Principiul de funcționare al HPLC. Cromatografie lichidă de înaltă performanță. Pregătirea pentru determinare

„Cromatografie lichidă de înaltă performanță a poluanților din apele naturale și uzate”

Introducere

Capitolul 1. Concepte de bază și clasificare a metodelor de cromatografie lichidă

1.1 Echipamente pentru cromatografie lichidă

Capitolul 2. Esența HPLC

2.1 Aplicare

Capitolul 3. Exemple de utilizare a HPLC în analiza obiectelor din mediu

Capitolul 4. Echipamente HPLC

Literatură

Aplicație

Introducere

Metode cromatografice adesea se dovedesc indispensabile pentru identificarea și cuantificarea substanțelor organice cu structuri similare. Cu toate acestea, cromatografia de gaze și cromatografia lichidă de înaltă performanță sunt cele mai utilizate pe scară largă pentru analiza de rutină a poluanților de mediu. Analiza cromatografică gazoasă a poluanților organici din apele potabile și uzate s-a bazat inițial pe utilizarea coloanelor împachetate, iar ulterior coloanele capilare de cuarț au devenit larg răspândite. Diametrul intern al coloanelor capilare este de obicei de 0,20-0,75 mm, lungime - 30-105 m. Rezultatele optime la analiza poluanților din apă sunt cel mai adesea obținute la utilizarea coloanelor capilare cu grosimi diferite de film de siliconi metilfenil cu un conținut de grupe fenil de 5 si 50%. Punctul slab al tehnicilor cromatografice care folosesc coloane capilare este adesea sistemul de introducere a probei. Sistemele de introducere a probelor pot fi împărțite în două grupe: universale și selective. Cele universale includ sisteme de injecție split și splitless, injecție „rece” în coloană și evaporare cu programare de temperatură. Când este utilizată intrare selectivă, purjare cu captură intermediară într-o capcană, analiza spațiului de cap etc. Când se utilizează sisteme de injecție universale, întreaga probă intră în coloană; în cazul injecției selective, se introduce doar o anumită fracțiune. Rezultatele obținute cu injecția selectivă sunt semnificativ mai precise, deoarece fracția care intră în coloană conține doar substanțe volatile, iar tehnica poate fi complet automatizată.

Detectoarele gaz-cromatografice utilizate în monitorizarea poluanților sunt adesea împărțite în universale, care răspund la fiecare componentă în faza mobilă, și selective, care răspund la prezența în faza mobilă a unui anumit grup de substanțe cu caracteristici chimice similare. Detectoarele universale includ ionizare cu flacără, emisie atomică, detectoare cu spectrometrie de masă și spectrometrie în infraroșu. Detectoarele selective utilizate în analiza apei sunt captarea de electroni (selectivă pentru substanțele care conțin atomi de halogen), termoionică (selectivă pentru compușii care conțin azot și fosfor), fotoionizarea (selectivă pentru hidrocarburi aromatice), detectorul de conductivitate electrolitică (selectiv pentru compușii care conțin atomi de halogeni). , sulf și azot). Cantitățile minime detectabile de substanțe variază de la nanograme la picograme pe secundă.

Cromatografie lichidă de înaltă performanță(HPLC) este o metodă ideală pentru determinarea unui număr mare de compuși labili din punct de vedere termic care nu pot fi analizați prin cromatografie gazoasă. Produsele agrochimice moderne, care includ carbonați de metil și insecticide organofosforice și alte substanțe nevolatile, sunt adesea obiectul analizei prin cromatografia lichidă. Cromatografia lichidă de înaltă performanță devine din ce în ce mai răspândită printre alte metode utilizate în monitorizarea mediului, și pentru că are perspective strălucitoare în ceea ce privește automatizarea pregătirii probelor.

CAPITOLUL 1. CONCEPTE DE BAZĂ ȘI CLASIFICAREA METODELOR DE CROMATOGRAFIE LICHIDĂ

Cromatografia lichidă este împărțită în mai multe clase în funcție de tipul de purtător de fază staționară. Simpla instrumentare a cromatografiei pe hârtie și în strat subțire a condus la utilizarea pe scară largă a acestor metode în practica analitică. Cu toate acestea, marile capacități ale cromatografiei lichide pe coloană au stimulat îmbunătățirea echipamentelor pentru această metodă clasică și au condus la introducerea rapidă a HPLC. Trecerea eluentului prin coloană sub presiune înaltă a făcut posibilă creșterea dramatică a vitezei de analiză și creșterea semnificativă a eficienței separării datorită utilizării sorbantului fin dispersat. Metoda HPLC permite în prezent izolarea, analiza cantitativă și calitativă a amestecurilor complexe de compuși organici.

Pe baza mecanismului de interacțiune a substanței care este separată (eluat) cu faza staționară, se disting cromatografia de adsorbție, partiție, schimb ionic, excludere, pereche de ioni, schimb de liganzi și cromatografia de afinitate.

Cromatografia de adsorbție. Separarea prin cromatografie de adsorbție se realizează ca urmare a interacțiunii substanței care este separată cu un adsorbant, cum ar fi oxid de aluminiu sau silicagel, care are centri polari activi la suprafață. Solventul (eluentul) este un lichid nepolar. Mecanismul de sorbție constă într-o interacțiune specifică între suprafața polară a sorbantului și secțiunile polare (sau capabile de polarizare) ale moleculelor componentei analizate (Fig. 1).

Orez. 1. Cromatografia lichidă de adsorbție.

Cromatografia de partiție. În varianta de distribuție a cromatografiei lichide, separarea unui amestec de substanțe se realizează datorită diferenței dintre coeficienții lor de distribuție între două faze nemiscibile - eluantul (fază mobilă) și faza situată pe sorbent (faza staționară).

La faza normala Cromatografia lichidă de partiție utilizează un eluent nepolar și grupări polare grefate pe suprafața sorbantului (cel mai adesea silicagel). Alchilclorosilanii substituiți care conțin grupări polare cum ar fi nitril, grupare amino etc. sunt utilizați ca modificatori de suprafață de silicagel (faze grefate) (Fig. 2). Utilizarea fazelor altoite face posibilă controlul fin al proprietăților de sorbție ale suprafeței fazei staționare și obținerea unei eficiențe ridicate de separare.

Orez. 2. Cromatografia de partiție cu fază grefată (opțiune de fază normală).

Faza inversata cromatografia lichidă se bazează pe distribuția componentelor amestecului între un eluent polar și grupări nepolare (lanțuri lungi de alchil) grefate pe suprafața sorbantului (Fig. 3).

Orez. 3. Cromatografia de partiție cu fază grefată (opțiune cu fază inversă).

O variantă mai puțin utilizată a cromatografiei lichide în fază suportată este cea în care o fază staționară lichidă este depusă pe un suport staționar.

Exclusiv (pentru gel) cromatografia este o variantă a cromatografiei lichide în care separarea substanțelor are loc datorită distribuției moleculelor între solventul situat în porii sorbentului și solventul care curge între particulele acestuia.

Afină cromatografia se bazează pe interacțiuni specifice ale proteinelor separate (anticorpi) cu substanțe (antigene) grefate pe suprafața sorbantului (rășină sintetică), care formează selectiv complexe (conjugate) cu proteine.

Schimbul de ioni, perechea de ioni și cromatografia de schimb de liganzi sunt utilizate în principal în analiza anorganică.

Parametrii de bază ai separării cromatografice.

Principalii parametri ai separării cromatografice sunt volumul de retenție și timpul de retenție al componentei amestecului (Fig. 4).

Timpul de retenție tR este timpul scurs din momentul introducerii probei în coloană până la eliberarea maximului vârfului corespunzător. Înmulțind timpul de retenție cu viteza volumetrică a eluentului F, obținem volumul de retenție VR:

Timpul de retenție corectat este timpul scurs de la apariția vârfului maxim al componentei nesorbite până la vârful compusului corespunzător:

tR" = tR - t0 ;

Volumul de retenție normalizat sau corectat este volumul de retenție corectat pentru volumul mort al coloanei V0, adică volumul de retenție al componentei nesorbite:

VR" = VR - V0;

O caracteristică a retenției este și coeficientul de capacitate k", definit ca raportul dintre masa unei substanțe în faza staționară și masa unei substanțe în faza mobilă: k" = mn / mp;

Valoarea k" poate fi determinată cu ușurință din cromatogramă:

Cei mai importanți parametri ai separării cromatografice sunt eficiența și selectivitatea acesteia.

Eficiența coloanei, măsurată prin înălțimea plăcilor teoretice (HETP) și invers proporțională cu numărul acestora (N), este mai mare, cu cât vârful substanței eliberate în același timp de retenție este mai îngust. Valoarea eficienței poate fi calculată din cromatogramă folosind următoarea formulă:

N = 5,54. (tR / 1/2) 2 ,

Unde tR- timp de retenție,

w 1/2 - lățimea vârfului la jumătatea înălțimii

Cunoscând numărul de plăci teoretice pe coloană, lungimea coloanei L și diametrul mediu al granulelor de absorbant dc, este ușor de obținut valorile înălțimii echivalente cu placa teoretică (HETT) și înălțimea redusă (RHETT):

HETT = L/N PVET = HETT/d c

Aceste caracteristici fac posibilă compararea eficienței diferitelor tipuri de coloane, evaluarea calității sorbantului și a calității umplerii coloanelor.

Selectivitatea pentru separarea a două substanțe este determinată de ecuația:

Când luăm în considerare separarea unui amestec de două componente, gradul de separare RS este, de asemenea, un parametru important:

;

Vârfurile sunt considerate rezolvate dacă valoarea RS este mai mare sau egală cu 1,5.

Principalii parametri cromatografici sunt legați de următoarea ecuație pentru rezoluție:

;

Factorii care determină selectivitatea separării sunt:

1) natura chimică a sorbantului;

2) compoziția solventului și a modificatorilor săi;

3) structura chimică și proprietățile componentelor amestecului care se separă;

4) temperatura coloanei

1.1 Echipamente pentru cromatografie lichidă

În cromatografia lichidă modernă, sunt utilizate instrumente de diferite grade de complexitate - de la cele mai simple sisteme până la cromatografe de înaltă clasă echipate cu diferite dispozitive suplimentare.

În fig. 4. Se prezintă o schemă bloc a unui cromatograf lichid, care conține setul minim necesar de componente, într-o formă sau alta, prezente în orice sistem cromatografic.

Orez. 4. Schema bloc a unui cromatograf lichid.

Pompa (2) este proiectată pentru a crea un debit constant de solvent. Designul său este determinat în primul rând de presiunea de funcționare din sistem. Pentru a funcționa în intervalul 10-500 MPa, se folosesc pompe de tip piston (seringă) sau cu piston. Dezavantajul primului este necesitatea opririlor periodice pentru umplerea cu eluent, iar al doilea este complexitatea mai mare a designului și, în consecință, prețul ridicat. Pentru sistemele simple cu presiuni de funcționare scăzute de 1-5 MPa, se folosesc cu succes pompe peristaltice ieftine, dar deoarece este dificil să se obțină o presiune și un debit constant, utilizarea lor este limitată la sarcini pregătitoare.

Injectorul (3) asigură introducerea în coloană a unei probe dintr-un amestec de componente care se separă cu o reproductibilitate destul de ridicată. Sistemele simple de injectare a probei „stop-flow” necesită oprirea pompei și, prin urmare, sunt mai puțin convenabile decât pipetele cu buclă dezvoltate de Reodyne.

Coloanele HPLC (4) sunt tuburi din oțel inoxidabil cu pereți groși care pot rezista la presiuni mari. Densitatea și uniformitatea ambalării coloanei cu sorbant joacă un rol important. Coloanele de sticlă cu pereți groși sunt utilizate cu succes pentru cromatografia lichidă la presiune joasă. Temperatura constantă este asigurată de un termostat (5).

Detectoarele (6) pentru cromatografie lichidă au o celulă de curgere în care are loc o măsurare continuă a unei proprietăți a eluentului care curge. Cele mai populare tipuri de detectoare de uz general sunt refractometrele, care măsoară indicele de refracție și detectoarele spectrofotometrice, care măsoară absorbanța unui solvent la o lungime de undă fixă ​​(de obicei în regiunea ultravioletă). Avantajele refractometrelor (și dezavantajele spectrofotometrelor) includ sensibilitatea scăzută la tipul de compus determinat, care poate să nu conțină grupări cromofore. Pe de altă parte, utilizarea refractometrelor este limitată la sisteme izocratice (cu o compoziție de eluent constantă), astfel încât utilizarea unui gradient de solvent în acest caz este imposibilă.

Coloanele HPLC, care sunt cele mai des utilizate în analiza poluanților de mediu, au 25 cm lungime și un diametru interior de 4,6 mm și sunt împachetate cu particule sferice de silicagel de 5-10 µm grefate cu grupări octadecil. În ultimii ani, au devenit disponibile coloane cu diametre interne mai mici umplute cu particule mai mici. Utilizarea unor astfel de coloane duce la o reducere a consumului de solvenți și a timpului de analiză, o creștere a sensibilității și a eficienței separării și, de asemenea, simplifică problema conectării coloanelor la detectoarele spectrale. Coloanele cu diametrul interior de 3,1 mm sunt echipate cu un cartus de siguranta (precoloana) pentru a creste durata de viata si a imbunatati reproductibilitatea analitica.

Detectoarele utilizate în instrumentele HPLC moderne sunt de obicei un detector cu matrice de diode UV, un detector fluorescent și un detector electrochimic.

Trebuie avut în vedere că în munca practică, separarea are loc adesea nu printr-unul, ci prin mai multe mecanisme simultan. Astfel, separarea prin excludere poate fi complicată de efectele de adsorbție, separarea prin adsorbție prin efectele de distribuție și invers. Mai mult, cu cât diferența dintre substanțele din probă este mai mare în ceea ce privește gradul de ionizare, bazicitate sau aciditate, greutate moleculară, polarizabilitate și alți parametri, cu atât este mai mare probabilitatea unui mecanism de separare diferit pentru astfel de substanțe.

În practică, cea mai răspândită este cromatografia în „fază inversă” (distribuție), în care faza staționară nu este polară, dar faza mobilă este polară (adică inversul cromatografia în „fază directă”).

În majoritatea laboratoarelor din întreaga lume, un grup de 16 HAP prioritare sunt analizate prin HPLC sau CMS.

CAPITOLUL 2. ESENȚA HPLC

În cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC), natura proceselor care au loc în coloana cromatografică este în general identică cu procesele din cromatografia în gaz. Singura diferență este în utilizarea lichidului ca fază staționară. Datorită densității mari a fazelor mobile lichide și rezistenței mari a coloanelor, cromatografia de gaz și lichid diferă foarte mult în instrumentație.

În HPLC, solvenții puri sau amestecurile acestora sunt de obicei utilizați ca faze mobile.

Pentru a crea un flux de solvent pur (sau amestecuri de solvenți), numit eluent în cromatografia lichidă, se folosesc pompe incluse în sistemul hidraulic al cromatografului.

Cromatografia de adsorbție este efectuată ca urmare a interacțiunii unei substanțe cu adsorbanți, cum ar fi silicagel sau oxid de aluminiu, care au centrii activi la suprafață. Diferența în capacitatea de a interacționa cu centrele de adsorbție ale diferitelor molecule de probă duce la separarea acestora în zone în timpul mișcării cu faza mobilă de-a lungul coloanei. Separarea zonei a componentelor realizată în acest caz depinde de interacțiunea atât cu solventul, cât și cu adsorbantul.

Cele mai utilizate în HPLC sunt adsorbanții de silicagel cu diferite volume, suprafețe și diametre ale porilor. Oxidul de aluminiu și alți adsorbanți sunt folosiți mult mai rar. Motivul principal pentru aceasta:

Rezistenta mecanica insuficienta, care nu permite ambalarea si utilizarea la presiuni mari caracteristice HPLC;

silicagel, în comparație cu oxidul de aluminiu, are o gamă mai largă de porozitate, suprafață și diametru al porilor; Activitatea catalitică semnificativ mai mare a oxidului de aluminiu duce la denaturarea rezultatelor analizei din cauza descompunerii componentelor probei sau a chimiosorbției ireversibile a acestora.

