. Analiza spectroscopică UV a fost efectuată pe un spectrofotometru Specord-50; spectrele au fost obținute folosind programul de calculator ASPECT PLUS.

La anumite volume de anilină din apă au fost adăugate porții de adsorbanți cântărite cu precizie, ale căror concentrații inițiale au fost variate. Amestecul a fost agitat bine timp de 6 ore, apoi proba a fost lăsată să se sedimenteze. Adsorbția este finalizată aproape în 48 de ore.Cantitatea de anilină precipitată este determinată prin analiză spectrofotometrică UV și refractometrică.

În primul rând, proprietățile de adsorbție ale OPMOErKZ au fost studiate la îndepărtarea anilinei dintr-o soluție în tetraclorură de carbon. S-a dovedit că anilina absoarbe cel mai bine sorbentul 3 (tabel).

S-au efectuat măsurători și pentru soluții apoase de anilină în concentrații de 0,01-0,0001 mol/l. Tabelul prezintă datele pentru o soluție de 0,01 M.

Absorbția anilinei de către diverși adsorbanți dintr-o soluție apoasă 0,01 M de anilină la 20°C

S-a stabilit anterior că adsorbția în intervalele de concentrație specificate crește și depinde liniar de indicele de refracție. Cantitatea de anilină a fost determinată din relația grafică „indice de refracție - concentrație molară” și corectată prin date atât din cromatografia lichidă, cât și din analiza spectrală UV.

Cel mai activ sorbent pentru soluții apoase este sorbentul 3. Cantitatea de poluant adsorbit a fost calculată ca diferență între cantitatea totală de poluant adăugată la soluția inițială și reziduul acestuia în soluția finală.

Metode de determinare a HAP în obiectele din mediu

În mod obișnuit, metodele de cromatografie gazoasă (GC) și cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) sunt utilizate pentru a determina HAP. Separarea principalelor 16 PAH suficiente pentru analiza cantitativă se realizează fie prin utilizarea coloanelor capilare în cromatografia în gaz, fie a coloanelor de înaltă performanță utilizate în HPLC. Trebuie amintit că o coloană care separă bine amestecurile de calibrare a șaisprezece PAH nu garantează că acestea vor fi, de asemenea, bine separate de fundalul compușilor organici însoțitori din probele studiate.

Pentru a simplifica analiza, precum și pentru a obține rezultate de înaltă calitate, majoritatea procedurilor analitice conțin o etapă de izolare preliminară (separare) a HAP din alte grupe de compuși asociați din probe. Cel mai adesea, metodele de cromatografie lichidă la presiune joasă sunt utilizate în aceste scopuri într-un sistem lichid-solid sau lichid-lichid folosind mecanisme de adsorbție, de exemplu folosind silicagel sau alumină, uneori se folosesc mecanisme mixte, de exemplu adsorbția și excluderea folosind Sephadex.

Utilizarea purificării preliminare a probelor permite evitarea influenței:

Compuși complet nepolari, cum ar fi hidrocarburile alifatice;

Compuși polari moderat și puternic, de exemplu, ftalan, fenoli, alcooli polihidroxilici, acizi;

Compuși cu greutate moleculară mare, cum ar fi rășinile.

Există în principal două tipuri de detectoare utilizate în cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC): un detector fluorimetric sau un detector spectrofotometric cu matrice de fotodiode. Limita de detecție a HAP în detecția fluorimetrică este foarte scăzută, ceea ce face această metodă deosebit de potrivită pentru determinarea urmelor de compuși poliaromatici. Cu toate acestea, detectoarele fluorimetrice clasice nu oferă practic nicio informație despre structura compusului studiat. Modelele moderne fac posibilă înregistrarea spectrelor de fluorescență care sunt caracteristice compușilor individuali, dar acestea nu sunt încă utilizate pe scară largă în practica de măsurare de rutină. Un detector spectrofotometric cu o matrice de fotodiode (PDL) face posibilă înregistrarea spectrelor de absorbție în domeniul spectral UV și vizibil; aceste spectre pot fi utilizate pentru identificare. Informații similare pot fi obținute folosind detectoare cu scanare rapidă.

La selectarea tehnicilor analitice pentru separarea, identificarea și analiza cantitativă a acestor HAP, trebuie să se țină seama de următoarele condiții:

Nivelul conținuturilor determinate în probele de testat;

Numărul de substanțe înrudite;

Procedura analitică utilizată (tehnica de măsurare);

Capabilitățile echipamentelor în serie.

Dezvoltarea unei metode pentru determinarea elementelor alcalino-pământoase și a magneziului folosind cromatografia lichidă de înaltă performanță ionică

Dezvoltarea și îmbunătățirea metodelor care permit rezolvarea problemelor de analiză a apei este o problemă importantă în chimia analitică. Dezvoltarea cromatografiei lichide de înaltă performanță la presiune înaltă a stimulat dezvoltarea unei noi direcții în cromatografia cu schimb de ioni, așa-numita cromatografie ionică. Sinteza absorbanților pentru cromatografia ionică este dificilă, deoarece există destul de multe cerințe pentru aceștia. Din cauza lipsei schimbătoarelor de cationi foarte eficiente disponibile comercial, a fost utilizată o fază inversă modificată dinamic, pentru care a fost sintetizat un modificator: acid N-hexadecil-N-decanoil-paraminobenoilsulfonic etil-diizopropilamoniu (DHDAS), în care amina hidrofobă care conține SO 3 - grup, capabil de schimb de cationi. După trecerea soluției modificatoare, absorbția la l = 260 nm a atins 6,4 unități de densitate optică (°E) și a atins un platou. Capacitatea de schimb ionic calculată este de 15,65 µmol. Deoarece cationii elementelor alcalino-pământoase și magneziul nu se absoarbe în regiunea UV a spectrului, a fost utilizată detectarea UV indirectă folosind un eluant sintetizat de absorbție a UV 1,4-dipiridiniubutan bromură (bromură DPB). Deoarece ionii de halogen distrug părțile de oțel ale coloanei, ionul de bromură al 1,4-dipiridiniubutanului a fost înlocuit cu ionul acetat. La spălarea coloanei cu eluent, contraionul modificatorului, etildiizopropilamoniul, este înlocuit cu ionul absorbant UV 1,4-dipiridiniubutan. Separarea cationilor a fost efectuată la lungimea de undă optimă l = 260 nm pe o scară de 0,4 A în modul „scara pliabilă”; Polaritatea reportofonului a fost inversată. Separarea tuturor cationilor studiați a fost realizată prin adăugarea unui aditiv de complexare - acid oxalic. Limitele de detecție pentru Mg 2+ , Ca 2+ , Sr 2+ , Ba 2+ sunt de 8 μg/L; 16 ug/l; 34 ug/l; respectiv 72 µg/l. În condiţiile selectate, s-a analizat apă de la robinet, conţinutul de Ca2+ în care a fost de 10,6 + 1,9 mg-ion/l, Mg2+ -2,5 + mg-ion/l. Eroarea de reproductibilitate nu depășește -2,2% pentru Ca2+ și 1,4% pentru Mg2+.