Detectoare pentru HPLC

Cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC) este utilizată pentru a detecta substanțe polare nevolatile care, din anumite motive, nu pot fi transformate într-o formă adecvată pentru cromatografia în gaz, chiar și sub formă de derivați. Astfel de substanțe, în special, includ acizi sulfonici, coloranți solubili în apă și unele pesticide, de exemplu derivați de fenil-uree.

Detectoare:

Detector UV pe o matrice de diode. O „matrice” de fotodiode (mai mult de două sute dintre ele) înregistrează în mod constant semnale în regiunile UV și vizibile ale spectrului, oferind astfel înregistrarea spectrelor UV-B în modul de scanare. Acest lucru vă permite să înregistrați continuu, la sensibilitate ridicată, spectre nedistorsionate ale componentelor care trec rapid printr-o celulă specială.

În comparație cu detecția cu o singură lungime de undă, care nu oferă informații despre puritatea maximă, capacitatea de a compara spectre complete ale unei rețele de diode oferă un grad mult mai mare de încredere în rezultatul identificării.

Detector de fluorescență. Marea popularitate a detectorilor fluorescenți se datorează selectivității și sensibilității lor foarte ridicate, precum și faptului că mulți poluanți ai mediului fluoresc (ex. hidrocarburi poliaromatice).

Un detector electrochimic este utilizat pentru a detecta substanțe care se oxidează sau se reduc cu ușurință: fenoli, mercaptani, amine, derivați aromatici nitro și halogen, aldehide, cetone, benzidine.

Separarea cromatografică a unui amestec pe o coloană din cauza progresului lent al PF necesită mult timp. Pentru a accelera procesul, cromatografia se efectuează sub presiune. Această metodă se numește cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC)

Modernizarea echipamentelor utilizate în cromatografia clasică în coloană lichidă a făcut din aceasta una dintre cele mai promițătoare și moderne metode de analiză. Cromatografia lichidă de înaltă performanță este o metodă convenabilă pentru separarea, izolarea preparativă și analiza calitativă și cantitativă a compușilor termolabili nevolatili cu greutate moleculară mică și mare.

În funcție de tipul de sorbent utilizat, această metodă folosește 2 opțiuni de cromatografie: pe un sorbent polar folosind un eluent nepolar (opțiune cu fază directă) și pe un sorbent nepolar cu un eluant polar - așa-numitul înalt cu fază inversă. -cromatografie lichidă de performanţă (RPHPLC).

În timpul tranziției de la eluent la eluent, echilibrul în condiții HPLC este stabilit de multe ori mai repede decât în ​​condițiile de adsorbanți polari și PF-uri neapoase. Ca urmare a acestui fapt, precum și confortul de a lucra cu eluanți apoși și apos-alcool, OFVLC a câștigat acum o mare popularitate. Majoritatea analizelor HPLC sunt efectuate folosind această metodă.

Detectoare. Ieșirea unei componente individuale din coloană este înregistrată cu ajutorul unui detector. Pentru înregistrare, puteți utiliza o modificare a oricărui semnal analitic provenit din faza mobilă și asociată cu natura și cantitatea componentului amestecului. Cromatografia lichidă folosește semnale analitice precum absorbția luminii sau emisia de lumină a soluției de ieșire (detectori fotometrici și fluorimetrici), indicele de refracție (detectori refractometrici), conductivitatea potențială și electrică (detectori electrochimici) etc.

Semnalul detectat continuu este înregistrat de un reportofon. O cromatogramă este o secvență de semnale de detectoare înregistrate pe o bandă de înregistrare, generată atunci când componentele individuale ale unui amestec părăsesc coloana. Dacă amestecul este separat, vârfurile individuale sunt vizibile pe cromatograma externă. Poziția vârfului în cromatogramă este utilizată în scopul identificării substanței, a înălțimii sau a zonei vârfului - în scopul determinării cantitative.

2.1 Aplicare

HPLC este utilizat pe scară largă în următoarele domenii de analiză chimică (sunt evidențiate obiectele de analiză în care HPLC practic nu are concurență):

· Controlul calitatii alimentelor - aditivi tonici si aromatizanti, aldehide, cetone, vitamine, zaharuri, coloranti, conservanti, medicamente hormonale, antibiotice, triazine, carbamat si alte pesticide, micotoxine, nitrozamine, hidrocarburi aromatice policiclice etc.

· Protecția mediului - fenoli, compuși organici nitro, hidrocarburi aromatice mono- și policiclice, o serie de pesticide, anioni și cationi principali.

· Criminalistică - droguri, explozivi organici și coloranți, produse farmaceutice puternice.

· Industria farmaceutică - hormoni steroizi, aproape toate produsele de sinteză organică, antibiotice, preparate polimerice, vitamine, preparate proteice.

· Medicină - substanțele biochimice și medicinale enumerate și metaboliții acestora din fluidele biologice (aminoacizi, purine și pirimidine, hormoni steroizi, lipide) în diagnosticarea bolilor, determinarea ratei de eliminare a medicamentelor din organism în scopul dozării lor individuale.

· Agricultura – determinarea nitraților și fosfatului în sol pentru determinarea cantității necesare de îngrășăminte aplicate, determinarea valorii nutritive a furajelor (aminoacizi și vitamine), analiza pesticidelor din sol, apă și produse agricole.

· Biochimie, chimie bioorganică, inginerie genetică, biotehnologie - zaharuri, lipide, steroizi, proteine, aminoacizi, nucleozide și derivații acestora, vitamine, peptide, oligonucleotide, porfirine etc.

· Chimie organică - toți produsele stabile de sinteză organică, coloranți, compuși termolabili, compuși nevolatili; chimie anorganică (aproape toți compușii solubili sub formă de ioni și compuși complecși).

· controlul calității și siguranței alimentelor, băuturilor alcoolice și nealcoolice, apei potabile, substanțelor chimice de uz casnic, parfumurilor în toate etapele producției acestora;

· determinarea naturii poluării la locul unui dezastru provocat de om sau al unei urgențe;

· detectarea și analiza substanțelor narcotice, puternice, otrăvitoare și explozive;

· determinarea prezenței substanțelor nocive (hidrocarburi policiclice și alte aromatice, fenoli, pesticide, coloranți organici, ioni de metale grele, alcaline și alcalino-pământoase) în efluenții lichizi, emisiile atmosferice și deșeurile solide din întreprinderi și în organismele vii;

· monitorizarea proceselor de sinteza organica, rafinarea petrolului si carbunelui, productia biochimica si microbiologica;

analiza calității solului pentru fertilizare, prezența pesticidelor și erbicidelor în sol, apă și produse, precum și valoarea nutritivă a furajelor; sarcini complexe de cercetare analitică; obţinerea de microcantităţi de substanţe ultrapure.

CAPITOLUL 3. EXEMPLE DE UTILIZARE HPLC ÎN ANALIZA OBIECTELOR DE MEDIU

HPLC este o metodă de monitorizare a HAP în obiectele din mediu

Pentru hidrocarburile aromatice policiclice (HAP), substanțele ecotoxice din clasa I de pericol, au fost stabilite niveluri extrem de scăzute ale concentrațiilor maxime admisibile (MAC) în obiectele naturale. Determinarea HAP la nivelul MPC și mai jos este una dintre cele mai complexe probleme analitice, iar pentru rezolvarea acestora sunt folosite metode analitice de înaltă tehnologie (GC-MS, GC, HPLC). La alegerea unei metode de monitorizare, la principalele caracteristici luate în considerare se adaugă sensibilitatea și selectivitatea, viteza și eficiența, deoarece monitorizarea presupune analize în serie. Opțiunea HPLC pe coloane scurte, cu diametru mic, îndeplinește în mare măsură aceste cerințe. Folosind această metodă, autorii au dezvoltat și certificat metode de monitorizare a benzo[a]pirenului în trei medii naturale: aerosoli, strat de zăpadă și apă de suprafață. Metodele se caracterizează prin: prepararea simplă a probelor standardizate, inclusiv extracția HAP cu solvenți organici și concentrarea extractului, introducerea directă a extractului concentrat într-o coloană cromatografică, utilizarea detectiei fotometrice cu lungimi de undă multiple în regiunea UV a spectrului. , identificarea vârfurilor PAH în cromatograme folosind doi parametri, timpul de retenție și raportul spectral . Eroarea totală nu depășește 10% la determinarea benzo[a]pirenului în aerosol în intervalul de concentrație de la 0,3 la 450 ng/m3, în apa de suprafață în intervalul de concentrație de la 10 la 1000 ng/l, în stratul de zăpadă de suprafață interval de densitate de la 0,5 până la 50 μg/m2. Pentru cazul determinării simultane a HAP prioritare (până la 12 compuși) și înregistrarea vârfurilor neomogene de analiți, s-a propus separarea repetată a extractului prin modificarea selectivității fazei mobile, a lungimii de undă de detecție și a temperaturii coloanei, ținând cont de individualitatea. se determină proprietăţile HAP.

1 . Calitatea aerului ambiental. Concentrația în masă a benzo[a]pirenului. Metodologie de realizare a măsurătorilor prin metoda HPLC. Certificat de certificare MVI nr. 01-2000.

2 . Calitatea apelor uzate de suprafață și tratate. Concentrația în masă a benzo[a]pirenului. Metodologie de realizare a măsurătorilor prin metoda HPLC. Certificat de certificare MVI nr. 01-2001.

3 . Calitatea stratului de zăpadă. Concentrația în masă a benzo[a]pirenului. Metodologie de realizare a măsurătorilor prin metoda HPLC. Certificat de certificare MVI nr. 02-2001.

Îndepărtarea anilinei din soluțiile apoase folosind deșeuri de la reducerea aluminotermă a calcarului de cupru

Problema eliminării hidrocarburilor din apele uzate este o sarcină urgentă. În multe industrii chimice, petrochimice și alte industrii se formează anilina și derivații săi, care sunt substanțe toxice. Anilina este o substanță foarte toxică, MPC - 0,1 mg/m 3. Anilina și derivații săi sunt solubili în apă și, prin urmare, nu pot fi îndepărtați prin sedimentare gravitațională.

Una dintre cele mai bune metode de tratare a apelor uzate din poluanți organici este utilizarea adsorbanților anorganici și organici care pot fi regenerați (aluminosilicați, argile modificate, lemn, fibre etc.) și incapabili de regenerare (cărbune activ, materiale polimerice macroporoase etc.). ).

Adsorbanții regenerabili pot elimina din apă substanțele organice cu polarități diferite. Căutarea adsorbanților eficienți este o sarcină urgentă.

Acest raport prezintă rezultatele unui studiu în domeniul utilizării cântarilor de cupru laminat de la Uzina de cabluri din Erevan (OPMOErKZ) ca absorbanți de anilină.

Studiile cromatografice au fost efectuate pe un cromatograf HPLC / cromatografie lichidă de înaltă performanță / sisteme (Waters 486 - detector, Waters 600S - controler, Waters 626 - Pompă), pe o coloană de 250 x 4 mm umplută cu absorbanții studiati, mobilul viteza de fază a fost de 1 ml/m / faza mobilă sunt solvenții pe care îi studiem/, detectorul este UV-254. Analiza spectroscopică UV a fost efectuată pe un spectrofotometru Specord-50; spectrele au fost obținute folosind programul de calculator ASPECT PLUS.

La anumite volume de anilină din apă au fost adăugate porții de adsorbanți cântărite cu precizie, ale căror concentrații inițiale au fost variate. Amestecul a fost agitat bine timp de 6 ore, apoi proba a fost lăsată să se sedimenteze. Adsorbția este finalizată aproape în 48 de ore.Cantitatea de anilină precipitată este determinată prin analiză spectrofotometrică UV și refractometrică.

În primul rând, proprietățile de adsorbție ale OPMOErKZ au fost studiate la îndepărtarea anilinei dintr-o soluție în tetraclorură de carbon. S-a dovedit că anilina absoarbe cel mai bine sorbentul 3 (tabel).

S-au efectuat măsurători și pentru soluții apoase de anilină în concentrații de 0,01-0,0001 mol/l. Tabelul prezintă datele pentru o soluție de 0,01 M.

Absorbția anilinei de către diverși adsorbanți dintr-o soluție apoasă 0,01 M de anilină la 20°C

S-a stabilit anterior că adsorbția în intervalele de concentrație specificate crește și depinde liniar de indicele de refracție. Cantitatea de anilină a fost determinată din relația grafică „indice de refracție - concentrație molară” și corectată prin date atât din cromatografia lichidă, cât și din analiza spectrală UV.

Cel mai activ sorbent pentru soluții apoase este sorbentul 3. Cantitatea de poluant adsorbit a fost calculată ca diferență între cantitatea totală de poluant adăugată la soluția inițială și reziduul acestuia în soluția finală.

Metode de determinare a HAP în obiectele din mediu

În mod obișnuit, metodele de cromatografie gazoasă (GC) și cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) sunt utilizate pentru a determina HAP. Separarea principalelor 16 PAH suficiente pentru analiza cantitativă se realizează fie prin utilizarea coloanelor capilare în cromatografia în gaz, fie a coloanelor de înaltă performanță utilizate în HPLC. Trebuie amintit că o coloană care separă bine amestecurile de calibrare a șaisprezece PAH nu garantează că acestea vor fi, de asemenea, bine separate de fundalul compușilor organici însoțitori din probele studiate.

Pentru a simplifica analiza, precum și pentru a obține rezultate de înaltă calitate, majoritatea procedurilor analitice conțin o etapă de izolare preliminară (separare) a HAP din alte grupe de compuși asociați din probe. Cel mai adesea, metodele de cromatografie lichidă la presiune joasă sunt utilizate în aceste scopuri într-un sistem lichid-solid sau lichid-lichid folosind mecanisme de adsorbție, de exemplu folosind silicagel sau alumină, uneori se folosesc mecanisme mixte, de exemplu adsorbția și excluderea folosind Sephadex.

Utilizarea purificării preliminare a probelor permite evitarea influenței:

Compuși complet nepolari, cum ar fi hidrocarburile alifatice;

Compuși polari moderat și puternic, de exemplu, ftalan, fenoli, alcooli polihidroxilici, acizi;

Compuși cu greutate moleculară mare, cum ar fi rășinile.

Există în principal două tipuri de detectoare utilizate în cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC): un detector fluorimetric sau un detector spectrofotometric cu matrice de fotodiode. Limita de detecție a HAP în detecția fluorimetrică este foarte scăzută, ceea ce face această metodă deosebit de potrivită pentru determinarea urmelor de compuși poliaromatici. Cu toate acestea, detectoarele fluorimetrice clasice nu oferă practic nicio informație despre structura compusului studiat. Modelele moderne fac posibilă înregistrarea spectrelor de fluorescență care sunt caracteristice compușilor individuali, dar acestea nu sunt încă utilizate pe scară largă în practica de măsurare de rutină. Un detector spectrofotometric cu o matrice de fotodiode (PDL) face posibilă înregistrarea spectrelor de absorbție în domeniul spectral UV și vizibil; aceste spectre pot fi utilizate pentru identificare. Informații similare pot fi obținute folosind detectoare cu scanare rapidă.

La selectarea tehnicilor analitice pentru separarea, identificarea și analiza cantitativă a acestor HAP, trebuie să se țină seama de următoarele condiții:

Nivelul conținuturilor determinate în probele de testat;

Numărul de substanțe înrudite;

Procedura analitică utilizată (tehnica de măsurare);

Capabilitățile echipamentelor în serie.

Dezvoltarea unei metode pentru determinarea elementelor alcalino-pământoase și a magneziului folosind cromatografia lichidă de înaltă performanță ionică

Dezvoltarea și îmbunătățirea metodelor care permit rezolvarea problemelor de analiză a apei este o problemă importantă în chimia analitică. Dezvoltarea cromatografiei lichide de înaltă performanță la presiune înaltă a stimulat dezvoltarea unei noi direcții în cromatografia cu schimb de ioni, așa-numita cromatografie ionică. Sinteza absorbanților pentru cromatografia ionică este dificilă, deoarece există destul de multe cerințe pentru aceștia. Din cauza lipsei schimbătoarelor de cationi foarte eficiente disponibile comercial, a fost utilizată o fază inversă modificată dinamic, pentru care a fost sintetizat un modificator: acid N-hexadecil-N-decanoil-paraminobenoilsulfonic etil-diizopropilamoniu (DHDAS), în care amina hidrofobă care conține SO 3 - grup, capabil de schimb de cationi. După trecerea soluției modificatoare, absorbția la l = 260 nm a atins 6,4 unități de densitate optică (°E) și a atins un platou. Capacitatea de schimb ionic calculată este de 15,65 µmol. Deoarece cationii elementelor alcalino-pământoase și magneziul nu se absoarbe în regiunea UV a spectrului, a fost utilizată detectarea UV indirectă folosind un eluant sintetizat de absorbție a UV 1,4-dipiridiniubutan bromură (bromură DPB). Deoarece ionii de halogen distrug părțile de oțel ale coloanei, ionul de bromură al 1,4-dipiridiniubutanului a fost înlocuit cu ionul acetat. La spălarea coloanei cu eluent, contraionul modificatorului, etildiizopropilamoniul, este înlocuit cu ionul absorbant UV 1,4-dipiridiniubutan. Separarea cationilor a fost efectuată la lungimea de undă optimă l = 260 nm pe o scară de 0,4 A în modul „scara pliabilă”; Polaritatea reportofonului a fost inversată. Separarea tuturor cationilor studiați a fost realizată prin adăugarea unui aditiv de complexare - acid oxalic. Limitele de detecție pentru Mg 2+ , Ca 2+ , Sr 2+ , Ba 2+ sunt de 8 μg/L; 16 ug/l; 34 ug/l; respectiv 72 µg/l. În condiţiile selectate, s-a analizat apă de la robinet, conţinutul de Ca2+ în care a fost de 10,6 + 1,9 mg-ion/l, Mg2+ -2,5 + mg-ion/l. Eroarea de reproductibilitate nu depășește -2,2% pentru Ca2+ și 1,4% pentru Mg2+.

Analiza complexelor de cadmiu din mediu

Pentru a studia mecanismele de migrare a metalelor grele în biosferă, sunt necesare date despre formele chimice de existență a metalelor în natură. Dificultățile în analiza compușilor unuia dintre cele mai toxice metale - cadmiul - se datorează faptului că formează complexe fragile, iar atunci când se încearcă izolarea acestora, echilibrele naturale sunt distorsionate. În această lucrare, compușii de cadmiu din sol și plante au fost studiați folosind o tehnică bazată pe separarea cromatografică a extractelor urmată de identificarea componentelor prin metode de analiză chimică. Această abordare a făcut posibilă nu numai identificarea formelor chimice ale cadmiului, ci și urmărirea transformărilor acestora în obiectele din mediu.

Grupările OH de carbohidrați și polifenoli (inclusiv flavonoide), C=O, fosfați, NH2, NO2 și grupările SH sunt coordonate cu cadmiul din obiectele biosferei. În scopul acestui studiu, a fost compilat un set de liganzi model reprezentând aceste clase de compuși. Interacțiunea liganzilor model cu sărurile de cadmiu solubile în apă a fost studiată folosind spectroscopie UV și HPLC.

Pentru a izola compușii de cadmiu s-a folosit extracția cu solvenți special selectați (fără formând complexe cu Cd). Acest lucru face posibilă separarea cadmiului de toate metalele grele, cu excepția analogului său chimic apropiat, zincul. Picurile cu conținut de cadmiu și zinc în cromatogramele extractelor obținute au fost detectate prin legarea metalelor sub forma ditizonaților acestora. Pentru a separa de zinc, a fost utilizată diferența de stabilitate a complexelor Cd și Zn la pH 6-8. Compușii Cd izolați au fost identificați prin HPLC utilizând modificări ale pH-ului în timpul procesului de eluare. A fost efectuată o analiză a compușilor de cadmiu cu componente ale solurilor și țesuturilor plantelor și au fost identificate substanțele produse de plante ca răspuns la creșterea aportului de cadmiu din sol. S-a demonstrat că flavonoidele, în special tricina, sunt agenți de protecție în cereale, derivați alcoxi ai cisteinei în leguminoase și atât polifenoli, cât și tioli în legumele crucifere.

CAPITOLUL 4. ECHIPAMENTE HPLC

SERIE ACCELA

Noul cromatograf lichid de performanță ultra-înaltă ACCELA este capabil să funcționeze într-o gamă largă de debite și presiuni, oferind atât separarea HPLC tipică pe coloane convenționale, cât și separare ultra-rapidă și eficientă pe coloane cu o dimensiune a particulelor de sorbant mai mică de 2 microni. la presiuni ultra-înalte (mai mult de 1000 atm.).

Sistemul include o pompă cu gradient de cadran capabilă să genereze presiuni care depășesc 1000 atm și cu un volum de retenție de numai 65 µL, permițând separări cromatografice de mare viteză. Autosampler ACCELA Capabil să funcționeze la un ciclu de injectare a probei de 30 de secunde și să ofere cea mai mare reproductibilitate a injecției. Detector cu matrice de diode Accela PDA cu un volum minim al celulei cu flux (2 µl) optimizat pentru cromatografie de mare viteză, utilizează tehnologia patentată LightPipe și menține formele simetrice ale vârfurilor care vin cu un sistem de cromatografie și coloane impecabile.

Sistemul se interfață perfect cu spectrometrele de masă pentru a crea cele mai puternice și mai bune sisteme LC/MS disponibile în lume.

Coloane UHP de 1,9 µm disponibile de la Thermo Electron pentru orice aplicație

SERIE TSP

Principiul modular al construcției instrumentelor HPLC permite clientului să asambleze în mod flexibil echipamentele pentru a rezolva orice probleme analitice și, dacă se schimbă, să le modifice rapid și economic. O selecție largă de module include pompe - de la gradient izocratic la gradient cu patru componente, de la microcoloană la semipreparativ, toți detectoarele disponibile, sisteme de introducere a probelor - de la injectoare manuale la autosamplere cu posibilitatea oricărei manipulări cu mostre, software puternic pentru măsurarea procesării rezultate și gestionarea tuturor modulelor de sistem. Toate modulele sunt certificate de CSA, TUF/GS, FCC(EMI), VDE (EMI), ISO-9000, sunt compacte, au un design modern, sunt ușor de operat, dotate cu afișaj încorporat și autodiagnosticare sistem, vă permit să creați și să salvați metode de sarcină. Ele îndeplinesc criteriile „Exemplary Laboratory Practice” (GLP) și sunt incluse în Registrul Instrumentelor de Măsurare al Federației Ruse. Rapoartele de măsurare sunt emise în conformitate cu Farmacopeile din Anglia, SUA, Germania și Franța.

Sistemele modulare TSP se caracterizează prin cea mai mare fiabilitate și stabilitate în funcționare.

Combinația de module oferă analistului toate avantajele unui sistem integrat, pe de o parte, și flexibilitatea unui sistem modular, pe de altă parte. Indiferent de aplicația cromatografiei lichide de înaltă performanță (HPLC) - produse farmaceutice, biotehnologie, analize de mediu, analize clinice, analize de alimente și băuturi, analize petrochimice și chimice - acest instrument este întotdeauna configurat optim pentru a se potrivi celor mai înalte cerințe.

Atât sistemele de rutină de cercetare, cât și cele de mare debit oferă:

Degazare cu solvent foarte eficient

Abilitatea de a lucra cu cantități mici și ultra-mice de eșantion

Cea mai mare sensibilitate, atât cu detector UV/VIS, cât și cu matrice de diode (cu celebra tehnologie LightPipe cu lungimea opțională opțională de 1 sau 5 cm)

Lucrul cu diferite coloane

Analiză cantitativă de cea mai înaltă precizie

Abilitatea de a lucra automat cu diferite volume de mostre

Eroare RMS pentru timpi de retenție mai mici de 0,3%

Suprafața minimă de lucru ocupată de sistem

Cea mai mare fiabilitate și stabilitate a parametrilor.

Pompă Surveyor LC- Pompă HPLC cu cel mai bun timp de retenție reproductibil al oricărei pompe cu gradient cu patru componente disponibile în lume. Degazătorul de vid cu patru canale și amortizorul de pulsații integrate oferă o stabilitate excelentă a liniei de bază pentru o sensibilitate maximă și precizie de cuantificare.

Autosampler oferă cea mai mare productivitate și flexibilitate de analiză. O gamă largă de tăvi de mostre - de la flacoane standard la microplăci cu 96 și 384 de godeuri - acoperă nevoile pentru aproape toate aplicațiile. Noua tehnologie asigură injectarea probei practic fără pierderi; aproape 5 µl de probă sunt injectați cu un autosampler dintr-un volum total de probă de 5 µl.

INSPECTOR

Detector UV/Vis și PDA (Detector cu matrice de diode)

Surveyor UV/Vis- Detectorul de lumină vizibilă și ultravioletă cu lungime de undă variabilă este o combinație de rentabilitate și fiabilitate cu cea mai mare sensibilitate a tehnologiei LightPipe. O selecție largă de celule de flux face acest detector versatil pentru toate aplicațiile, de la cele care utilizează cromatografia capilară sau pe microcoloană până la semipreparativă și preparativă.

Surveyor PDA Detectorul este cel mai sensibil dintre toți detectoarele HPLC care utilizează o matrice de diode. Optica cu sursă de lampă dublă acoperă fără probleme întregul interval de lungimi de undă de la 190 la 800 nm. Formatorul de fascicul cu fibră optică oferă o rezoluție optică excelentă fără a sacrifica sensibilitatea.

Topograf R.I. detector refractometric cu o cuvă termostatată de volum minim cu control electronic complet de la un computer.

Surveyor FL detector de scanare fluorimetrică cu cea mai mare sensibilitate și capacități de detectare pentru fluorescență, chemiluminiscență și fosforescență.

O selecție largă de autosamplere vă permite să lucrați atât cu fiole convenționale, cât și cu plăci cu 96 de poziții, utilizate pe scară largă în biochimie și practica clinică. Lucrul cu ele este facilitat de utilizarea plăcilor similare pentru prepararea probelor folosind extracția în fază solidă.

400 Acționare electrică, buclă Valco (20 µl - standard) cu capacitate de umplere parțială.

Carusel 96 mostre.

Acționare electrică, termostat coloană, buclă Valco (100 µl - standard) cu posibilitate de umplere parțială.Mod AutoMix pentru prepararea probei. Carusel de probe: 84 x 2 ml (probe) + 3 x 10 ml (reactivi). Termostat în coloană încorporat. 420

Autosampler în buclă pentru lucrări de cercetare cu capacitatea de a funcționa în modurile de umplere completă, parțială și injectare a probei de microlitri. O gamă largă de carusele (standard - 96 de mostre).

Autosampler tabletă pentru lucrul cu plăci cu 96 și 384 de poziții. Injectarea probei în buclă sub presiune, capacitatea de a injecta probe mai mici de 1 µl. Posibilitatea de a instala un alimentator de tablete. HPLC

Principalii producători de echipamente HPLC

· Ape - cromatografie ultraperformanta, spectrometrie de masa, coloane, extractie in faza solida;

Varian, Inc. - cromatografe și coloane, accesorii pentru extracția în fază solidă;

· Agilent Technologies - cromatografe și coloane;

· Hypersil - coloane și adsorbanți.

· Merck KGaA - plăci și accesorii TLC pentru TLC, coloane, adsorbanți, faze mobile pentru HPLC, accesorii pentru extracția în fază solidă

· Dionex - echipamente si coloane pentru HPLC, in special pentru cromatografie ionica.

Literatură

1. Pilipenko A.T., Pyatnitsky I.V. Chimie analitică. În două cărți: cartea..1 - M.: Chimie, 1990, -480 p.

1. Pilipenko A.T., Pyatnitsky I.V. Chimie analitică. În două cărți: cartea..2 - M.: Chimie, 1990, -480 p.

2. Vasilyev V.P. Chimie analitică. În 2 ore.Partea 2. Metode fizico-chimice de analiză: Manual. pentru Khimko - technol. specialist. universități – M.: Mai sus. şcoală, 1989. – 384 p.

3. Materiale hidrochimice. Volumul 100. Metode şi mijloace tehnice de monitorizare operaţională a calităţii apelor de suprafaţă. L.: Gidrometeo-izdat, 1991. – 200 p.

4. Lurie Yu.Yu. Chimia analitică a apelor uzate industriale / Yu.Yu. Lurie; M.: KhimiyaYU, 1984. - 448 p.

5. Ewing G. Metode instrumentale de analiză chimică / Trad. din engleza M.: Mir, 1989. – 348 p.

6. Gorelik D.O., Konopelko L.A., Pankov E.D. Monitorizarea mediului. În 2 volume.Sankt Petersburg: Crăciun. 2000. – 260 p.

7. Aivazov B.V. Introducere în cromatografie. M.: Mai sus. şcoală, 1983. – 450 p.

8. Goldberg K.A., Vigdergauz M.S. Introducere în cromatografia gazoasă. M.: Chimie, 1990. – 329 p.

9. Stolyarov B.V. și altele // Cromatografie practică în gaz și lichid. Sankt Petersburg: Universitatea de Stat din Sankt Petersburg, 1998. - P. 81.

11. Gorshkov A.G., Marinaite I.I. HPLC este o metodă de monitorizare a HAP în obiectele din mediu

12. Torosyan G. O., Martirosyan V. A., Aleksanyan A. R., Zakaryan M. O.. Îndepărtarea anilinei din soluții apoase utilizând deșeuri de la reducerea aluminotermă a calcarului de cupru laminat

13. L.A. Turkina, G.N. Koroleva Dezvoltarea unei metode pentru determinarea elementelor alcalino-pământoase și a magneziului folosind cromatografia lichidă de înaltă performanță ionică

14. Dultseva G.G., Dubtsova Yu.Yu., Skubnevskaya G.I. Analiza complexelor de cadmiu din mediu

Aplicație

DETERMINAREA CLOMAZONEI ÎN APA PRIN METODE CROMATOGRAFICE

INSTRUCȚIUNI METODOLOGICE MUK 4.1.1415-03

1. Întocmit de: Centrul Științific Federal de Igienă numit după. F.F.

Erisman; Academia Agricolă din Moscova poartă numele. K.A.

Timiryazev; cu participarea Departamentului de Supraveghere Sanitară și Epidemiologică de Stat al Ministerului Sănătății din Rusia. Dezvoltatorii metodologiei sunt enumerați la sfârșit.

3. Aprobat de Medicul Sef Sanitar de Stat

Federația Rusă, prim-viceministru al Sănătății al Federației Ruse, academician. RAMS G.G. Onishcenko 24 iunie 2003

5. Introdus pentru prima dată.

1. Partea introductivă

Producător: FMS (SUA).

Nume comercial: COMMAND.

Ingredient activ: clomazonă.

2-(2-clorbenzil)-4,4-dimetil-3-izoxalidin-3-onă (IUPAC)

Lichid vâscos maro deschis.

Punct de topire: 25 -C.

Punct de fierbere: 275 -C.

Presiunea vaporilor la 25 -C: 19,2 MPa.

Coeficientul de partiție n-octanol/apă: K logP = 2,5.

Foarte solubil în acetonă, hexan, etanol, metanol,

cloroform, diclormetan şi acetonitril; Solubilitate in apa -

1,10 g/m3 dm. Stabil la temperatura camerei cel puțin 2 ani, la 50 -C cel puțin 3 luni.

Scurte caracteristici toxicologice: orală acută

toxicitate (LD) pentru șobolani - 1369 - 2077 mg/kg; dermică acută

toxicitate (LD) pentru șobolani - mai mult de 2000 mg/kg; acut

toxicitate prin inhalare (LC) pentru șobolani - 4,8 mg/m3. dm (4 ore).