Analiza complexelor de cadmiu din mediu

Pentru a studia mecanismele de migrare a metalelor grele în biosferă, sunt necesare date despre formele chimice de existență a metalelor în natură. Dificultățile în analiza compușilor unuia dintre cele mai toxice metale - cadmiul - se datorează faptului că formează complexe fragile, iar atunci când se încearcă izolarea acestora, echilibrele naturale sunt distorsionate. În această lucrare, compușii de cadmiu din sol și plante au fost studiați folosind o tehnică bazată pe separarea cromatografică a extractelor urmată de identificarea componentelor prin metode de analiză chimică. Această abordare a făcut posibilă nu numai identificarea formelor chimice ale cadmiului, ci și urmărirea transformărilor acestora în obiectele din mediu.

Grupările OH de carbohidrați și polifenoli (inclusiv flavonoide), C=O, fosfați, NH2, NO2 și grupările SH sunt coordonate cu cadmiul din obiectele biosferei. În scopul acestui studiu, a fost compilat un set de liganzi model reprezentând aceste clase de compuși. Interacțiunea liganzilor model cu sărurile de cadmiu solubile în apă a fost studiată folosind spectroscopie UV și HPLC.

Pentru a izola compușii de cadmiu, s-a folosit extracția cu solvenți special selectați (care nu formează complexe cu Cd). Acest lucru face posibilă separarea cadmiului de toate metalele grele, cu excepția analogului său chimic apropiat, zincul. Picurile cu conținut de cadmiu și zinc în cromatogramele extractelor obținute au fost detectate prin legarea metalelor sub forma ditizonaților acestora. Pentru a separa de zinc, a fost utilizată diferența de stabilitate a complexelor Cd și Zn la pH 6-8. Compușii Cd izolați au fost identificați prin HPLC utilizând modificări ale pH-ului în timpul procesului de eluare. A fost efectuată o analiză a compușilor de cadmiu cu componente ale solurilor și țesuturilor plantelor și au fost identificate substanțele produse de plante ca răspuns la creșterea aportului de cadmiu din sol. S-a demonstrat că flavonoidele, în special tricina, sunt agenți de protecție în cereale, derivați alcoxi ai cisteinei în leguminoase și atât polifenoli, cât și tioli în legumele crucifere.

CAPITOLUL 4. ECHIPAMENTE HPLC

SERIE ACCELA

Noul cromatograf lichid de performanță ultra-înaltă ACCELA este capabil să funcționeze într-o gamă largă de debite și presiuni, oferind atât separarea HPLC tipică pe coloane convenționale, cât și separare ultra-rapidă și eficientă pe coloane cu o dimensiune a particulelor de sorbant mai mică de 2 microni. la presiuni ultra-înalte (mai mult de 1000 atm.).

Sistemul include o pompă cu gradient de cadran capabilă să genereze presiuni care depășesc 1000 atm și cu un volum de retenție de numai 65 µL, permițând separări cromatografice de mare viteză. Autosampler ACCELA Capabil să funcționeze la un ciclu de injectare a probei de 30 de secunde și să ofere cea mai mare reproductibilitate a injecției. Detector cu matrice de diode Accela PDA cu un volum minim al celulei cu flux (2 µl) optimizat pentru cromatografie de mare viteză, utilizează tehnologia patentată LightPipe și menține formele simetrice ale vârfurilor care vin cu un sistem de cromatografie și coloane impecabile.

Sistemul se interfață perfect cu spectrometrele de masă pentru a crea cele mai puternice și mai bune sisteme LC/MS disponibile în lume.

Coloane UHP de 1,9 µm disponibile de la Thermo Electron pentru orice aplicație

SERIE TSP

Principiul modular al construcției instrumentelor HPLC permite clientului să asambleze în mod flexibil echipamentele pentru a rezolva orice probleme analitice și, dacă se schimbă, să le modifice rapid și economic. O selecție largă de module include pompe - de la gradient izocratic la gradient cu patru componente, de la microcoloană la semipreparativ, toți detectoarele disponibile, sisteme de introducere a probelor - de la injectoare manuale la autosamplere cu posibilitatea oricărei manipulări cu mostre, software puternic pentru măsurarea procesării rezultate și gestionarea tuturor modulelor de sistem. Toate modulele sunt certificate de CSA, TUF/GS, FCC(EMI), VDE (EMI), ISO-9000, sunt compacte, au un design modern, sunt ușor de operat, dotate cu afișaj încorporat și autodiagnosticare sistem, vă permit să creați și să salvați metode de sarcină. Ele îndeplinesc criteriile „Exemplary Laboratory Practice” (GLP) și sunt incluse în Registrul Instrumentelor de Măsurare al Federației Ruse. Rapoartele de măsurare sunt emise în conformitate cu Farmacopeile din Anglia, SUA, Germania și Franța.

Sistemele modulare TSP se caracterizează prin cea mai mare fiabilitate și stabilitate în funcționare.

Combinația de module oferă analistului toate avantajele unui sistem integrat, pe de o parte, și flexibilitatea unui sistem modular, pe de altă parte. Indiferent de aplicația cromatografiei lichide de înaltă performanță (HPLC) - produse farmaceutice, biotehnologie, analize de mediu, analize clinice, analize de alimente și băuturi, analize petrochimice și chimice - acest instrument este întotdeauna configurat optim pentru a se potrivi celor mai înalte cerințe.

Atât sistemele de rutină de cercetare, cât și cele de mare debit oferă:

Degazare cu solvent foarte eficient

Abilitatea de a lucra cu cantități mici și ultra-mice de eșantion

Cea mai mare sensibilitate, atât cu detector UV/VIS, cât și cu matrice de diode (cu celebra tehnologie LightPipe cu lungimea opțională opțională de 1 sau 5 cm)

Lucrul cu diferite coloane

Analiză cantitativă de cea mai înaltă precizie

Abilitatea de a lucra automat cu diferite volume de mostre

Eroare RMS pentru timpi de retenție mai mici de 0,3%

Suprafața minimă de lucru ocupată de sistem

Cea mai mare fiabilitate și stabilitate a parametrilor.

Pompă Surveyor LC- Pompă HPLC cu cel mai bun timp de retenție reproductibil al oricărei pompe cu gradient cu patru componente disponibile în lume. Degazătorul de vid cu patru canale și amortizorul de pulsații integrate oferă o stabilitate excelentă a liniei de bază pentru o sensibilitate maximă și precizie de cuantificare.

Autosampler oferă cea mai mare productivitate și flexibilitate de analiză. O gamă largă de tăvi de mostre - de la flacoane standard la microplăci cu 96 și 384 de godeuri - acoperă nevoile pentru aproape toate aplicațiile. Noua tehnologie asigură injectarea probei practic fără pierderi; aproape 5 µl de probă sunt injectați cu un autosampler dintr-un volum total de probă de 5 µl.

INSPECTOR

Detector UV/Vis și PDA (Detector cu matrice de diode)

Surveyor UV/Vis- Detectorul de lumină vizibilă și ultravioletă cu lungime de undă variabilă este o combinație de rentabilitate și fiabilitate cu cea mai mare sensibilitate a tehnologiei LightPipe. O selecție largă de celule de flux face acest detector versatil pentru toate aplicațiile, de la cele care utilizează cromatografia capilară sau pe microcoloană până la semipreparativă și preparativă.