Standarde de igienă. Limita maximă de concentrație în apă este de 0,02 mg/m3. dm.

Zona de aplicare a medicamentului. Clomazona este un erbicid selectiv utilizat pentru combaterea cerealelor și buruienilor dicotiledonate în culturile de soia și orez cu aplicare pre-emergență sau înainte de însămânțare.

2. Metoda de determinare a clomazonei în apă

metode cromatografice

2.1. Dispoziții de bază

2.1.1. Principiul tehnicii

Tehnica se bazează pe extragerea clomazonei din proba analizată cu hexan, concentrarea extractului și determinarea cantitativă ulterioară prin metode alternative:

cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) cu

detector de ultraviolete, cromatografie gaz-lichid (GLC) cu un detector de viteză de recombinare constantă sau cromatografie în strat subțire (TLC). Determinarea cantitativă se realizează prin metoda de calibrare absolută.

2.1.2. Selectivitatea metodei

În condițiile propuse, metoda este specifică în prezența poluanților globali de mediu: cicloparafine clorurate (izomeri HCCH), compuși difenil (DDT și derivații săi), metaboliții acestora - benzen și fenoli policlorurați, precum și în prezența tricloroacetatului de sodiu. , care poate fi folosit pe culturi ca erbicid.

2.1.3. Caracteristicile metrologice ale metodei (P = 0,95)

Reactivi, solutii si materiale

Clomazonă care conține d.v. 99,8%

(FMS, SUA)

Azot, foarte mare GOST 9293-79

Amoniac apos, 25%, h GOST 1277-81

Acetonă, h GOST 2603-79

n-hexan, h GOST 2603-79

Peroxid de hidrogen, soluție apoasă 30% GOST 10929-77

Alcool izopropilic, chimic pur TU 6-09-402-75

Acid sulfuric, grad de reactiv GOST 4203-77

Acid clorhidric (acid clorhidric), grad de reactiv GOST 3118-77

Alcool metilic, grad de reactiv GOST

Hidroxid de sodiu, chimic pur, soluție apoasă 25% GOST 4323-77

Sulfat de sodiu anhidru, grad de reactiv GOST 1277-81

Azotat de argint, grad de reactiv GOST 1277-81

2-fenoximetanol, parte TU 6-09-3688-76

Chromaton N-AW-DMCS (0,16 - 0,20 mm)

cu 5% SE-30, Hemapol, Cehia

Chromaton N-AW-DMCS (0,16 - 0,20 mm) cu 1,5

OV-17 + 1,95% QF-1, Hemapol, Cehia

Plăci pentru HPTLC (URSS)

Plăci „Kieselgel 60 F-254” (Germania)

Recorduri „Silufol” Republica Cehă

Filtre de hârtie „bandă albă”, tăiate și pre-spălate cu hexan TU 6-09-2678-77

2.3. Dispozitive, echipamente, vase

Cromatograf lichid Milichrome

cu detector de ultraviolete

Coloana cromatografica din otel,

lungime 64 mm, diametru interior 2 mm,

umplut cu Silasorb 600, granulație 5 microni

Cromatograf gazos seria „Color” sau

similar, echipat cu un detector constant

rata de recombinare (RPR) cu o limită

detecție pentru lindan 4 x 10 g/cc. cm

Coloană cromatografică din sticlă, lungime

1 sau 2 m, diametru interior 2 - 3 mm

Microseringă tip MSh-10, capacitate 10 µl TU 5E2-833-024

Aparat de agitare tip AVU-6s TU 64-1-2851-78

Baie de apă TU 64-1-2850-76

Balanțe analitice tip VLA-200 GOST 34104-80E

Camera cromatografică GOST 10565-74

Pompă cu jet de apă GOST 10696-75

Iradiator cu mercur-cuarț tip OKN-11 TU 64-1-1618-77

Sticle de pulverizare din sticlă GOST 10391-74

Evaporator rotativ cu vid IR-1M

sau similar TU 25-11-917-76

Grup compresor TU 64-1-2985-78

Dulap de uscare TU 64-1-1411-76E

Pâlnii de separare GOST 3613-75

Baloane cotate, capacitate 100 ml GOST 1770-74

Cilindri de măsurare, capacitate 10, 50 ml GOST 1770-74E

Baloane în formă de para cu secțiune măcinată,

cu o capacitate de 100 ml GOST 10394-72

Baloane conice, capacitate 100 ml GOST 22524-77

Tuburi de centrifugare, măsurarea GOST 25336-82E

Pipete, capacitate 0,1, 1, 2, 5 și 10 ml GOST 20292-74

Pâlnii chimice, conice, cu diametru

34 - 40 mm GOST 25336-82E

2.4. Selectarea eșantionului

Selecția, depozitarea și pregătirea probelor se efectuează în conformitate cu

„Reguli unificate de prelevare a probelor de produse agricole, produse alimentare si obiecte de mediu pentru determinarea urmelor de pesticide”, aprobat prin N 2051-79 din 21.08.79.

Probele selectate pot fi păstrate la frigider pentru cel mult 5 zile. Înainte de analiză, apa (dacă este prezentă materie în suspensie) este filtrată printr-un filtru de hârtie liber.

2.5. Pregătirea pentru determinare

2.5.1. Metoda HPLC

2.5.1.1. Pregătirea fazei mobile pentru HPLC

Folosind o pipetă, se pun 5 ml de izopopanol și 5 ml de metanol într-un balon cotat de 100 ml, se adaugă hexan la semn, se amestecă și se filtrează.

2.5.1.2. Condiționarea coloanei

Se clătește coloana HPLC cu hexan-metanol-izopropanol (90:5:5, v/v) timp de 30 min. la un debit de solvent de 100 µl/min.

2.5.2. Metoda GLC. Pregătirea și condiționarea coloanei

Ambalajul finit (5% SE-30 pe Chromaton N-AW-DMCS) se toarnă într-o coloană de sticlă, se compactează sub vid, coloana este instalată în termostatul cromatograf fără a se conecta la detector și se stabilizează într-un curent de azot la un temperatura de 250 -C pentru orele 10 - 12

2.5.3. Metoda TLC

2.5.3.1. Prepararea reactivilor de dezvoltare

2.5.3.1.1. Reactiv de dezvoltare nr. 1

1 g azotat de argint se dizolvă în 1 ml apă distilată, 10 ml 2-fenoximetanol, 190 ml acetonă, se adaugă 1 - 2 picături de peroxid de hidrogen, soluția se agită și se transferă într-o sticlă de sticlă închisă la culoare.

2.5.3.2.2. Reactiv de dezvoltare N 2

0,5 g azotat de argint se dizolvă în 5 ml apă distilată într-un balon cotat de 100 ml, se adaugă 10 ml de amoniac apos 25%, soluția se ajustează la 100 ml cu acetonă, se amestecă și se transferă într-un balon de sticlă închisă la culoare.

2.5.3.2. Pregătirea fazei mobile pentru TLC

Se adaugă 20 ml de acetonă într-un balon cotat de 100 ml, se adaugă hexan până la semn și se amestecă. Amestecul se toarnă în camera cromatografică într-un strat de cel mult 6 - 8 mm în 30 de minute. Înainte de a începe cromatografia.

2.5.4. Prepararea solutiilor standard

O soluție standard stoc de clomazonă care conține 100 pg/ml este preparată prin dizolvarea a 0,010 g de medicament care conține 99,8% ingredient activ în hexan într-un balon cotat de 100 ml. Soluția se păstrează la frigider timp de o lună.

Soluții standard de lucru cu o concentrație de 0,4; 1,0; 2,0; 4,0; 10,0; Se prepară 20 și 40,0 μg/ml din soluția standard stoc de clomazonă prin diluție în serie corespunzătoare cu hexan.

Soluțiile de lucru sunt păstrate în frigider pentru cel mult o lună.

2.5.5. Construirea unui grafic de calibrare

2.5.5.1. Graficul de calibrare A (măsurare conform clauzei 2.7.1, HPLC)

Pentru a construi un grafic de calibrare, 5 μl dintr-o soluție standard de lucru de clomazonă cu o concentrație de 4,0 sunt injectate în injectorul cromatograf; 10,0; 20,0 şi 40 pg/ml.

2.5.5.2. Graficul de calibrare B (măsurare conform clauzei 2.7.2, GLC)

Pentru a construi o curbă de calibrare, se injectează 5 μl dintr-o soluție standard de lucru de clomazonă cu o concentrație de 0,4 în evaporatorul cromatograf; 1,0; 2,0; 4.0 și 10.0.

Efectuați cel puțin 5 măsurători paralele. Găsiți înălțimea medie a vârfului cromatografic pentru fiecare concentrație. Construiți un grafic de calibrare (A sau B) al dependenței înălțimii vârfului cromatografic în mm de concentrația de clomazonă din soluție în μg/ml.

2.6. Descrierea definiției

100 ml din proba de apă analizată se pun într-o pâlnie de separare cu o capacitate de 250 ml, se adaugă 10 ml soluție apoasă 25% de hidroxid de sodiu, se amestecă și se adaugă 20 ml n-hexan. Pâlnia se agită timp de 3 minute, după separarea fazelor, stratul de hexan se toarnă într-un balon de 100 ml în formă de pară, trecându-l printr-un strat de sulfat de sodiu anhidru plasat într-o pâlnie conică pe un filtru de hârtie pliat. Extracția medicamentului din proba apoasă se repetă de încă două ori, folosind 20 ml de n-hexan. Extractul combinat de hexan este evaporat pe un evaporator rotativ cu vid la o temperatură de 40-C aproape până la uscare, reziduul este eliminat cu un curent de aer sau azot de înaltă puritate. Reziduul uscat este dizolvat în 0,1 (HPLC, TLC) sau 0,25 ml (GLC) n-hexan și analizat prin una dintre metodele cromatografice.

2.7. Condiții de cromatografie

Cromatograf lichid cu detector de ultraviolete Milichrom (Rusia).

Coloana de otel lungime 64 mm, diametru interior 2 mm,

umplut cu Silasorb 600, granulație 5 microni.

Temperatura coloanei: temperatura camerei.

Faza mobilă: hexan-izopropanol-metanol (90:5:5, v/v).

Debit de eluant: 100 µl/min.

Lungime de undă de operare: 240 nm.

Sensibilitate: 0,4 unități absorbția pe scară.

Volumul probei injectat: 5 µl.

Timp de eliberare a clomazonei: aproximativ 6 minute.

Domeniu de detecție liniară: 20 - 200 ng.

Probele care produc vârfuri mai mari decât soluția standard de 40 ug/mL sunt diluate cu fază mobilă de calitate HPLC.

Cromatograf gazos „Tsvet-570” cu un detector de viteză constantă de recombinare a ionilor.

Coloana de sticla de 1 m lungime, diametru interior 3 mm, umpluta cu Chromaton N-AW-DMCS cu 5% SE-30 (0,16 - 0,20 mm).

Scara de lucru a electrometrului este de 64 x 10 10 Ohm.

Viteza casetei de înregistrare este de 200 mm/h.

Temperatura termostatului coloana - 190 -C

detector - 300 -С

evaporator - 220 -С

Viteza gazului purtător (azot) - 60 ml/min.

Volumul probei injectate este de 5 µl.

Timpul de eliberare a clomazonei este de 2,5 minute.

Domeniu de detecție liniară: 2 - 50 ng.

Probele care produc vârfuri mai mari decât soluția standard de 10 μg/mL sunt diluate cu hexan.

Pentru a crește acuratețea identificării clomazonei în prezența gamma-HCH în probă, care are un timp de retenție similar, clomazona este îndepărtată din probă prin tratare cu acid sulfuric concentrat. Analiza repetată a probei face posibilă determinarea contribuției clomazonei la semnalul cromatografic primar.

Soluție de hexan într-un balon obținută cantitativ conform punctului 2.6

(sau o parte alicotă a acestuia) se aplică pe plăci cromatografice „Silufol”, „Kieselgel 60F-254” sau „plăci HPTLC”. Soluțiile standard sunt aplicate în apropiere într-un volum corespunzător conținutului de clomazonă de 1, 2, 5 și 10 mcg. Placa este plasată într-o cameră de cromatografie care conține un amestec de n-hexan-acetonă (4:1, în volum). După ce s-a dezvoltat cromatograma, placa este scoasă din cameră, plasată sub tracțiune până când solvenții se evaporă, apoi tratată cu unul dintre reactivii de dezvoltare și plasată sub o lampă cu ultraviolete timp de 5 minute. Zona de localizare a medicamentului pe plăcile „Silufol”, „plăci HPTLC” și „Kieselgel 60F-254” apare sub formă de pete gri-maronii cu o valoare Rf de 0,35, 0,85 și, respectiv, 0,43. Pentru a determina clomazona prin TLC, puteți utiliza plăci „Alugram” și „Poligram” (fabricate în Germania). Valoarea Rf a clomazonei pe aceste plăci este de 0,37 și, respectiv, 0,38.

3. Cerințe de siguranță

Este necesar să se respecte regulile de siguranță general acceptate atunci când se lucrează cu solvenți organici, substanțe toxice și dispozitive electrice de încălzire.

4. Controlul erorilor de măsurare

Controlul operațional al erorii de măsurare și al reproductibilității se efectuează în conformitate cu recomandările MI 2335-95. GSI „Controlul intern al calității rezultatelor analizei chimice cantitative”.

5. Dezvoltatori

Yudina T.V., Fedorova N.E. (Centrul Federal de Cercetare numit după F.F. Erisman).

Davidyuk E.I. (UkrNIIGINTOX, Kiev); Kisenko M.A., Demchenko V.F. (Institutul de Medicină Muncii al Academiei de Științe și Academiei de Științe Medicale din Ucraina, Kiev).

Introducere

Analiza cromatografică este un criteriu de omogenitate a unei substanțe: dacă substanța analizată nu este separată prin nicio metodă cromatografică, atunci este considerată omogenă (fără impurități).

Diferența fundamentală dintre metodele cromatografice și alte metode fizico-chimice de analiză este posibilitatea separării substanțelor cu proprietăți similare. După separare, componentele amestecului analizat pot fi identificate (identificați natura) și cuantificați (masă, concentrație) prin orice metode chimice, fizice și fizico-chimice.

Cromatografia este utilizată pe scară largă în laboratoare și industrie pentru analiza calitativă și cantitativă a sistemelor multicomponente, controlul producției, în special în legătură cu automatizarea multor procese, precum și pentru izolarea preparativă (inclusiv industrială) a substanțelor individuale (de exemplu, metale nobile). ), separarea elementelor rare și împrăștiate.

În conformitate cu starea de agregare a eluentului, se disting cromatografia gazoasă (GC, GC) și cromatografia lichidă (HPLC, HPLC).

Cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC) este utilizată pentru analiza, separarea și purificarea polimerilor sintetici, medicamentelor, detergenților, proteinelor, hormonilor și a altor compuși importanți din punct de vedere biologic. Utilizarea detectorilor foarte sensibili face posibilă lucrarea cu cantități foarte mici de substanțe (10 -11 -10 -9 g), ceea ce este extrem de important în cercetarea biologică.

Metoda HPLC este efectuată pe diferite cromatografe lichide. Cromatografele de lichide moderne sunt concepute pentru a separa amestecurile complexe de substanțe în componente individuale și pentru a efectua analize calitative și cantitative ale componentelor amestecului separat.

cromatografie lichidă de înaltă performanță propifenazonă

În legătură cu introducerea GMP în practica producției farmaceutice în Rusia. Importanța utilizării metodelor moderne unificate de analiză este în creștere, atât la întreprinderile producătoare, cât și în sistemul de control de stat al calității medicamentelor. Metoda de bază pentru analiza calității substanțelor și a medicamentelor finite în țările cu o industrie farmaceutică dezvoltată (SUA, Anglia, Japonia, țările UE) este cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC). Această metodă, conform caracteristicilor sale, îndeplinește cerințele pentru analiza cantitativă a aproximativ 80-90% dintre medicamente.

Tehnica de efectuare a oricăror determinări cromatografice are unele cerințe generale. În primul rând, este necesar să le remarcăm pe acelea dintre ele care ridică cele mai multe întrebări în rândul specialiștilor începători.

1. Aer conditionat al camerei. Nu ar trebui să existe fluctuații bruște de temperatură în camera în care este instalat cromatograful de lichid.

Modificarea temperaturii poate modifica reținerea, eficiența și chiar selectivitatea separării.

În căldura verii în încăperi necondiționate, lucrul cu fazele mobile cu fază normală, cu fierbere scăzută devine foarte dificil. În timpul zilei, are loc evaporarea treptată a acestora, ceea ce duce la o modificare a compoziției eluentului.

La temperaturi scăzute apar probleme la lucrul cu eluanți îmbogățiți cu apă și/sau care conțin alcooli. Vâscozitatea unor astfel de eluanți crește brusc odată cu scăderea temperaturii, ceea ce duce la o creștere a presiunii în sistem.

Efectul micilor fluctuații de temperatură asupra separării poate fi eliminat prin termostatarea coloanei cromatografice sau a întregului sistem lichid (ceea ce nu este posibil pentru toate cromatografele).

2. Calitatea puterii. Majoritatea cromatografelor moderne sunt echipate cu sisteme de stabilizare a puterii, cu toate acestea, calitatea sursei de alimentare la fața locului trebuie să fie, de asemenea, ridicată. Dacă sursa de alimentare este insuficientă, orice pornire a unei serii de determinări în modul automat poate eșua din cauza unei defecțiuni.

3. Puritatea solvenților. Pentru a pregăti fazele mobile, trebuie utilizați în special solvenți puri.

În general, cerințele pentru puritatea fazei mobile depind de metoda de detectare, metoda de eluare (izocratică sau gradient), sensibilitatea detectorului la analitul țintă și concentrația acestuia.

Când se utilizează detecția UV, cerințele pentru puritatea solvenților cresc atunci când se trece la intervalul de unde scurte, mai puțin de 230-240 nm. Pentru eluția izocratică în timpul detectării UV la lungimi de undă mai mari de 220-240 nm, pot fi utilizați solvenți de „puritate ridicată”. și apă distilată. Toți reactivii adăugați în faza mobilă trebuie, de asemenea, să aibă o puritate suficientă; Poate fi util să recristalizați reactivii cristalini înainte de utilizare.

Pentru eluarea cu gradient, este necesar să se utilizeze solvenți de calitate „pentru cromatografie lichidă” și apă dublu distilată. Cerințe speciale în metoda de eluare cu gradient (în cromatografie cu fază inversă) sunt impuse purității tamponului apos și în special a apei. În primul rând, acest lucru se datorează faptului că, în stadiul inițial de eluare, adsorbantul absoarbe componente contaminante din faza mobilă îmbogățite în tampon apos, care sunt ulterior eluate și apar pe cromatogramă sub formă de „cocoașe”, „ praguri” și vârfuri individuale, care complică foarte mult selecția semnalelor analiților utile.

Cei mai puri solvenți sunt necesari pentru determinările de grup de urme de substanțe în modul de eluare în gradient.

Pentru a efectua determinări în modul de eluție în gradient, precum și determinări de precizie în mod izocratic, faza mobilă trebuie utilizată o singură dată, adică eluatul trebuie aruncat sau aruncat.

În eluția izocratică, dacă nu există probleme speciale de sensibilitate, eluantul uzat poate fi reutilizat. Un sistem în care eluatul, după ce trece prin detector, este returnat în recipientul care conține faza mobilă se numește „sistem de reciclare”. Un astfel de sistem este util în special în cazul efectuării unui număr mare de determinări izocratice de rutină pe coloane standard (250x4,6, 150x4,6) la un debit volumetric de aproximativ 1 ml/min. În aceste cazuri, sistemul de reciclare asigură economii de până la 200-300 ml de solvent organic pe zi. Acest sistem economic permite utilizarea solvenților foarte puri și scumpi pentru analiză. Problema economisirii solvenților scumpi este mai puțin acută în cazul utilizării microcoloanelor (80x2, 100x2), deoarece separarea necesită un volum de ordin de mărime mai mic al fazei mobile.

4. Degazarea solvenților. Solvenții utilizați în cromatografie pentru prepararea fazelor mobile conțin de obicei aer dizolvat. Apa conține în special mult aer.

Când se lucrează cu eluanți nedegazați, bulele de aer intră în diferite componente ale sistemului lichid: pompă, coloană, capilare, detector. Când aerul intră într-un sistem lichid, pe cromatogramă apare un zgomot ridicat, periodic, din cauza fluctuațiilor de presiune din sistemul lichid. Acest lucru duce la o scădere bruscă a sensibilității analizei.

Pentru a elimina aerul din eluent, acesta este degazat. De regulă, numai eluanții pentru separările în fază inversă sunt degazați - deoarece amestecurile apos-organice conțin cantități semnificative de aer dizolvat. Degazarea trebuie efectuată cu deosebită atenție în cazul eluării cu gradient, precum și atunci când se utilizează detecția fluorimetrică.

În timpul eluției cu gradient într-un mod cu fază inversă, are loc amestecarea a doi eluanți - amestecuri apos-organice de compoziții diferite. Amestecarea eluanților nedegazați duce la eliberarea intensă de aer dizolvat, ceea ce este critic pentru determinarea în ansamblu (în cromatogramă, bulele de aer sunt înregistrate ca „emisii” ascuțite pe linia zero).

Sensibilitatea detectiei fluorimetrice scade cu un continut mare de aer dizolvat in faza mobila (se produce stingerea fluorescentei). Prin urmare, atunci când se utilizează detecția fluorimetrică, trebuie acordată o atenție deosebită degazării eluentului.

Există trei metode principale de degazare a fazelor mobile pentru cromatografia lichidă.

A. Degazare prin vid - eluentul este ținut într-un balon Claisen sub vidul unei pompe cu jet de apă timp de câteva minute. Când se efectuează degazarea, trebuie evitată fierberea eluentului.

b. Degazarea termică este utilizată pentru degazarea eluanților apo-organici cu o proporție mare de apă. Faza mobilă este plasată într-un balon, care nu este închis ermetic cu un dop, și lăsată într-o baie de apă la o temperatură de aproximativ 50°C. După 10-15 minute, balonul este sigilat cu un dop și răcit sub jet de apă la temperatura camerei.

V. Degazarea cu ultrasunete. Faza mobilă este tratată cu ultrasunete timp de câteva minute și apoi lăsată să se stabilească timp de 10-15 minute. Această metodă nu este adesea suficient de eficientă pentru degazarea eluanților apo-organici.

Sistemele moderne de pompare pentru cromatografie lichidă sunt echipate cu sisteme automate de degazare. Cu toate acestea, atunci când se efectuează analize de gradient, este mai bine să degazezi mai întâi ambele faze mobile și „manual”, folosind una dintre metodele date.

5. Filtrarea fazei mobile. Pentru a asigura funcționarea neîntreruptă a pompei, se recomandă filtrarea fazei mobile sub vid cu ajutorul unui filtru cu membrană.

6. Spălarea coloanei și a componentelor sistemului lichid. După lucrul cu faze mobile apos-organice care conțin săruri și acizi, întregul sistem lichid (inclusiv coloana) trebuie spălat cu apă distilată cu adăugarea de 5-10% solvent organic. Această spălare se face astfel încât în ​​timpul orelor de lucru componentele sistemului lichid cromatograf și faza staționară în sine să nu se uzeze suplimentar.

Neefectuarea unei astfel de spălări duce, în primul rând, la faptul că, după oprirea pompei, sărurile din eluant sunt depuse pe părțile sale și pe pereții cuvei detectorului. Aceasta, la rândul său, duce la funcționarea instabilă a dispozitivului în ansamblu, precum și la uzura prematură a părților mobile ale pompei. Eșecul regulat de spălare a sistemului de eluanți care conțin sare și acizi poate duce la o reducere a duratei de viață a fazei staționare.

Adăugarea unui solvent organic în apa de spălare este necesară pentru a preveni contaminarea biologică a sistemului de fluide.

7. Trecerea la o nouă fază mobilă care nu se amestecă cu cea anterioară. Această tranziție se realizează printr-un solvent intermediar care este miscibil la nesfârșit cu ambele faze mobile - de obicei prin izopropanol sau acetonă.

Pentru a trece de la un eluant apos la un eluant nepolar, sistemul lichid trebuie spălat cu apă cu adăugarea unui solvent organic, apoi îndepărtați coloana cromatografică, spălați sistemul cu izopropanol (acetonă), spălați sistemul cu un -eluent polar, și instalați o nouă coloană.

Pentru tranziția inversă, îndepărtați coloana cromatografică, spălați sistemul lichid cu izopropanol (acetonă), apoi cu un eluent apos, apoi instalați o nouă coloană.

Când treceți de la un eluant apos la unul nepolar, asigurați-vă în prealabil că materialul de etanșare al pompei este proiectat să funcționeze cu solvenți nepolari.

8. Filtrarea probei. Dacă proba analizată conține materie în suspensie nedizolvată, atunci este recomandabil să o filtrați prin trecerea probei printr-un filtru cu membrană conectat la o seringă. Din păcate, dacă proba este mică, mai mică de un mililitru, filtrarea în acest fel devine aproape imposibilă.

Atunci când se analizează în mod regulat probe care conțin materie în suspensie, filtrul de intrare pe coloană (frită) se poate înfunda, ceea ce va duce în primul rând la o creștere a presiunii în sistem. În acest caz, este mai bine să înlocuiți filtrul de admisie și, dacă nu există înlocuire, clătiți-l într-un solvent organic cu tratament cu ultrasunete timp de 10-15 minute.

Cea mai optimă soluție la problemă este utilizarea unui filtru în linie în fața coloanei. Filtrul în linie conține o frită înlocuibilă - la fel ca pe coloană. Înlocuirea fritei pe un filtru în linie este o operație de rutină care poate fi efectuată destul de des.

9. Aplicarea precoloanelor. Cu analiza regulată a probelor „murdare”, coloana cromatografică devine rapid murdară și își pierde capacitatea de separare. O alternativă bine-cunoscută la pregătirea atentă a probei în acest caz este utilizarea unei precoloane, care protejează coloana principală de contaminare.

Uneori este recomandabil să nu efectuați deloc pregătirea probei, ci să plasați un filtru în linie și o precoloană în linie în fața coloanei principale. Avantajele acestei scheme sunt simplitatea și rapiditatea analizei cu mai puțină muncă și reactivi.

10. Conservarea coloanelor cromatografice. Înainte de depozitarea pe termen lung, coloanele cromatografice sunt spălate și umplute cu un solvent destul de specific pentru fiecare tip de fază staționară.

Astfel, coloanele cromatografice pentru funcționarea în sisteme cu fază normală sunt de obicei umplute cu o hidrocarbură cu punct de fierbere ridicat, de exemplu, izooctan. Fazele inversate sunt spălate cu apă și umplute cu acetonitril sau la viteză mică de alimentare cu izopropanol. Fazele destinate lucrului cu soluții tampon apoase sunt umplute cu apă cu un mic adaos de azidă de sodiu (bacteriostatic).

În pașaportul acesteia pot fi indicate instrucțiuni pentru păstrarea coloanei.

11. Depozitarea tampoanelor de apă. În cazul determinărilor de rutină, este destul de convenabil să se pregătească imediat un volum mare de tampon apos pentru prepararea fazei mobile. Din păcate, tamponul apos nu poate fi păstrat mai mult de câteva zile decât dacă i se adaugă azidă de sodiu, un agent bacteriostatic. Fazele mobile pe bază de tampon fosfat sunt foarte prost stocate.

Uneori se prepară un volum mare de tampon apos pentru a „crește reproductibilitatea analizei”. În general, cu această abordare reproductibilitatea analizei nu crește, dar inevitabil apar probleme cu stocarea tampon.

În general, răspunsul la întrebare este dacă să pregătiți un tampon de apă pentru o săptămână sau pentru o zi? - determinată exclusiv de principiul confortului.

12. Regularitatea calibrării. De regulă, calibrarea față de standard se efectuează în fiecare zi sau de fiecare dată când se prepară un nou eluant.

Calibrarea se efectuează atunci când sistemul cromatografic atinge o stare de echilibru; Parametrii citibili sunt timpul de retenție al vârfului standard, aria acestuia (în cazul detecției spectrofotometrice - la lungimea de undă de referință), rapoartele spectrale (în cazul utilizării unui detector spectrofotometric cu scanare sau cu diode-array).

La începutul lucrării, standardul poate fi analizat de două ori pentru a confirma reproductibilitatea timpului de retenție.

1. Determinarea componentelor medicamentului „BICILLIN-3” prin HPLC

Bicilina-3 este o penicilină cu acțiune lungă și este un amestec de săruri de sodiu, novocaină și benzatină ale benzilpenicilinei (BP). Conform actualului VFS 42-3034-98, determinarea BP în medicament se realizează prin HPLC, novocaina este determinată spectrofotometric, iar benzatina (N,N1-dibenziletilendiamină) este extrasă cu eter dintr-o soluție apoasă saturată cu clorură de sodiu. . După evaporarea eterului, benzatina se determină prin titrare cu acid percloric.

În Farmacopeea Europeană, conținutul de BP și benzatină în sarea de benzatină a BP este determinat folosind HPLC în gradient într-un amestec de metanol cu ​​soluție de fosfat de sodiu la pH 3,5.

Scopul lucrării este de a dezvolta o metodă HPLC în mod izocratic pentru determinarea componentelor în bicilină-3.

partea experimentală

Am folosit bicilină-3 produsă de AKO Sintez (Kurgan). Studiul a fost realizat pe un cromatograf din Waters (SUA) cu o pompă model 510, un detector UV model 481 și un injector model 7125 (Rheodyne) cu o buclă de dozare cu o capacitate de 50 μl. Pentru detectare, a fost folosită o lungime de undă de 214 nm, la care toți compușii analizați sunt bine detectați. Înregistrarea cromatogramelor și calcularea zonelor de vârf și a parametrilor principali de retenție au fost efectuate folosind un computer personal cu un convertor analog-digital și programul Multichrome.

O versiune în fază inversă a metodei HPLC a fost studiată pe o coloană Luna C18 (2) care măsoară 250 x 4,6 mm de la Phenomenex (SUA), deoarece coloana se dovedise anterior a fi relativ ieftină, cu o simetrie îmbunătățită a producției de amine organice. culmi. În același scop, a fost utilizat ca fază mobilă un amestec de acetonitril cu o soluție tampon care conține trietilamină ca unul dintre componente și având un pH de 5,0.

Soluția inițială pentru prepararea fazei mobile este o soluție 2,5 M de acid fosforic, care a fost titrată cu trietilamină la pH 5,0. O soluţie tampon pentru HPLC a fost preparată prin diluarea soluţiei iniţiale cu apă de 10 ori, 750 ml din soluţia tampon rezultată au fost amestecate cu 250 ml acetonitril. În același timp, valoarea aparentă a pH-ului fazei mobile a crescut la 5,7. Viteza fazei mobile este de 1 ml/min. Cromatografia a fost efectuată la temperatura camerei. Timp de analiză 20 min.

Deoarece componentele incluse în medicament diferă în proprietățile acido-bazice - BP este un acid, iar novocaina și benzatina sunt baze, odată cu creșterea pH-ului, timpii lor de retenție în intervalul de pH, unde modificările ionizării lor se schimbă în direcții diferite. Prin urmare, prin modificarea pH-ului este ușor de selectat o reținere convenabilă a componentelor analizate. Cu toate acestea, o creștere a pH-ului duce la o deteriorare vizibilă a formei vârfului benzatinei, iar o scădere duce la o rezoluție insuficientă a novocainei și a produselor de hidroliză BP. Separarea componentelor bicilin-3 în condițiile de mai sus este prezentată în figură. Timpii de retenție ai novocainei, benzatinei și BP au fost de 4,2, 11,6 și, respectiv, 14,8 min.