Surveyor PDA Detectorul este cel mai sensibil dintre toți detectoarele HPLC care utilizează o matrice de diode. Optica cu sursă de lampă dublă acoperă fără probleme întregul interval de lungimi de undă de la 190 la 800 nm. Formatorul de fascicul cu fibră optică oferă o rezoluție optică excelentă fără a sacrifica sensibilitatea.

Topograf R.I. detector refractometric cu o cuvă termostatată de volum minim cu control electronic complet de la un computer.

Surveyor FL detector de scanare fluorimetrică cu cea mai mare sensibilitate și capacități de detectare pentru fluorescență, chemiluminiscență și fosforescență.

O selecție largă de autosamplere vă permite să lucrați atât cu fiole convenționale, cât și cu plăci cu 96 de poziții, utilizate pe scară largă în biochimie și practica clinică. Lucrul cu ele este facilitat de utilizarea plăcilor similare pentru prepararea probelor folosind extracția în fază solidă.

400 Acționare electrică, buclă Valco (20 µl - standard) cu capacitate de umplere parțială.

Carusel 96 mostre.

Acționare electrică, termostat coloană, buclă Valco (100 µl - standard) cu posibilitate de umplere parțială.Mod AutoMix pentru prepararea probei. Carusel de probe: 84 x 2 ml (probe) + 3 x 10 ml (reactivi). Termostat în coloană încorporat. 420

Autosampler în buclă pentru lucrări de cercetare cu capacitatea de a funcționa în modurile de umplere completă, parțială și injectare a probei de microlitri. O gamă largă de carusele (standard - 96 de mostre).

Autosampler tabletă pentru lucrul cu plăci cu 96 și 384 de poziții. Injectarea probei în buclă sub presiune, capacitatea de a injecta probe mai mici de 1 µl. Posibilitatea de a instala un alimentator de tablete. HPLC

Principalii producători de echipamente HPLC

· Ape - cromatografie ultraperformanta, spectrometrie de masa, coloane, extractie in faza solida;

Varian, Inc. - cromatografe și coloane, accesorii pentru extracția în fază solidă;

· Agilent Technologies - cromatografe și coloane;

· Hypersil - coloane și adsorbanți.

· Merck KGaA - plăci și accesorii TLC pentru TLC, coloane, adsorbanți, faze mobile pentru HPLC, accesorii pentru extracția în fază solidă

· Dionex - echipamente si coloane pentru HPLC, in special pentru cromatografie ionica.

Literatură

1. Pilipenko A.T., Pyatnitsky I.V. Chimie analitică. În două cărți: cartea..1 - M.: Chimie, 1990, -480 p.

1. Pilipenko A.T., Pyatnitsky I.V. Chimie analitică. În două cărți: cartea..2 - M.: Chimie, 1990, -480 p.

2. Vasiliev V.P. Chimie analitică. În 2 ore.Partea 2. Metode fizico-chimice de analiză: Manual. pentru Khimko - technol. specialist. universități – M.: Mai sus. şcoală, 1989. – 384 p.

3. Materiale hidrochimice. Volumul 100. Metode şi mijloace tehnice de monitorizare operaţională a calităţii apelor de suprafaţă. L.: Gidrometeo-izdat, 1991. – 200 p.

4. Lurie Yu.Yu. Chimia analitică a apelor uzate industriale / Yu.Yu. Lurie; M.: KhimiyaYU, 1984. - 448 p.

5. Ewing G. Metode instrumentale de analiză chimică / Trad. din engleza M.: Mir, 1989. – 348 p.

6. Gorelik D.O., Konopelko L.A., Pankov E.D. Monitorizarea mediului. În 2 volume.Sankt Petersburg: Crăciun. 2000. – 260 p.

7. Aivazov B.V. Introducere în cromatografie. M.: Mai sus. şcoală, 1983. – 450 p.

8. Goldberg K.A., Vigdergauz M.S. Introducere în cromatografia gazoasă. M.: Chimie, 1990. – 329 p.

9. Stolyarov B.V. și altele // Cromatografie practică în gaz și lichid. Sankt Petersburg: Universitatea de Stat din Sankt Petersburg, 1998. - P. 81.

11. Gorshkov A.G., Marinaite I.I. HPLC este o metodă de monitorizare a HAP în obiectele din mediu

12. Torosyan G. O., Martirosyan V. A., Aleksanyan A. R., Zakaryan M. O.. Îndepărtarea anilinei din soluții apoase utilizând deșeuri de la reducerea aluminotermă a calcarului de cupru laminat

13. L.A. Turkina, G.N. Koroleva Dezvoltarea unei metode pentru determinarea elementelor alcalino-pământoase și a magneziului folosind cromatografia lichidă de înaltă performanță ionică

14. Dultseva G.G., Dubtsova Yu.Yu., Skubnevskaya G.I. Analiza complexelor de cadmiu din mediu

Aplicație

DETERMINAREA CLOMAZONEI ÎN APA PRIN METODE CROMATOGRAFICE

INSTRUCȚIUNI METODOLOGICE MUK 4.1.1415-03

1. Întocmit de: Centrul Științific Federal de Igienă numit după. F.F.

Erisman; Academia Agricolă din Moscova poartă numele. K.A.

Timiryazev; cu participarea Departamentului de Supraveghere Sanitară și Epidemiologică de Stat al Ministerului Sănătății din Rusia. Dezvoltatorii metodologiei sunt enumerați la sfârșit.

3. Aprobat de Medicul Sef Sanitar de Stat

Federația Rusă, prim-viceministru al Sănătății al Federației Ruse, academician. RAMS G.G. Onishcenko 24 iunie 2003

5. Introdus pentru prima dată.

1. Partea introductivă

Producător: FMS (SUA).

Nume comercial: COMMAND.

Ingredient activ: clomazonă.

2-(2-clorbenzil)-4,4-dimetil-3-izoxalidin-3-onă (IUPAC)

Lichid vâscos maro deschis.

Punct de topire: 25 -C.

Punct de fierbere: 275 -C.

Presiunea vaporilor la 25 -C: 19,2 MPa.

Coeficientul de partiție n-octanol/apă: K logP = 2,5.

Foarte solubil în acetonă, hexan, etanol, metanol,

cloroform, diclormetan şi acetonitril; Solubilitate in apa -

1,10 g/m3 dm. Stabil la temperatura camerei cel puțin 2 ani, la 50 -C cel puțin 3 luni.

Scurte caracteristici toxicologice: orală acută

toxicitate (LD) pentru șobolani - 1369 - 2077 mg/kg; dermică acută

toxicitate (LD) pentru șobolani - mai mult de 2000 mg/kg; acut

toxicitate prin inhalare (LC) pentru șobolani - 4,8 mg/m3. dm (4 ore).

Standarde de igienă. Limita maximă de concentrație în apă este de 0,02 mg/m3. dm.

Zona de aplicare a medicamentului. Clomazona este un erbicid selectiv utilizat pentru combaterea cerealelor și buruienilor dicotiledonate în culturile de soia și orez cu aplicare pre-emergență sau înainte de însămânțare.