Ceea ce este semnificativ este producția de vârf de novocaină între 2 vârfuri, care sunt produse ale hidrolizei BP. În acest sens, pentru o mai bună separare a componentelor, se recomandă adăugarea în faza mobilă a unor cantități mici de soluții 2,5 M de acid fosforic sau trietilamină și controlul separării prin cromatografie a unui amestec de novocaină și BP, a cărui soluție a fost depozitată. aproximativ o zi la temperatura camerei.

Pentru determinarea cantitativă, s-au adăugat 20-25 mg de bicilină-3 într-un balon cotat de 100 ml şi s-au dizolvat într-o soluţie apoasă 20% de acetonitril. Utilizarea metanolului sau a soluțiilor sale pentru dizolvare a condus la metilarea parțială a BP. O creștere a concentrației de acetonitril a dus la o lărgire a vârfului de novocaină. Limita superioară a concentrației medicamentului este limitată de solubilitatea acestuia. Curbele de calibrare pentru BP și benzatină au fost obținute folosind sarea de sodiu a BP și diacetatul de benzatină după o conversie corespunzătoare. Graficul de calibrare pentru BP este liniar în regiunea 0,1-0,5 mg/ml, pentru benzatină și novocaină - în regiunea 0,01-0,05 mg/ml. Rezultatele determinării componentelor în 5 serii ale medicamentului sunt prezentate în Tabelul 1, unde fiecare valoare este media a 5 determinări. Abaterea standard relativă a fost de 1,6% pentru novocaină, 3,4% pentru benzatină și 1,4% pentru BP.

Din Tabelul 1 rezultă că rezultatele determinării cantitative folosind HPLC se încadrează în limitele permise reglementate de ND.

Pentru a confirma corectitudinea metodei propuse, componentele bicilinei-3 au fost analizate în amestecuri model preparate prin amestecarea sării de sodiu a BP, diacetat de benzatină și novocaină. Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 2. Rezultatele au fost recalculate la componentele originale.

Fiecare valoare din coloana „Găsit” din Tabelul 2 este rezultatul mediu a 3 determinări. Abaterea relativă medie a fost de 2,2% pentru benzatină, 0,9% pentru novocaină și 0,8% pentru BP, ceea ce se corelează cu abaterile standard medii relative găsite la analiza componentelor din probe reale. Pentru benzatină, împrăștierea rezultatelor este puțin mai mare decât pentru alte componente, ceea ce se explică prin înălțimea scăzută și forma neregulată a vârfului și, în consecință, o eroare de integrare mai mare. Un alt motiv pentru erori relativ mari în determinarea benzatinei poate fi efectul memoriei injectorului la analiza substanțelor foarte adsorbite. Cu toate acestea, chiar și o astfel de împrăștiere, puțin mai mare decât cea acceptată pentru analizele folosind metoda HPLC, este destul de acceptabilă pentru determinarea benzatinei.

concluzii

1. A fost elaborată o metodă pentru detectarea și determinarea cantitativă a componentelor din preparatul „Bicilin-3”.

2. Metoda a fost testată pe un număr de loturi de medicament și confirmată prin analiza amestecurilor model de compoziție cunoscută.

2. HPLC în analiza medicamentelor care conțin propifenazonă

Propifenazona (4-izopropil-2,3-dimetil-1-fenil-3-pirazolin-5-onă; izopropilantipirină) este un analgezic non-narcotic din seria pirazolone și face parte din combinații de medicamente fără prescripție medicală. În prezent, tabletele de cafetină (compoziție: propifenazonă - 0,21 g, paracetamol - 0,25 g, cofeină - 0,05 g, fosfat de codeină - 0,01 g) și saridon (paracetamol - 0,25 g) sunt utilizate pe scară largă în practica medicală. g, propifenazonă - 0,15 g. cofeină - 0,05 g). Conform documentației de reglementare existente, cromatografia într-un strat subțire de sorbent este utilizată pentru a confirma autenticitatea tabletelor de cafetină. Se propune ca determinarea cantitativă să fie efectuată în porțiuni separate ale medicamentului folosind diferite metode pentru fiecare componentă: folosind spectrofotometrie, titrimetrie, o combinație de cromatografie în strat subțire și spectrofotometrie. În documentația de reglementare pentru saridon, paracetamol, cofeina și propifenazonă sunt determinate prin HPLC pe coloane lungi de 12,5 cm cu sorbent Merck Lichrospher C18 și o fază mobilă a compoziției: metanol-acid fosforic 0,01 M într-un raport de 30: 70.

Scopul acestei lucrări este de a dezvolta metode pentru detectarea și determinarea cantitativă a componentelor tabletelor de cafetină și saridon folosind HPLC.

Lucrarea a folosit tablete de cafetină produse de Alkaloid Skopje (Republica Macedonia), saridon produs de Laboratoarele Roche Nicholas S.A., Gaillard (Franța) și substanțele componentelor incluse în compoziția acestora. Studiul a fost realizat pe un cromatograf lichid cu microcoloană domestică „Milichrome-4” cu un detector spectrofotometric UV, o coloană de 8 cm lungime cu sorbent Separon-C18 în fază inversă ca fază staționară. Natura polară a compușilor analizați și solubilitatea lor bună în apă și acetonitril au determinat alegerea amestecurilor apă-acetonitril în diferite rapoarte ca fază mobilă. S-au testat fazele mobile: acetonitril - apă în raporturi 9:1; 7:3; 6:4; 8:2 şi acetonitril-apă-dietilamină (3:2:0,2). Utilizarea fazelor mobile cu o fracțiune de volum de solvent organic care depășește 80% a fost evitată pentru a exclude interacțiunile de fază normală, care complică controlul suplimentar al compoziției fazei mobile. O fracție de volum de solvent mai mică de 5% duce la instabilitate funcțională a fazei mobile și timpi de retenție ireproductivi. Introducerea dietilaminei în faza mobilă ca modificator a făcut posibilă separarea tuturor celor 4 componente ale tabletelor de cafetină. Se știe că pe suprafața gelului de silice octadecil există o cantitate semnificativă de grupări silanol reziduale capabile să interacționeze cu schimbul de ioni. Dietilamina elimină grupările silanol din procesul cromatografic, îmbunătățește forma vârfului, reduce timpul de analiză și ajustează pH-ul pe suprafața gelului de silice. Măsurarea a fost efectuată în următoarele condiții: scară de înregistrare 2,0, timp de retenție 0,8 s, debit de eluant 50 μL/min, volum de injectare 3 μL. Detectarea vârfurilor a fost efectuată la 2 lungimi de undă - 238 și 276 nm.

Identificarea s-a efectuat în funcție de parametrii de retenție, care au fost determinați anterior folosind soluții standard ale substanțelor studiate.

Componentele tabletelor de cafetină sunt separate folosind faza mobilă acetonitril-apă-dietilamină (3:2,2:0,2). Timpul de retenție pentru paracetamol a fost de 3,08 minute, propifenazonă - 5,73 minute, cofeină - 4,0 minute, codeină - 4,67 minute.

Componentele saridonului pot fi de asemenea separate folosind o fază mobilă de acetonitril-apă (8:2). Timp de retenție pentru paracetamol - 3,9 minute, propifenazonă - 5,11 minute, cofeină - 4,44 minute.

Pentru determinarea cantitativă a fost utilizată metoda de calibrare absolută. O relație direct proporțională între concentrația substanței și înălțimea vârfului a fost observată pentru paracetamol în intervalul 50-200 µg/ml, pentru propifenazonă - 25-128 µg/ml, cofeină - 20-50 µg/ml, codeină - 59-234 pg/ml.

Metoda HPLC are unele limitări în analiza amestecurilor complexe. Odată cu prezența simultană a substanțelor în macro și microcantități în amestec, coloana este supraîncărcată, ceea ce afectează calitatea separării și forma vârfurilor emergente. În cafetină, conținutul de codeină fosfat în raport cu paracetamol și propifenazonă este de 21-25 de ori mai mic, așa că se recomandă extracția lichidă pentru a separa codeina de restul componentelor tabletelor. Am stabilit anterior că paracetamolul, propifenazona și cofeina sunt extrase în timpul unei singure extracții cu acetat de etil din soluții apoase la pH 2,0 în cantități de 87,43, 87,29 și, respectiv, 87,84%, iar codeina rămâne complet în soluția apoasă și pentru extracția acesteia și concentrație este necesar să se folosească cloroform la pH 9,0-10,0.

Metodă de determinare cantitativă a paracetamolului, propifenazonei și cofeinei în tablete de saridon și cafetină 20 de tablete se măcina într-un mojar într-o pulbere fină omogenă, se cântăresc aproximativ 0,01 g (cântărit exact) din pulbere de tabletă măcinată și se pun într-un 25 ml. balon cotat se adauga 10 ml acetonitril si se amesteca bine.

Conținutul balonului este adus la semn cu acetonitril, amestecat și filtrat. Soluția este injectată în coloana cromatografului într-un volum de 3,0 μl. Conținutul de paracetamol, propifenazonă și cofeină este determinat prin metoda de calibrare absolută. Rezultatele determinării sunt date în Tabelele 1 și 2, din care reiese clar că datele obținute se încadrează în limitele de conținut admisibile conform documentației de reglementare (ND).

Metodă de determinare cantitativă a fosfatului de codeină în tablete de cafetină. Aproximativ 0,2 g tablete zdrobite (cântărite exact) se dizolvă în 20 ml apă, se amestecă bine până se obține o soluție omogenă, se filtrează printr-un filtru pentru sedimente fine și foarte fine, filtrul se spală cu 10 ml apă purificată. Soluția este acidulată cu o soluție de acid sulfuric 10% la pH 2,0. Se extrage de trei ori cu acetat de etil în porții de 10 ml. Extractele sunt aruncate. O soluție de amoniac 25% este adăugată la soluția apoasă la pH 9,0-10,0. Se extrage de trei ori cu cloroform în porții de 10 ml. Extractele de cloroform combinate sunt plasate în cupe de porțelan și evaporate la temperatura camerei. Reziduurile uscate se dizolvă în acetonitril, se transferă într-un balon cotat de 25 ml și se diluează până la semn cu același solvent, se introduc 3 μl din soluția rezultată într-o coloană cromatograf și se determină codeina în condițiile descrise. Rezultatele determinării sunt prezentate în tabelul 3.

Pentru a evalua acuratețea metodelor propuse și a verifica reproductibilitatea rezultatelor, au fost pregătite și studiate amestecuri model. Datele bazate pe exemplul comprimatelor de saridon sunt date în Tabelul 4. După cum se poate observa din Tabelul 4, eroarea relativă de determinare nu depășește ±1,19% pentru paracetamol, ±1,16% pentru propifenazonă și ±1,63% pentru cofeină.

Metodă de determinare cantitativă a componentelor tabletelor de saridon în amestecuri model. Se cântăresc porții precise de paracetamol (aproximativ 0,08 g), propifenazonă (aproximativ 0,05 g) și cofeină (aproximativ 0,016 g), se transferă într-un balon cotat de 50 ml, se dizolvă într-un volum mic de acetonitril și se completează până la semn cu același solvent. Se ia o alicotă de 2,5 ml și se transferă într-un balon cotat de 25 ml, se ajustează volumul la semn cu același solvent, se amestecă și se filtrează. Soluția se injectează în coloana cromatografului într-un volum de 3 μl.

concluzii

1. A fost dezvoltată o metodă pentru detectarea componentelor tabletelor de cafetină și saridon folosind HPLC.

Timpul de retenție pentru paracetamol a fost de 3,08 minute, pentru propifenazonă - 5,73 minute, cofeină - 4 minute și codeină - 4,67 minute.

2. A fost propusă o metodă HPLC pentru determinarea cantitativă a componentelor tabletelor de cafetină și saridon.

Eroarea relativă de determinare a fost ±1,19-1,21% pentru paracetamol, ±1,16-1,71% pentru propifenazonă, ±1,22-1,63% pentru cofeină și ±2,95% pentru codeină.

3. Standardizarea medicamentului "Adanol"

Compania farmaceutică Polisan a dezvoltat o serie de medicamente complexe cu efecte metabolice care stimulează procesele metabolice din creier, inclusiv Citoflavina (injecții, tablete) și Adanol. „Adanol” are proprietăți pronunțate antihipoxice și anti-ischemice și este un medicament promițător pentru tratamentul pacienților cu consecințele accidentului vascular cerebral. Este o formă de dozare de tabletă acoperită cu un înveliș enteric.

Conține acid succinic (SA), piracetam (Pc), riboxină (Rb), nicotinamidă (NA), clorhidrat de piridoxină (PG), mononucleotidă de riboflavină (RF).

Scopul lucrării este de a dezvolta o metodă pentru determinarea calitativă și cantitativă a UC în amestecuri complexe multicomponente folosind exemplul medicamentului "Adanol".

Lucrarea a folosit un cromatograf lichid de înaltă presiune de la Shimadzu (Japonia) cu un detector UV și o coloană Hypersil BDS C18 de la Supelco Inc. granulație 5 microni, lungime 250 mm cu diametru interior 4,6 mm. Faza mobilă este o fază apos-organică pe bază de tampon fosfat (pH 2,6-7,0). Lungime de undă de detectare 206 nm. Mod de analiză izocratic, viteza de eluare 500 ul/min; volumul probei 20 µl. Spectrele UV au fost înregistrate pe un spectrofotometru UV mini-1240 de la Shimadzu.

Pentru determinarea cantitativă a majorității substanțelor incluse în medicament s-au propus metode spectrofotometrice de analiză. Cu toate acestea, o comparație a caracteristicilor spectrale ale componentelor medicamentului a arătat că regiunile de absorbție ale YAK, PG, NA, Pb și Pc din zona UV se suprapun reciproc (Fig. 1).

În acest sens, conținutul lor în amestec nu poate fi determinat prin spectrofotometrie directă și în acest caz este recomandabil să se folosească metoda HPLC. Doar RF are o regiune specifică de absorbție mai mare de 350 nm (lmax=373, E1% 1cm=202 și lmax=445 nm, E1% 1cm=243), de aceea a fost propusă o analiză calitativă și cantitativă prin metoda spectrofotometrică.

Pe baza datelor obținute s-a selectat lungimea de undă optimă de lucru pentru analiza a 5 substanțe, componenta lopt = 206 nm (vezi Fig. 1). Această valoare este maximul spectrului UV al UC, care are cea mai scăzută absorbție specifică (lmax = 206 nm E1% 1cm = 5,8) în comparație cu celelalte componente ale amestecului (vezi tabel).

Deoarece toate substanțele incluse în preparat sunt ionice, este recomandabil să se folosească cromatografia în fază inversă pentru analiza lor utilizând faze staționare nepolare și faze mobile polare. În cromatografia în fază inversă a compușilor ionici, valoarea pH-ului este unul dintre factorii care afectează semnificativ eficiența separării substanțelor individuale. Când se lucrează cu adsorbanți moderni cu fază inversă, soluțiile tampon cu pH cuprins între 2,0 și 8,0 sunt de obicei utilizate în faza mobilă. Deoarece lungimea de undă optimă selectată este de 206 nm, cel mai bine este să utilizați un tampon fosfat, deoarece nu are o poziție în domeniul lungimii de undă UV mai mare de 200 nm.

Pentru a studia comportamentul UC la diferite valori ale pH-ului, spectrele sale au fost înregistrate în soluții tampon fosfat pH 7,0 și 2,6 (Fig. 2). La pH 2,6 se observă un efect hipocromic al formei moleculare a UC - absorbția scade de 3 ori față de spectrul la pH 7,0 (la această valoare a pH-ului, disocierea UC este complet suprimată). Ținând cont de acest lucru, valoarea optimă a pH-ului fazei mobile este 7,0. În continuare, a fost studiată influența compoziției și pH-ului fazei mobile asupra eficienței separării componentelor medicamentului. La pH 2,6, nu a existat o separare completă a amestecului în vârfuri individuale - PC, Na și PG nu sunt împărțite și ies mai întâi ca un vârf, urmat de YaK și Pb sub formă de vârfuri individuale. La pH 5,5 nu a existat nicio separare completă a componentelor. La pH 7,0, a avut loc separarea completă a componentelor amestecului. Toate substanțele au apărut sub formă de vârfuri separate în următoarea secvență: YAK, Pc, PG, NA și Pb. Cu toate acestea, procesul de separare este lung - 45-50 de minute.