2. Metoda de determinare a clomazonei în apă

metode cromatografice

2.1. Dispoziții de bază

2.1.1. Principiul tehnicii

Tehnica se bazează pe extragerea clomazonei din proba analizată cu hexan, concentrarea extractului și determinarea cantitativă ulterioară prin metode alternative:

cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) cu

detector de ultraviolete, cromatografie gaz-lichid (GLC) cu un detector de viteză de recombinare constantă sau cromatografie în strat subțire (TLC). Determinarea cantitativă se realizează prin metoda de calibrare absolută.

2.1.2. Selectivitatea metodei

În condițiile propuse, metoda este specifică în prezența poluanților globali de mediu: cicloparafine clorurate (izomeri HCCH), compuși difenil (DDT și derivații săi), metaboliții acestora - benzen și fenoli policlorurați, precum și în prezența tricloroacetatului de sodiu. , care poate fi folosit pe culturi ca erbicid.

2.1.3. Caracteristicile metrologice ale metodei (P = 0,95)

Reactivi, solutii si materiale

Clomazonă care conține d.v. 99,8%

(FMS, SUA)

Azot, foarte mare GOST 9293-79

Amoniac apos, 25%, h GOST 1277-81

Acetonă, h GOST 2603-79

n-hexan, h GOST 2603-79

Peroxid de hidrogen, soluție apoasă 30% GOST 10929-77

Alcool izopropilic, chimic pur TU 6-09-402-75

Acid sulfuric, grad de reactiv GOST 4203-77

Acid clorhidric (acid clorhidric), grad de reactiv GOST 3118-77

Alcool metilic, grad de reactiv GOST

Hidroxid de sodiu, chimic pur, soluție apoasă 25% GOST 4323-77

Sulfat de sodiu anhidru, grad de reactiv GOST 1277-81

Azotat de argint, grad de reactiv GOST 1277-81

2-fenoximetanol, parte TU 6-09-3688-76

Chromaton N-AW-DMCS (0,16 - 0,20 mm)

cu 5% SE-30, Hemapol, Cehia

Chromaton N-AW-DMCS (0,16 - 0,20 mm) cu 1,5

OV-17 + 1,95% QF-1, Hemapol, Cehia

Plăci pentru HPTLC (URSS)

Plăci „Kieselgel 60 F-254” (Germania)

Recorduri „Silufol” Republica Cehă

Filtre de hârtie „bandă albă”, tăiate și pre-spălate cu hexan TU 6-09-2678-77

2.3. Dispozitive, echipamente, vase

Cromatograf lichid Milichrome

cu detector de ultraviolete

Coloana cromatografica din otel,

lungime 64 mm, diametru interior 2 mm,

umplut cu Silasorb 600, granulație 5 microni

Cromatograf gazos seria „Color” sau

similar, echipat cu un detector constant

rata de recombinare (RPR) cu o limită

detecție pentru lindan 4 x 10 g/cc. cm

Coloană cromatografică din sticlă, lungime

1 sau 2 m, diametru interior 2 - 3 mm

Microseringă tip MSh-10, capacitate 10 µl TU 5E2-833-024

Aparat de agitare tip AVU-6s TU 64-1-2851-78

Baie de apă TU 64-1-2850-76

Balanțe analitice tip VLA-200 GOST 34104-80E

Camera cromatografică GOST 10565-74

Pompă cu jet de apă GOST 10696-75

Iradiator cu mercur-cuarț tip OKN-11 TU 64-1-1618-77

Sticle de pulverizare din sticlă GOST 10391-74

Evaporator rotativ cu vid IR-1M

sau similar TU 25-11-917-76

Grup compresor TU 64-1-2985-78

Dulap de uscare TU 64-1-1411-76E

Pâlnii de separare GOST 3613-75

Baloane cotate, capacitate 100 ml GOST 1770-74

Cilindri de măsurare, capacitate 10, 50 ml GOST 1770-74E

Baloane în formă de para cu secțiune măcinată,

cu o capacitate de 100 ml GOST 10394-72

Baloane conice, capacitate 100 ml GOST 22524-77

Tuburi de centrifugare, măsurarea GOST 25336-82E

Pipete, capacitate 0,1, 1, 2, 5 și 10 ml GOST 20292-74

Pâlnii chimice, conice, cu diametru

34 - 40 mm GOST 25336-82E

2.4. Selectarea eșantionului

Selecția, depozitarea și pregătirea probelor se efectuează în conformitate cu

„Reguli unificate de prelevare a probelor de produse agricole, produse alimentare si obiecte de mediu pentru determinarea urmelor de pesticide”, aprobat prin N 2051-79 din 21.08.79.

Probele selectate pot fi păstrate la frigider pentru cel mult 5 zile. Înainte de analiză, apa (dacă este prezentă materie în suspensie) este filtrată printr-un filtru de hârtie liber.

2.5. Pregătirea pentru determinare

2.5.1. Metoda HPLC

2.5.1.1. Pregătirea fazei mobile pentru HPLC

Folosind o pipetă, se pun 5 ml de izopopanol și 5 ml de metanol într-un balon cotat de 100 ml, se adaugă hexan la semn, se amestecă și se filtrează.

2.5.1.2. Condiționarea coloanei

Se clătește coloana HPLC cu hexan-metanol-izopropanol (90:5:5, v/v) timp de 30 min. la un debit de solvent de 100 µl/min.

2.5.2. Metoda GLC. Pregătirea și condiționarea coloanei

Ambalajul finit (5% SE-30 pe Chromaton N-AW-DMCS) se toarnă într-o coloană de sticlă, se compactează sub vid, coloana este instalată în termostatul cromatograf fără a se conecta la detector și se stabilizează într-un curent de azot la un temperatura de 250 -C pentru orele 10 - 12

2.5.3. Metoda TLC

2.5.3.1. Prepararea reactivilor de dezvoltare

2.5.3.1.1. Reactiv de dezvoltare nr. 1

1 g azotat de argint se dizolvă în 1 ml apă distilată, 10 ml 2-fenoximetanol, 190 ml acetonă, se adaugă 1 - 2 picături de peroxid de hidrogen, soluția se agită și se transferă într-o sticlă de sticlă închisă la culoare.

2.5.3.2.2. Reactiv de dezvoltare N 2

0,5 g azotat de argint se dizolvă în 5 ml apă distilată într-un balon cotat de 100 ml, se adaugă 10 ml de amoniac apos 25%, soluția se ajustează la 100 ml cu acetonă, se amestecă și se transferă într-un balon de sticlă închisă la culoare.

2.5.3.2. Pregătirea fazei mobile pentru TLC

Se adaugă 20 ml de acetonă într-un balon cotat de 100 ml, se adaugă hexan până la semn și se amestecă. Amestecul se toarnă în camera cromatografică într-un strat de cel mult 6 - 8 mm în 30 de minute. Înainte de a începe cromatografia.

2.5.4. Prepararea solutiilor standard

O soluție standard stoc de clomazonă care conține 100 pg/ml este preparată prin dizolvarea a 0,010 g de medicament care conține 99,8% ingredient activ în hexan într-un balon cotat de 100 ml. Soluția se păstrează la frigider timp de o lună.

Soluții standard de lucru cu o concentrație de 0,4; 1,0; 2,0; 4,0; 10,0; Se prepară 20 și 40,0 μg/ml din soluția standard stoc de clomazonă prin diluție în serie corespunzătoare cu hexan.

Soluțiile de lucru sunt păstrate în frigider pentru cel mult o lună.

2.5.5. Construirea unui grafic de calibrare

2.5.5.1. Graficul de calibrare A (măsurare conform clauzei 2.7.1, HPLC)

Pentru a construi un grafic de calibrare, 5 μl dintr-o soluție standard de lucru de clomazonă cu o concentrație de 4,0 sunt injectate în injectorul cromatograf; 10,0; 20,0 şi 40 pg/ml.

2.5.5.2. Graficul de calibrare B (măsurare conform clauzei 2.7.2, GLC)

Pentru a construi o curbă de calibrare, se injectează 5 μl dintr-o soluție standard de lucru de clomazonă cu o concentrație de 0,4 în evaporatorul cromatograf; 1,0; 2,0; 4.0 și 10.0.

Efectuați cel puțin 5 măsurători paralele. Găsiți înălțimea medie a vârfului cromatografic pentru fiecare concentrație. Construiți un grafic de calibrare (A sau B) al dependenței înălțimii vârfului cromatografic în mm de concentrația de clomazonă din soluție în μg/ml.

2.6. Descrierea definiției

100 ml din proba de apă analizată se pun într-o pâlnie de separare cu o capacitate de 250 ml, se adaugă 10 ml soluție apoasă 25% de hidroxid de sodiu, se amestecă și se adaugă 20 ml n-hexan. Pâlnia se agită timp de 3 minute, după separarea fazelor, stratul de hexan se toarnă într-un balon de 100 ml în formă de pară, trecându-l printr-un strat de sulfat de sodiu anhidru plasat într-o pâlnie conică pe un filtru de hârtie pliat. Extracția medicamentului din proba apoasă se repetă de încă două ori, folosind 20 ml de n-hexan. Extractul combinat de hexan este evaporat pe un evaporator rotativ cu vid la o temperatură de 40-C aproape până la uscare, reziduul este eliminat cu un curent de aer sau azot de înaltă puritate. Reziduul uscat este dizolvat în 0,1 (HPLC, TLC) sau 0,25 ml (GLC) n-hexan și analizat prin una dintre metodele cromatografice.

2.7. Condiții de cromatografie

Cromatograf lichid cu detector de ultraviolete Milichrom (Rusia).

Coloana de otel lungime 64 mm, diametru interior 2 mm,

umplut cu Silasorb 600, granulație 5 microni.

Temperatura coloanei: temperatura camerei.

Faza mobilă: hexan-izopropanol-metanol (90:5:5, v/v).

Debit de eluant: 100 µl/min.

Lungime de undă de operare: 240 nm.

Sensibilitate: 0,4 unități absorbția pe scară.

Volumul probei injectat: 5 µl.

Timp de eliberare a clomazonei: aproximativ 6 minute.

Domeniu de detecție liniară: 20 - 200 ng.

Probele care produc vârfuri mai mari decât soluția standard de 40 ug/mL sunt diluate cu fază mobilă de calitate HPLC.

Cromatograf gazos „Tsvet-570” cu un detector de viteză constantă de recombinare a ionilor.

Coloana de sticla de 1 m lungime, diametru interior 3 mm, umpluta cu Chromaton N-AW-DMCS cu 5% SE-30 (0,16 - 0,20 mm).

Scara de lucru a electrometrului este de 64 x 10 10 Ohm.

Viteza casetei de înregistrare este de 200 mm/h.

Temperatura termostatului coloana - 190 -C

detector - 300 -С

evaporator - 220 -С

Viteza gazului purtător (azot) - 60 ml/min.

Volumul probei injectate este de 5 µl.

Timpul de eliberare a clomazonei este de 2,5 minute.

Domeniu de detecție liniară: 2 - 50 ng.

Probele care produc vârfuri mai mari decât soluția standard de 10 μg/mL sunt diluate cu hexan.

Pentru a crește acuratețea identificării clomazonei în prezența gamma-HCH în probă, care are un timp de retenție similar, clomazona este îndepărtată din probă prin tratare cu acid sulfuric concentrat. Analiza repetată a probei face posibilă determinarea contribuției clomazonei la semnalul cromatografic primar.

Soluție de hexan într-un balon obținută cantitativ conform punctului 2.6

(sau o parte alicotă a acestuia) se aplică pe plăci cromatografice „Silufol”, „Kieselgel 60F-254” sau „plăci HPTLC”. Soluțiile standard sunt aplicate în apropiere într-un volum corespunzător conținutului de clomazonă de 1, 2, 5 și 10 mcg. Placa este plasată într-o cameră de cromatografie care conține un amestec de n-hexan-acetonă (4:1, în volum). După ce s-a dezvoltat cromatograma, placa este scoasă din cameră, plasată sub tracțiune până când solvenții se evaporă, apoi tratată cu unul dintre reactivii de dezvoltare și plasată sub o lampă cu ultraviolete timp de 5 minute. Zona de localizare a medicamentului pe plăcile „Silufol”, „plăci HPTLC” și „Kieselgel 60F-254” apare sub formă de pete gri-maronii cu o valoare Rf de 0,35, 0,85 și, respectiv, 0,43. Pentru a determina clomazona prin TLC, puteți utiliza plăci „Alugram” și „Poligram” (fabricate în Germania). Valoarea Rf a clomazonei pe aceste plăci este de 0,37 și, respectiv, 0,38.

3. Cerințe de siguranță

Este necesar să se respecte regulile de siguranță general acceptate atunci când se lucrează cu solvenți organici, substanțe toxice și dispozitive electrice de încălzire.

4. Controlul erorilor de măsurare

Controlul operațional al erorii de măsurare și al reproductibilității se efectuează în conformitate cu recomandările MI 2335-95. GSI „Controlul intern al calității rezultatelor analizei chimice cantitative”.

5. Dezvoltatori

Yudina T.V., Fedorova N.E. (Centrul Federal de Cercetare numit după F.F. Erisman).

Davidyuk E.I. (UkrNIIGINTOX, Kiev); Kisenko M.A., Demchenko V.F. (Institutul de Medicină Muncii al Academiei de Științe și Academiei de Științe Medicale din Ucraina, Kiev).

(OFS 42-0096-09)

Cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC) este o metodă de cromatografie pe coloană în care faza mobilă (MP) este lichidă.

os care se deplasează printr-o coloană de cromatografie umplută cu inaccesibile

faza vizuală (sorbent). Coloanele HPLC sunt caracterizate de o presiune hidraulică ridicată la intrarea coloanei, de aceea HPLC este uneori numită

numită „cromatografie lichidă de înaltă presiune”.

În funcție de mecanismul de separare a substanțelor, se disting următoarele:

opțiuni HPLC actuale: adsorbție, distribuție, schimb ionic,

exclusivist, chiral etc.

În cromatografia de adsorbție, separarea substanțelor are loc datorită abilităților diferite ale acestora de a fi adsorbite și desorbite cu

suprafața unui adsorbant cu o suprafață dezvoltată, de exemplu, silicagel.

În HPLC de distribuție, separarea are loc datorită diferențelor în coeficienții de distribuție ai substanțelor care sunt separate între staționari.