Pentru a asigura o forță de eluare mai mare a fazei mobile și pentru a accelera procesul de separare, este necesar să se introducă în compoziția sa un solvent organic mai puțin polar. Dintre solvenții cei mai des utilizați ca eluanți în HPLC, în funcție de limita de transparență în lumina UV la lungimea de undă de lucru selectată (lopt = 206 nm), am putea folosi acetonitril și metanol, ale căror limite de transparență sunt 195, respectiv 205 nm.

Când 2% metanol a fost introdus în faza mobilă, timpul de proces a fost redus, dar vârful NA a avut o asimetrie mare și vârful Pb se suprapune pe coada vârfului NA. După reducerea concentrației de metanol la 1%, vârfurile Pb și NA nu s-au suprapus, dar asimetria vârfului NA a crescut. Pentru a-l reduce, în faza mobilă a fost introdus acetonitril care conține 1% metanol.

În urma experimentelor, a fost selectată o fază mobilă - o fază apos-organică constând dintr-un tampon fosfat pH 7,0 care conține 1% metanol și 0,5% acetonitril, care a asigurat separarea eficientă a tuturor celor 5 componente (Fig. 3). Timpul total de cromatografie în acest sistem a fost de 35 de minute, iar timpii de retenție ai componentelor au fost de aproximativ (în minute): YA - 5,3, Ps - 15, PG - 19,3, NA - 26, Rb - 31.

Determinarea cantitativă a fost efectuată prin metoda standard extern folosind soluții de probe standard de componente individuale.

Caracteristicile metrologice ale metodei de determinare cantitativă propusă au fost studiate folosind amestecuri model în 5 replici și sunt prezentate în tabel.

După cum urmează din tabel, folosind metoda dezvoltată în medicamentul "Adanol" este posibil să se determine toate cele 5 componente cu o eroare relativă de cel mult 3%, cu o probabilitate de încredere de 95%.

Pe lângă vârfurile componentelor principale ale medicamentului, cromatograma obținută în condițiile descrise mai sus identifică vârfuri de hipoxantină și acid nicotinic, prezente în substanțele originale, precum și cele formate în timpul hidrolizei din Pb și respectiv NA. Astfel, metoda dezvoltată ne permite să determinăm calitativ și cantitativ aceste impurități străine din preparat.

concluzii

1. S-au determinat condițiile optime pentru analiza cantitativă a acidului succinic prin metoda HPLC într-un amestec multicomponent.

2. A fost dezvoltată o metodă pentru analiza calitativă și cantitativă a componentelor medicamentului "Adanol", inclusiv a impurităților, cu o eroare relativă de determinare de cel mult 3%.

Lista literaturii folosite

1. M.A. Kazmin, A.V. Mihailev, A.P. Arzamastsev „Determinarea componentelor medicamentului „BICILLIN-3” prin HPLC” // Farmacie - Nr. 5 - 2002 - p. 5-6.

2. T.H. Vergeichik, N.S. Onegova „HPLC în analiza medicamentelor care conțin propifenazonă” // Farmacia - Nr. 6 - 2002 - pp. 13-16.

3. A.Yu. Petrov, S.A. Dmitrichenko, A.L. Kovalenko, L.E. Alekseeva „Standardizarea medicamentului „Adanol” // Farmacie - nr. 5 - 2002 - pp. 11-13.

Adiţional

1. Baram G.I., Fedorova G.A. // Aplicarea cromatografiei în industria alimentară, microbiologică și medicală: Mat. Toate Conf. - Gelendzhik, 1990 - p. 43-44.

2. Krichkovskaya L.V., Chernenkaya L.A. // Aplicarea cromatografiei în industria alimentară, microbiologică și medicală: Mat. Toate Conf. - Gelendzhik, 8-12 octombrie 1990, M., 1990. - P.49.

3. Cromatografia: Aplicarea practică a metodei: În 2 părți. Partea 2 - M.: Mir, 1986. - 422 p.

ARTICOL FARMACOPEIAN GENERAL

În loc de art. GF XI

Cromatografia lichidă de înaltă performanță (cromatografia lichidă de înaltă presiune) este o metodă de cromatografie pe coloană în care faza mobilă este un lichid care se deplasează printr-o coloană de cromatografie umplută cu o fază staționară (sorbant). Coloanele pentru cromatografie lichidă de înaltă performanță se caracterizează prin rezistență hidraulică ridicată la intrare.

În funcție de mecanismul de separare a substanțelor, se disting următoarele variante de cromatografie lichidă de înaltă performanță: adsorbție, partiție, schimb ionic, excludere, chiral etc., în funcție de natura principalelor interacțiuni intermoleculare care apar. În cromatografia de adsorbție, separarea substanțelor are loc datorită abilităților lor diferite de a fi adsorbite și desorbite de pe suprafața unui sorbant cu o suprafață dezvoltată, de exemplu, silicagel. În cromatografia lichidă de înaltă performanță de partiție, separarea are loc datorită diferenței de coeficienți de distribuție a substanțelor care sunt separate între faza staționară (de obicei grefată chimic pe suprafața unui purtător staționar) și faza mobilă.

În funcție de tipul de fază mobilă și staționară, se disting cromatografia în fază normală și cea inversă. În cromatografia lichidă de înaltă performanță în fază normală, faza staționară este polară (cel mai adesea silicagel sau silicagel cu grupări NH2 sau CN grefate etc.), iar faza mobilă este nepolară (hexan sau amestecuri de hexan). cu solvenți organici mai polari - cloroform, alcooli etc.). Retenția substanțelor crește odată cu creșterea polarității. În cromatografia în fază normală, capacitatea de eluare a fazei mobile crește odată cu creșterea polarității.

În cromatografia în fază inversă, faza staționară este nepolară (silicageluri hidrofobe cu grupări grefate C4, C8, C18 etc.); fază mobilă – polară (amestecuri de apă și solvenți polari: acetonitril, metanol, tetrahidrofuran etc.). Retenția substanțelor crește odată cu creșterea hidrofobicității (nonpolarității). Cu cât este mai mare conținutul de solvent organic, cu atât este mai mare capacitatea de eluare a fazei mobile.

În cromatografia cu schimb de ioni, moleculele unui amestec de substanțe, disociate în soluție în cationi și anioni, sunt separate la trecerea printr-un sorbent (schimbător de cationi sau schimbător de anioni) datorită puterii diferite de interacțiune a ionilor determinați cu grupările ionice. a sorbantului.

În cromatografia de excludere a mărimii (sită, permeație în gel, filtrare pe gel), moleculele de substanțe sunt separate după dimensiune datorită capacității lor diferite de a pătrunde în porii fazei staționare. În acest caz, cele mai mari molecule care sunt capabile să pătrundă în numărul minim de pori ai fazei staționare sunt primele care părăsesc coloana, iar substanțele cu dimensiuni moleculare mici sunt ultimele care părăsesc.

Cromatografia chirală separă compușii optic activi în enantiomeri individuali. Separarea poate fi efectuată pe faze staționare chirale sau pe faze staționare achirale folosind faze mobile chirale.

Există și alte opțiuni pentru cromatografia lichidă de înaltă performanță.

adesea separarea are loc nu printr-un singur mecanism, ci prin mai multe mecanisme simultan, în funcție de tipul fazelor mobile și staționare, precum și de natura compusului care se determină.

Zona de aplicare

Cromatografia lichidă de înaltă performanță a fost utilizată cu succes atât pentru analiza calitativă, cât și cantitativă a medicamentelor în testele „Identitate”, „Impurități străine”, „Dizolvare”, „Uniformitate de dozare”, „Determinare cantitativă”. Trebuie remarcat faptul că cromatografia vă permite să combinați mai multe teste într-o singură probă, inclusiv „Autenticitate” și „Determinare cantitativă”.

Echipamente

Pentru efectuarea analizei se folosesc instrumente adecvate - cromatografe lichide.

Un cromatograf lichid include de obicei următoarele componente principale:

— unitate de preparare a fazei mobile, inclusiv un recipient cu faza mobilă (sau containere cu solvenți individuali incluși în faza mobilă) și un sistem de degazare în fază mobilă;

- sistem de pompare;

— mixer de fază mobilă (dacă este necesar);

— sistem de introducere a probei (injector), poate fi manual sau automat (autosampler);

— coloană cromatografică (poate fi instalată într-un termostat);

— detector (unul sau mai multe cu metode diferite de detectare);

— sistemul de control al cromatografului, colectarea și prelucrarea datelor.

În plus, cromatograful poate include: un sistem de preparare a probei și un reactor pre-coloană, un sistem de comutare a coloanei, un reactor post-coloană și alte echipamente.

Sistem de pompare

Pompele furnizează faza mobilă coloanei la o viteză dată. Compoziția fazei mobile și debitul pot fi constante sau variate în timpul analizei. În cazul unei compoziții constante a fazei mobile, procesul se numește izocratic, iar în al doilea - gradient. Un sistem modern de pompare cu cromatograf lichid constă dintr-una sau mai multe pompe controlate de computer. Acest lucru vă permite să modificați compoziția fazei mobile în funcție de un program specific în timpul eluției cu gradient. Pompele pentru cromatografie lichidă analitică de înaltă performanță vă permit să mențineți debitul fazei mobile în coloană în intervalul de la 0,1 la 10 ml/min la o presiune la intrarea coloanei de până la 40 MPa. Pulsațiile de presiune sunt reduse la minimum prin sisteme speciale de amortizoare incluse în proiectarea pompelor. Părțile de lucru ale pompelor sunt realizate din materiale rezistente la coroziune, ceea ce permite utilizarea componentelor agresive în faza mobilă.

robinete

În mixer, se formează o singură fază mobilă din solvenți individuali furnizați de pompe, dacă amestecul necesar nu a fost pregătit în prealabil. Amestecarea componentelor fazei mobile în mixer poate avea loc atât la presiune joasă (înaintea pompelor), cât și la presiune înaltă (după pompe). Mixerul poate fi utilizat pentru prepararea fazei mobile și eluarea izocratică.

Volumul mixerului poate afecta timpul de retenție al componentelor în timpul eluției cu gradient.

Injectoare

Injectoarele pot fi universale, cu capacitatea de a modifica volumul probei injectate, sau discrete pentru injectarea doar a unui anumit volum de probă. Ambele tipuri de injectoare pot fi automate ("autoinjectoare" sau "autosamplere"). Injectorul pentru introducerea probei (soluție) este situat direct în fața coloanei cromatografice. Designul injectorului vă permite să schimbați direcția de curgere a fazei mobile și să efectuați introducerea preliminară a probei într-o buclă de dozare cu un anumit volum (de obicei de la 10 la 100 μl) sau într-un dispozitiv special de dozare cu volum variabil. . Volumul buclei este indicat pe marcajul acesteia. Designul discret al injectorului permite de obicei înlocuirea buclei. Injectoarele automate moderne pot avea o serie de funcții suplimentare, de exemplu, îndeplinesc funcția unei stații de pregătire a probelor: amestecați și diluați probele, efectuează o reacție de derivatizare pre-coloană.

Coloană cromatografică

Coloanele cromatografice sunt de obicei tuburi din oțel inoxidabil, sticlă sau plastic, umplute cu sorbant și închise pe ambele părți cu filtre cu un diametru al porilor de 2-5 µm. Lungimea coloanei analitice poate fi în intervalul de la 5 la 60 cm sau mai mult, diametrul intern poate fi de la 2 la 10 mm. În cromatografia pe microcoloană se folosesc coloane cu un diametru interior mai mic de 2 mm. Există și coloane capilare cu un diametru interior de aproximativ 0,3–0,7 mm. Coloanele pentru cromatografia preparativă pot avea un diametru interior de 50 mm sau mai mult.

Coloane scurte (precoloane) pot fi instalate în fața coloanei analitice pentru a îndeplini diverse funcții auxiliare, principala fiind protejarea coloanei analitice. De obicei, analiza este efectuată la temperatura camerei, dar pentru a crește eficiența separării și a reduce timpul de analiză, termostatarea coloanei poate fi utilizată la temperaturi de până la 80 - 100 °C. Posibilitatea de a folosi temperaturi ridicate în timpul separării este limitată de stabilitatea fazei staționare, deoarece distrugerea acesteia este posibilă la temperaturi ridicate.

Faza staționară (sorbant)

Următoarele sunt de obicei utilizate ca absorbanți:

• silicagel, oxid de aluminiu, utilizat în cromatografia în fază normală. Mecanismul de retenție în acest caz este de obicei adsorbția;
• silicagel, rășini sau polimeri grefați cu grupări acide sau bazice. Domeniul de aplicare – schimb de ioni și cromatografia ionică;
• silicagel sau polimeri cu o distribuție specificată a mărimii porilor (cromatografia de excludere a mărimii);
• sorbenti modificati chimic (sorbenti cu faze altoite), cel mai adesea preparati pe baza de silicagel. Mecanismul de retenție este adsorbția sau distribuția între fazele mobile și staționare. Domeniul de aplicare depinde de tipul grupelor funcționale altoite. Unele tipuri de adsorbanți pot fi utilizați atât în ​​cromatografia în fază inversă, cât și în cea normală;
• adsorbanți chirali modificați chimic, de exemplu, derivați de celuloză și amiloză, proteine ​​și peptide, ciclodextrine, chitozani, utilizați pentru separarea enantiomerilor (cromatografie chirală).

Sorbenții cu faze altoite pot avea diferite grade de modificare chimică. Cele mai frecvent utilizate faze de altoit sunt:

– grupări octadecil (octadecilsilan absorbant (ODS) sau C 18);

– grupări octile (sorbent octilsilan sau C8);

– grupări fenil (sorbent fenilsilan);

– grupări cianopropil (sorbent CN);

– grupări aminopropil (sorbent NH 2);

– grupări diol (diol absorbant).

Cel mai adesea, analiza este efectuată pe faze grefate nepolare într-un mod de fază inversă folosind un sorbent C18.

Sorbenții cu faze grefate obținuți pe bază de silicagel sunt stabili din punct de vedere chimic la valori ale pH-ului de la 2,0 la 7,0, dacă nu se specifică altfel de către producător. Particulele absorbante pot avea forme sferice sau neregulate și porozitate variată. Dimensiunea particulelor sorbantului în cromatografia lichidă analitică de înaltă performanță este de obicei de 3–10 µm, în cromatografia lichidă preparativă de înaltă performanță – 50 µm sau mai mult. Există și coloane monolitice în care adsorbantul este un monolit cu pori traversați care umple întregul volum al coloanei.

Eficiența ridicată a separării este asigurată de suprafața mare a particulelor de absorbant (care este o consecință a dimensiunii lor microscopice și a prezenței porilor), precum și de compoziția uniformă a sorbantului și de ambalarea sa densă și uniformă.

Detectoare

Cromatografia lichidă de înaltă performanță utilizează o varietate de metode de detectare. În cazul general, faza mobilă cu componente dizolvate în ea după ce coloana cromatografică intră în celula detector, unde se măsoară continuu una sau alta dintre proprietățile acesteia (absorbție în regiunea ultravioletă sau vizibilă a spectrului, fluorescență, indice de refracție, electricitate). conductivitate etc.). Cromatograma rezultată este un grafic al dependenței unui parametru fizic sau fizico-chimic al fazei mobile în timp.