(de obicei grefat chimic pe suprafața unui purtător staționar) și

fazele mobile.

După polaritate, HPLC PF și NP sunt împărțite în fază normală și ob-

fază extinsă.

Faza normală este o variantă de cromatografie în care

utilizați un sorbent polar (de exemplu, silicagel sau silicagel cu

grupări NH2 sau CN răsucite) și PF nepolar (de exemplu, hexan cu di-

suplimente personale). În versiunea cu fază inversă a cromatografiei,

utilizați adsorbanți nepolari modificați chimic (de exemplu,

radicalul alchil nepolar C18) și fazele mobile polare (de ex.

metanol, acetonitril).

În cromatografia cu schimb de ioni, moleculele de substanțe dintr-un amestec se disociază

în soluție în cationi și anioni sunt separați la trecerea prin

sorbent (schimbător de cationi sau schimbător de anioni) datorită ratelor lor diferite de schimb cu ionii

mi grupuri de sorbant.

În excludere (sită, gel-permeating, gel filtrare)

cromatografia, moleculele de substanțe sunt separate după dimensiune datorită capacității lor diferite de a pătrunde în porii fazei staționare. În același timp, primul dintre co-

Coloanele produc cele mai mari molecule (cu cea mai mare greutate moleculară) capabile să pătrundă în numărul minim de pori ai fazei staționare,

iar ultimele care au apărut sunt substanțele cu dimensiuni moleculare mici.

Adesea, separarea are loc nu printr-unul, ci prin mai multe mecanisme simultan.

Metoda HPLC poate fi utilizată pentru a controla calitatea oricăror non-

analiți zooformi. Pentru efectuarea analizei se folosesc instrumente adecvate - cromatografe lichide.

Compoziția unui cromatograf lichid include de obicei următoarele elemente de bază:

Noduri:

– Unitate de pregătire PF, inclusiv un container cu fază mobilă (sau capacitiv

legături cu solvenți individuali incluși în faza mobilă

3) și sistemul de degazare PF;

– sistem de pompare;

– mixer de fază mobilă (dacă este necesar);

– sistem de introducere a probei (injector);

– coloană cromatografică (poate fi instalată într-un termostat);

– detector;

– sistem de colectare și prelucrare a datelor.

Sistem de pompare

Pompele furnizează PF coloanei la o viteză constantă dată. Compoziția fazei mobile poate fi constantă sau variabilă.

în timpul analizei. În primul caz, procesul se numește izocratic,

iar în al doilea - gradient. Uneori sunt instalate în fața sistemului de pompare

filtre cu diametrul porilor de 0,45 microni pentru filtrarea fazei mobile. Modern

Un sistem de pompe pentru cromatograf lichid este format din una sau mai multe pompe controlate de computer. Acest lucru vă permite să schimbați

devenind PF conform unui anumit program cu gradient de eluare. Sme-

Amestecul de componente PF în mixer poate apărea atât la presiune joasă

presiune (inainte de pompe) si la presiune mare (dupa pompe). Mixerul poate fi utilizat pentru prepararea PF și eluție izocratică,

cu toate acestea, un raport mai precis al componentelor este obținut prin pre-

amestecarea temeinică a componentelor PF pentru un proces izocratic. Pompele pentru HPLC analitică fac posibilă menținerea unui debit constant de PF în coloană în intervalul de la 0,1 la 10 ml/min la o presiune la intrarea în coloană de până la 50 MPa. Este recomandabil, totuși, ca această valoare să nu depășească

trebuie să fie de 20 MPa. Pulsațiile de presiune sunt minimizate de amortizoare speciale

sisteme feroase incluse în proiectarea pompei. Piese de lucru pe-

Pompele sunt fabricate din materiale rezistente la coroziune, ceea ce permite utilizarea componentelor agresive în compoziția PF.

robinete

Prin proiectare, mixerele pot fi statice sau dinamice

microfon.

În mixer, se formează o singură fază mobilă din

solvenți eficienti furnizați de pompe dacă amestecul necesar nu a fost pregătit în prealabil. Amestecarea solvenților are loc de obicei spontan, dar uneori se folosesc sisteme cu amestecare forțată.

cusut.

Injectoare

Injectoarele pot fi universale pentru introducerea probelor din

1 µl până la 2 ml sau discret pentru introducerea unei probe de doar un anumit volum

ema. Ambele tipuri de injectoare pot fi automate ("autoinjectoare" sau "autosamplere"). Este amplasat injectorul pentru introducerea probei (soluție).

direct în fața coloanei de cromatografie. Designul injectorului vă permite să schimbați direcția fluxului PF și să preintroduceți o probă într-o buclă de un anumit volum (de obicei, de la 10 la 100 μl).

Acest volum este indicat pe eticheta buclei. Designul injectorului permite înlocuirea buclei. Pentru a introduce soluția de testare într-un sistem neautomat

Injectorul Tomatic folosește o microseringă manuală cu un volum semnificativ

depășind semnificativ volumul buclei. Exces de soluție injectată, nu

situat în buclă este resetat și un volum exact și întotdeauna egal de probă este injectat în coloană. Umplerea manuală incompletă a buclei reduce precizia

acuratețea și reproductibilitatea dozării și, prin urmare, afectează acuratețea

acuratețea și reproductibilitatea analizei cromatografice.

Coloana cromatografică

Coloanele cromatografice sunt de obicei tuburi din oțel inoxidabil, sticlă sau plastic, umplute cu un sorbant și închise.

căptușite pe ambele părți cu filtre cu diametrul porilor de 2–5 microni. Lungimea analitică

Grosimea coloanei, în funcție de mecanismul de separare cromatografic, poate fi în intervalul de la 5 la 60 cm sau mai mult (de obicei este

10–25 cm), diametrul intern – de la 2 la 10 mm (de obicei 4,6 mm). Coloanele cu un diametru interior mai mic de 2 mm sunt utilizate în crom microcoloană

toografie. Coloane capilare cu un diametru interior de

rom aproximativ 0,3-0,7 mm. Coloanele pentru cromatografie preparativă au un diametru interior de până la 50 mm sau mai mult.

Tuburile scurte pot fi instalate în fața coloanei analitice.

coloane (precoloane) care îndeplinesc diverse funcţii auxiliare

(mai des – protecția coloanei analitice). De obicei analiza se face cu

la temperatura normală, totuși, pentru a crește eficiența separării și a con-

Pentru a scurta durata analizei, pot fi folosite termostate.

testarea coloanelor la temperaturi nu mai mari de 60 C. La temperaturi mai ridicate, sunt posibile distrugerea sorbantului și modificări ale compoziției PF.

Faza staționară (sorbant)

Următoarele sunt de obicei utilizate ca absorbanți:

1. În mod normal se folosesc silicagel, oxid de aluminiu, grafit poros

cromatografia în fază mică. Mecanismul de reținere în acest caz este

ceai - de obicei adsorbție;

2. Rășini sau polimeri cu grupări acide sau bazice. Domeniul de aplicare: cromatografia cu schimb ionic;

3. Silicagel poros sau polimeri (cromatografie cu excludere dimensională);

4. Sorbitori modificați chimic (sorbanți cu faze altoite)

zami), preparată cel mai adesea pe bază de silicagel. Mecanismul de reținere este în majoritatea cazurilor distribuția între elementele mobile

faze noi și staționare;

5. Sorbanți chirali modificați chimic, de exemplu cei produși

celuloze și amiloze apoase, proteine și peptide, ciclodextrine,

utilizat pentru separarea enantiomerilor (cromatografie chirală

Sorbenții cu faze altoite pot avea diferite grade de substanță chimică

modificare ică. Particulele absorbante pot fi sferice sau nesferice

forma corecta si porozitate variata.

Cele mai frecvent utilizate faze de altoit sunt:

– grupări octile(octilsilan sau sorbent C8);

– grupări octadecil(sorbent octadecilsilan

(ODS) sau C18);

– grupări fenil(sorbent de fenilsilan);

– grupări cianopropil(sorbent CN);

– grupări aminopropil(sorbent de NH2);

– grupări diol (diol absorbant).

Cel mai adesea, analiza se efectuează pe faze grefate nepolare în

modul de fază inversă folosind sorbent C18.

În unele cazuri, este mai potrivit să folosiți normal

cromatografia de fază. În acest caz, gelul de silice sau fazele grefate polare („CN”, „NH2”, „diol”) sunt utilizate în combinație cu soluții nepolare.

Sorbenții cu faze altoite sunt stabili din punct de vedere chimic la valori ale pH-ului de la 2,0 până la 8,0, dacă nu se specifică altfel de către producător.

Particulele absorbante pot avea forme sferice sau neregulate și porozitate variată. Dimensiunea particulelor sorbantului în HPLC analitică este de obicei de 3–10 µm, în HPLC preparativă – până la 50 µm sau mai mult.

Se folosesc și adsorbanți monolitici.

Eficiența ridicată a separării este asigurată de suprafața mare a particulelor absorbante (care este o consecință a microscopiei lor).

mărimea și prezența porilor), precum și uniformitatea compoziției sorbantului și împachetarea sa densă și uniformă.

Detectoare

Sunt utilizate diferite metode de detectare. În cazul general, PF cu componente dizolvate în el după o coloană cromatografică

ki intră în celula detectorului, unde una sau alta dintre proprietățile sale este măsurată în mod continuu (absorbție în regiunea UV sau vizibilă a spectrului, fluorescență,

indicele de refracție, conductivitatea electrică etc.). Cromatograma rezultată este un grafic al dependenței unor elemente fizice

parametrul logic sau fizico-chimic al PF în funcție de timp.

Cele mai frecvente sunt depistarea spectrofotometrică.

tectori (inclusiv diode-matrice) care înregistrează modificările optice

densitate în ultraviolet, vizibil și adesea în infraroșu apropiat

n zone ale spectrului de la 190 la 800 sau 900 nm. Cromatograma în acest caz

ceaiul reprezintă dependența densității optice a PF de timp.

Detectorul spectrofotometric utilizat în mod tradițional permite

permite detectarea la orice lungime de undă din domeniul său de operare

zona. De asemenea, sunt utilizați detectoare cu mai multe unde, permițând

Efectuați detectarea la mai multe lungimi de undă simultan.

Folosind un detector cu matrice de diode, nu numai că puteți detecta mai multe lungimi de undă simultan, ci și aproape instantaneu

Este posibil să se obțină în orice moment spectrul optic al PF direct (fără scanare), ceea ce simplifică foarte mult analiza calitativă a componentelor separate.

componente.

Sensibilitatea detectorilor cu fluorescență este de aproximativ 1000 de ori mai mare decât sensibilitatea celor spectrofotometrice. În acest caz, se utilizează fie propria sa fluorescență, fie fluorescența derivaților corespunzători dacă substanța care este determinată în sine nu are fluorescență. Modern

detectoarele fluorescente variabile permit nu numai obținerea cromato-

grame, dar și pentru a înregistra spectrele de excitație și fluorescență ale analiticului

conexiuni zirovabile.

Pentru a analiza probe care nu absorb în UV și regiunile vizibile ale spectrului (de exemplu, carbohidrați), se folosesc detectoare refractometrice.

(refractometre). Dezavantajele acestor detectoare sunt sensibilitatea lor scăzută (comparativ cu detectoarele spectrofotometrice) și dependența semnificativă de temperatură a intensității semnalului (detectorul trebuie să fie termostat).

Se folosesc și detectoare electrochimice (conductometrice

schi, amperometric etc.), spectrometric de masă și Fourier-IR

detectoare, detectoare de împrăștiere a luminii, detectoare de radioactivitate și altele

Faza mobila

ÎN O varietate de solvenți pot fi utilizați ca PF - atât individuali, cât și amestecuri ale acestora.

ÎN fază normală cromatografia folosește de obicei carbon lichid

clorhidrati (hexan, ciclohexan, heptan) si altele relativ nepolare

solvenți cu mici adaosuri de compuși organici polari,

care reglează rezistența de eluție a PF.

În cromatografia în fază inversă, compoziția PF include polar sau-

solvenți organici (de obicei acetonitril și metanol) și apă. Pentru optic

sistemele de separare folosesc adesea soluții apoase cu un anumit

Modificări ale pH-ului, în special soluții tampon. Se folosesc aditivi anorganici

acizi chimici și organici, baze și săruri și alți compuși (de exemplu,

de exemplu, modificatori chirali pentru separarea enantiomerii în achirali-

nom sorbent).

Valoarea pH-ului trebuie monitorizată separat pentru componenta apoasă, și nu pentru amestecul acesteia cu un solvent organic.

PF poate consta dintr-un singur solvent, adesea doi, dacă este necesar

interval - trei sau mai multe. Compoziția PF este indicată ca raportul de volum al solvenților săi constituenți. În unele cazuri, masa poate fi indicată

raportul bufniței, care ar trebui să fie stipulat în mod special.

Când utilizați un detector spectrofotometric UV, PF nu ar trebui să aibă o absorbție pronunțată la lungimea de undă selectată pentru detectare. Limită de transparență sau densitate optică atunci când este determinată

Lungimea de undă specifică a unui solvent de la un anumit producător este adesea indicată

este pe ambalaj.

Analiza cromatografică este foarte influențată de gradul de puritate al PF, de aceea este de preferat să se utilizeze solvenți produși

special conceput pentru cromatografie lichidă (inclusiv apă).

PF și soluțiile analizate nu trebuie să conțină nedizolvate

de particule și bule de gaz. Apa obtinuta in conditii de laborator

soluții apoase, soluții organice preamestecate cu apă

Mediile, precum si solutiile analizate, trebuie supuse la filtrare si degazare fina. Filtrarea este de obicei folosită în aceste scopuri.

sub vid printr-un filtru cu membrană cu o dimensiune a porilor de 0,45 μm, inert față de un anumit solvent sau soluție.

Sistem de colectare și prelucrare a datelor

Un sistem modern de procesare a datelor este conectat

un computer personal conectat la un cromatograf cu software instalat

software care vă permite să înregistrați și să procesați cro-

matograma, precum și controlul funcționării cromatografului și monitorizarea principalului

parametrii sistemului cromatografic.

Lista condițiilor cromatografice care trebuie specificate

Monografia farmacopeei private trebuie să indice dimensiunile co-

coloane, tipul de sorbant care indică dimensiunea particulelor, temperatura coloanei (dacă este necesară termostatarea), volumul probei injectate (volumul buclei),

devenirea PF și metoda de preparare a acestuia, rata de alimentare cu PF, detectorul și condițiile de detectare, descrierea modului de gradient (dacă este utilizat), timpul de cromatografie.

SCHIMB DE IONI ȘI HPLC DE IONI

Cromatografia cu schimb de ioni este utilizată pentru analiza ambelor substanțe organice

atât (baze heterociclice, aminoacizi, proteine etc.), cât și non-sau-

compuși ganici (diverși cationi și anioni). Separare compozită

Componentele amestecului analizat în cromatografia cu schimb ionic se bazează pe interacțiunea reversibilă a ionilor substanțelor analizate cu grupările ionice.

memoria sorbantului. Schimbătoarele de anioni sau schimbătoarele de cationi sunt utilizate ca absorbanți.

Tu. Acești adsorbanți sunt în principal fie ioni polimerici

rășini schimbătoare (de obicei copolimeri de stiren și divinilbenzen cu

grupări ionice) sau silicagel cu grupări schimbătoare de ioni grefate. Pentru separarea anioniilor se folosesc sorbanti cu grupari -(CH2)3 N+ X–, iar sorbantii cu grupari -(CH2)SO3 – H+ sunt folositi pentru separarea cationilor.

De obicei, rășinile polimerice sunt folosite pentru a separa anionii și pentru a separa

îndepărtarea cationilor – silicageluri modificate.

Soluțiile apoase de acizi, baze și săruri sunt utilizate ca PF în cromatografia cu schimb ionic. De obicei sunt folosite tampoane

soluții care vă permit să mențineți anumite valori ale pH-ului. De asemenea, este posibil să folosiți aditivi organici mici care se amestecă cu apă.

solvenți pentru schi - acetonitril, metanol, etanol, tetrahidrofuran.

Cromatografia ionică- o variantă de cromatografie cu schimb ionic, în

în care, pentru a determina concentrația ionilor analitului, folosim

folosește un detector conductometric. Pentru operațiuni extrem de sensibile

Pentru a determina modificări ale conductivității electrice care trece prin detectorul PF, conductivitatea electrică de fundal a PF ar trebui să fie scăzută.

Există două variante principale de cromatografie ionică.

Prima dintre ele se bazează pe suprimarea conductivității electrice a electroliticului

PF folosind o a doua coloană schimbătoare de ioni situată între

coloană litică și detector. Neutralizarea are loc în această coloană

PF și compușii analizați intră în celula detector în deionizare

apa distilata. Ionii detectați sunt singurii ioni

asigurarea conductivității PF. Dezavantajul coloanei de suprimare este necesitatea regenerării acesteia după perioade de timp destul de scurte.

pe mine. Coloana de suprimare poate fi înlocuită continuu

un supresor de membrană comun în care compoziția membranei este continuă

este reînnoită printr-un flux de soluție regenerantă care se deplasează în direcția

opus sensului curgerii PF.

A doua versiune a cromatografiei ionice este cromatografia ionică pe o singură coloană.

matografia. în acest exemplu de realizare, este utilizat un PF cu o conductivitate electrică foarte scăzută.

continut de apa. Compușii organici slabi sunt utilizați pe scară largă ca electroliți.

Acizi chinezi - benzoici, salicilici sau izoftalici.

HPLC SECURĂ

Cromatografia de excludere a mărimii (cromatografia pe gel) este o versiune specială a HPLC bazată pe separarea moleculelor după dimensiunea lor. Distributie

moleculele dintre fazele staționare și mobile se bazează pe dimensiunea moleculelor.

molecule și parțial pe forma și polaritatea lor. Pentru separare, folosiți

sorbenti porosi - polimeri, silicagel, sticle poroase si polizaharide.

Dimensiunea particulelor absorbanților este de 5-10 microni.

Avantajele sticlelor poroase și a gelului de silice sunt difuzia rapidă a PF și a moleculelor substanței analizate în pori, stabilitatea în diferite condiții (chiar și la temperaturi ridicate). Sorben polimeric-

sunteți copolimeri de stiren și divinilbenzen (acesta este hidro-

sorbenti fobi folositi cu fazele mobile nepolare) si

geluri hidrofile obţinute din răşini sulfonate de divinilbenzen sau poliacrilamidă.

Sunt posibile două tipuri limitative de interacțiune a moleculelor cu o fază staționară poroasă. Moleculele a căror dimensiune este mai mare decât diametrul mediu al porilor nu pătrund deloc în sorbent și eluează împreună cu faza mobilă.

zoy mai întâi. Molecule cu un diametru semnificativ mai mic decât dimensiunea porilor sorbantului

benta pătrunde liber în el, rămân în faza staționară pentru cel mai mult timp și sunt ultimii care eluează. Moleculele de dimensiuni medii pătrund în porii sorbantului în funcție de dimensiunea lor și parțial în funcție de forma lor. Eluează cu timpi de retenție diferiți între

moleculele noastre cele mai mari și cele mai mici. Separarea componentelor probei cromatografiate are loc ca urmare a repetării

difuzia componentelor probei în porii sorbantului și invers.

În cromatografia de excludere prin mărime, pentru a caracteriza retenția,

Se utilizează un volum de retenție egal cu produsul dintre debitul PF și timpul de retenție.

Faza mobila. Alegerea PF depinde de tipul de absorbant. Excludere-

Cromatografia este în general împărțită în filtrare pe gel și cromatografia pe gel.

cromatografia de permeabilitate.

Pentru separare se folosește metoda cromatografiei prin filtrare pe gel

cercetarea compuşilor solubili în apă pe adsorbanţi hidrofili. Fazele mobile sunt soluții tampon apoase cu o valoare dată de pH.

În cromatografia de permeabilitate cu gel, se folosesc sorbi hidrofobi.

solvenți organici nepolari (toluen, diclormetan, te-

ragidofuran). Această metodă este utilizată pentru analiza compușilor care sunt slab solubili

jante în apă.

Detectoare. Detectoarele refractometrice diferențiale, precum și detectoarele spectrofotometrice (inclusiv în regiunea spectrală IR) sunt utilizate ca detectoare în cromatografia de excludere a mărimii.

De asemenea, sunt utilizate viscozimetru și detectoare cu laser de flux.

Aceste detectoare, în combinație cu un refractometru sau altă concentrație

detector fac posibilă determinarea continuă a masei moleculare

limer în PF.

CROMATOGRAFIE LICHIDĂ ULTRA PERFORMANȚĂ

Cromatografia lichidă ultraperformanță este o variantă a cromatografia lichidă care este mai eficientă

comparație cu HPLC clasică.

O caracteristică a cromatografiei lichide de ultra-performanță este

Este posibilă utilizarea absorbanților cu dimensiuni ale particulelor de la 1,5 la 2 microni. Dimensiuni crom

coloanele matografice au de obicei de la 50 la 150 mm lungime și de la 1

până la 4 mm în diametru. Volumul probei injectate poate varia de la 1 la 50 µl.

Echipamente cromatografice utilizate în va-