Cele mai comune detectoare în cromatografia lichidă de înaltă performanță sunt spectrofotometrice. În timpul eluării substanțelor, densitatea optică a eluatului este măsurată într-o microcuvetă special concepută la o lungime de undă preselectată. Gama largă de liniaritate a detectorului permite analiza atât a impurităților, cât și a principalelor componente ale amestecului într-o singură cromatogramă. Un detector spectrofotometric permite detectarea la orice lungime de undă din domeniul său de funcționare (de obicei 190-600 nm). De asemenea, sunt utilizați detectoare multiundă, care permit detectarea la mai multe lungimi de undă simultan, și detectoare cu matrice de diode, permițând înregistrarea simultană a densității optice pe întregul interval de lungimi de undă de funcționare (de obicei 190-950 nm). Acest lucru face posibilă înregistrarea spectrelor de absorbție ale componentelor care trec prin celula detector.

Un detector fluorimetric este utilizat pentru a determina compuși fluorescenți sau compuși nefluorescenți sub forma derivaților lor fluorescenți. Principiul de funcționare al unui detector fluorimetric se bazează pe măsurarea emisiei fluorescente de lumină absorbită. Absorbția se realizează de obicei în regiunea ultravioletă a spectrului, lungimile de undă ale radiației fluorescente depășind lungimile de undă ale luminii absorbite. Detectoarele fluorimetrice au sensibilitate și selectivitate foarte ridicate. Sensibilitatea detectorilor cu fluorescență este de aproximativ 1000 de ori mai mare decât sensibilitatea celor spectrofotometrice. Detectoarele fluorescente moderne fac posibilă nu numai obținerea de cromatograme, ci și înregistrarea spectrelor de excitație și fluorescență ale compușilor analizați.

Pentru a determina compușii care absorb slab în regiunile ultraviolete și vizibile ale spectrului (de exemplu, carbohidrați), utilizați refractometric detectoare (refractometre). Dezavantajele acestor detectoare sunt sensibilitatea lor scăzută (comparativ cu detectoarele spectrofotometrice) și dependența semnificativă de temperatură a intensității semnalului (detectorul trebuie să fie termostatat), precum și imposibilitatea utilizării lor în modul de eluare cu gradient.

Principiul de funcționare detectoare de împrăștiere a luminii cu laser evaporativ se bazează pe diferența de presiune a vaporilor a solvenților cromatografici incluși în faza mobilă și a substanțelor analizate. Faza mobilă la ieșirea coloanei este introdusă în atomizor, amestecată cu azot sau CO 2 și, sub formă de aerosol fin, intră într-un tub de evaporare încălzit cu temperatura de 30–160 °C, în care mobilul faza se evaporă. Un aerosol de particule nevolatile din substanțele analizate împrăștie fluxul de lumină în camera de dispersie. După gradul de dispersie a fluxului luminos, se poate aprecia cantitatea de compus determinată. Detectorul este mai sensibil decât unul refractometric; semnalul său nu depinde de proprietățile optice ale probei, de tipul de grupe funcționale din substanțele care se determină, de compoziția fazei mobile și poate fi utilizat în gradient. modul de eluare.

Detectoare electrochimice (conductometrice, amperometrice, coulometrice etc.). Un detector amperometric este utilizat pentru a detecta compuși electroactivi care pot fi oxidați sau redusi pe suprafața unui electrod solid. Semnalul analitic este mărimea curentului de oxidare sau reducere. Celula detector are cel puțin doi electrozi - un electrod de lucru și un electrod de referință (clorură de argint sau oțel). Electrozilor se aplică un potențial de lucru, a cărui valoare depinde de natura compușilor determinați. Măsurătorile pot fi efectuate atât la un potențial constant, cât și în modul pulsat, atunci când profilul modificărilor potențialului electrodului de lucru este setat în timpul unui ciclu de înregistrare a semnalului. Un detector amperometric folosește electrozi de lucru din materiale carbonice (cel mai adesea carbon sticlos sau grafit) și din metal: platină, aur, cupru, nichel.

Un detector conductometric este utilizat pentru a detecta anioni și cationi în cromatografia ionică. Principiul funcționării sale se bazează pe măsurarea conductivității electrice a fazei mobile în timpul eluției substanței.

Un detector spectrometric de masă, care are sensibilitate și selectivitate ridicate, este extrem de informativ. Cele mai recente modele de spectrometre de masă pentru cromatografie lichidă funcționează în intervalul de masă m/z de la 20 la 4000 amu.

În cromatografia lichidă de înaltă performanță se folosesc și detectoare Fourier-IR, radioactivitate și altele.

Sistem de colectare și prelucrare a datelor

Un sistem modern de procesare a datelor este un computer personal interfațat cu un cromatograf cu software instalat care vă permite să înregistrați și să procesați o cromatogramă, precum și să controlați funcționarea cromatografului și să monitorizați principalii parametri ai sistemului cromatografic.

Faza mobila

Faza mobilă în cromatografia lichidă de înaltă performanță îndeplinește o dublă funcție: asigură transportul moleculelor desorbite de-a lungul coloanei și reglează constantele de echilibru și, în consecință, reținerea ca urmare a interacțiunii cu faza staționară (sorbită la suprafață) iar cu moleculele substanţelor fiind separate. Astfel, prin modificarea compoziției fazei mobile în cromatografia lichidă de înaltă performanță, se poate influența timpii de retenție ai compușilor, selectivitatea și eficiența separării acestora.

Faza mobilă poate consta dintr-un solvent, adesea doi și, dacă este necesar, trei sau mai mulți. Compoziția fazei mobile este indicată ca raport de volum al solvenților ei constituenți. În unele cazuri, poate fi indicat raportul de masă, care trebuie precizat în mod specific. Ca componente ale fazei mobile pot fi utilizate soluții tampon cu o anumită valoare a pH-ului, diverse săruri, acizi și baze și alți modificatori.

Cromatografia în fază normală folosește de obicei hidrocarburi lichide (hexan, ciclohexan, heptan) și alți solvenți relativ nepolari cu adaosuri mici de compuși organici polari care reglează forța de eluție a fazei mobile.

În cromatografia cu fază inversă, ca fază mobilă se utilizează apă sau amestecuri apoase-organice. Aditivii organici sunt de obicei solvenți organici polari (acetonitril și metanol). Pentru optimizarea separării se pot folosi soluții apoase cu o anumită valoare a pH-ului, în special soluții tampon, precum și diverși aditivi pentru faza mobilă: acizi fosforic și acetic la separarea compușilor acizi; amoniac și amine alifatice la separarea compușilor bazici și alți modificatori.

Analiza cromatografică este foarte influențată de puritatea fazei mobile, de aceea este de preferat să se utilizeze solvenți produși special pentru cromatografia lichidă (inclusiv apă).

Când se utilizează un detector spectrofotometric UV, faza mobilă nu ar trebui să aibă o absorbție semnificativă la lungimea de undă selectată pentru detectare. Limita de transparență sau densitatea optică la o anumită lungime de undă a unui anumit producător de solvenți este adesea indicată pe ambalaj.

Faza mobilă și soluțiile analizate nu trebuie să conțină particule nedizolvate și bule de gaz. Apa obținută în condiții de laborator, soluțiile apoase, solvenții organici preamestecați cu apă, precum și soluțiile analizate trebuie supuse la filtrare și degazare fină. În aceste scopuri, filtrarea în vid este de obicei utilizată printr-un filtru cu membrană cu o dimensiune a porilor de 0,45 μm, inert față de un anumit solvent sau soluție.

Lista condițiilor cromatografice care trebuie specificate

Monografia farmacopeei trebuie să conțină: denumirea comercială completă a coloanei indicând producătorul și numărul de catalog, dimensiunile coloanei (lungime și diametru interior), tipul de sorbant care indică dimensiunea particulelor, dimensiunea porilor, temperatura coloanei (dacă termostatarea este necesar), volumul probei injectate (bucle de volum), compoziția fazei mobile și metoda de preparare a acesteia, viteza de alimentare a fazei mobile, tipul de detector și condițiile de detectare (dacă este necesar, parametrii celulei detectoare utilizate); descrierea modului de gradient (dacă este utilizat), inclusiv stadiul de reechilibrare la condițiile inițiale, timpul de cromatografie, descrierea detaliată a metodei și formulei de calcul, descrierea preparării soluțiilor standard și de testare.

Dacă derivatizarea pre-coloană este utilizată într-un autosampler, sunt furnizate informații despre programul autosampler. Dacă se utilizează derivatizarea post-coloană, sunt indicate viteza de alimentare a reactivului de derivatizare, volumul buclei de amestecare și temperatura acesteia.

Tipuri modificate de cromatografie lichidă de înaltă performanță

Cromatografia cu perechi de ioni

Una dintre varietățile de cromatografie lichidă de înaltă performanță în fază inversă este cromatografia cu perechi de ioni, care permite determinarea compușilor ionizați. Pentru a face acest lucru, la faza mobilă tradițională de cromatografie lichidă de înaltă performanță cu fază inversă se adaugă compuși organici hidrofobi cu grupări ionice (reactivi perechi de ioni). Alchilsulfații de sodiu sunt de obicei utilizați pentru separarea bazelor; sărurile de tetraalchilamoniu (fosfat de tetrabutilamoniu, bromură de cetiltrimetilamoniu etc.) sunt utilizate pentru separarea acizilor. În modul de pereche de ioni, selectivitatea separării componentelor neionice va fi limitată de mecanismul de retenție în fază inversă, iar reținerea bazelor și a acizilor va crește semnificativ, în timp ce forma vârfurilor cromatografice se va îmbunătăți.

Retenția în modul pereche de ioni se datorează unor procese de echilibru destul de complexe care concurează între ele. Pe de o parte, datorită interacțiunilor hidrofobe și a efectului deplasării mediului polar al fazei mobile, sorbția ionilor hidrofobi pe suprafața gelului de siliciu alchil este posibilă în așa fel încât grupările încărcate să se confrunte cu faza mobilă. În acest caz, suprafața capătă proprietăți de schimb de ioni, iar retenția respectă legile cromatografiei cu schimb de ioni. Pe de altă parte, este posibil să se formeze o pereche de ioni direct în volumul eluentului, urmată de sorbția acesteia pe sorbent conform mecanismului cu fază inversă.

Cromatografia de interacțiune hidrofilă ( HILIC cromatografie)

Cromatografia de interacțiune hidrofilă este utilizată pentru a separa compușii polari care sunt slab reținuți în cromatografia lichidă de înaltă performanță în fază inversă. În această variantă de cromatografie, ca fază mobilă sunt utilizate amestecuri apă-acetonitril cu adaos de săruri, acizi sau baze. Fazele staționare, de regulă, sunt silicageluri modificate cu grupări polare (grupări amino, diol, cianopropil etc.). Mai mulți compuși polari sunt menținuți mai puternic. Capacitatea de eluare a fazei mobile crește odată cu creșterea polarității.

Schimb de ioni și cromatografie lichidă de înaltă performanță ionică

Cromatografia cu schimb de ioni este utilizată pentru analiza compuşilor atât organici (baze heterociclice, aminoacizi, proteine ​​etc.) cât şi anorganici (diverşi cationi şi anioni). Separarea componentelor amestecului analizat în cromatografia schimbătoare de ioni se bazează pe interacțiunea reversibilă a ionilor substanțelor analizate cu grupele schimbătoare de ioni ale sorbantului. Acești adsorbanți sunt în principal fie rășini polimerice schimbătoare de ioni (de obicei copolimeri de stiren și divinilbenzen cu grupări schimbătoare de ioni grefate), fie silicagel cu grupări schimbătoare de ioni grefate. Pentru separarea anionilor (schimbătoare de anioni), se folosesc absorbanții cu grupe: -NH 3 +, -R 3 N +, -R 2 HN +, -RH 2 N + etc., iar sorbanții cu grupări: -SO 3 –, - RSO 3 – , –COOH, -PO 3 – și altele pentru separarea cationilor (schimbătoare de cationi).

Soluțiile apoase de acizi, baze și săruri sunt utilizate ca fază mobilă în cromatografia cu schimb de ioni. De obicei, soluțiile tampon sunt utilizate pentru a menține anumite valori ale pH-ului. De asemenea, este posibil să se utilizeze mici adaosuri de solvenți organici miscibili cu apa - acetonitril, metanol, etanol, tetrahidrofuran.

Cromatografia ionică – o variantă de cromatografie cu schimb de ioni, în care se folosește un detector conductometric pentru a detecta compușii (ionii) în curs de determinare. Pentru determinarea foarte sensibilă a modificărilor conductivității electrice a fazei mobile care trece prin detector, conductivitatea electrică de fundal a fazei mobile trebuie să fie scăzută.

Există două variante principale de cromatografie ionică.

Prima dintre ele, cromatografia ionică în două coloane, se bazează pe suprimarea conductivității electrice a electrolitului de fază mobilă folosind o a doua coloană schimbătoare de ioni sau un sistem special de suprimare cu membrană situat între coloana analitică și detector. Pe măsură ce trece prin sistem, conductivitatea electrică a fazei mobile scade.

A doua variantă a cromatografia ionică este cromatografia ionică pe o singură coloană. Această opțiune folosește o fază mobilă cu conductivitate electrică foarte scăzută. Acizii organici slabi sunt folosiți pe scară largă ca electroliți: benzoici, salicilici sau izoftalici.

Cromatografia lichidă de înaltă performanță cu excluderea mărimii

Cromatografia de excludere a mărimii (cromatografia pe gel) este o versiune specială a cromatografiei lichide de înaltă performanță bazată pe separarea moleculelor după dimensiunea lor. Distribuția moleculelor între faza staționară și cea mobilă se bazează pe dimensiunea moleculelor și parțial pe forma și polaritatea acestora.

Sunt posibile două tipuri limitative de interacțiune a moleculelor cu o fază staționară poroasă. Moleculele mai mari decât diametrul maxim al porilor nu sunt reținute deloc și eluează mai întâi, mișcându-se simultan cu faza mobilă. Moleculele cu dimensiuni mai mici decât diametrul minim al porilor sorbantului pătrund liber în pori și sunt ultimele care sunt eluate din coloană. Moleculele rămase, având dimensiuni intermediare, sunt parțial reținute în pori și, în timpul eluției, sunt împărțite în fracții în funcție de dimensiunile lor și, parțial, pătrund în porii sorbantului în funcție de dimensiunea lor și parțial în funcție de forma lor. Ca urmare, substanțele eluează cu timpi de retenție diferiți.

Cromatografia de excludere ionică

Mecanismul cromatografiei de excludere ionică se bazează pe efectul în urma căruia compușii în formă ionizată nu sunt reținuți pe sorbentul schimbător de ioni, în timp ce compușii sub formă moleculară sunt distribuiți între fazele staționare și apoase în interiorul porilor sorbantului schimbător de ioni. și faza mobilă migrând în spațiul dintre particulele de absorbant. Separarea se bazează pe repulsie electrostatică, interacțiuni polare și hidrofobe între compușii dizolvați și sorbent.

Grupările anionice de pe suprafața sorbantului acționează ca o „membrană” semi-permeabilă între faza staționară și cea mobilă. Componentele încărcate negativ nu ajung în faza mobilă staționară, deoarece sunt respinse de grupuri funcționale încărcate similar și eluează în volumul „mort” (liber) al coloanei. Componentele în formă moleculară nu sunt „respinse” de sorbantul schimbător de cationi și sunt distribuite între faza staționară și cea mobilă. Diferența în gradul de retenție a componentelor neionice ale amestecului este dictată de o combinație de interacțiuni polare ale componentelor neionice cu grupările funcționale ale sorbantului schimbător de cationi și interacțiunile hidrofobe ale componentelor neionice cu matricea sorbantului nepolar.

Cromatografia chirală

Scopul cromatografiei chirale este separarea izomerilor optici. Separările sunt efectuate pe faze staționare chirale sau pe faze staționare achirale convenționale folosind faze mobile chirale. Ca faze staționare chirale se folosesc adsorbanți cu suprafață modificată, grupe sau substanțe cu centri chirali (chitozani, ciclodextrine, polizaharide, proteine ​​etc. (selectori chirali). În acest caz, aceleași faze ca în fază normală sau inversă- cromatografia de fază.La utilizarea fazelor staţionare achirale, pentru a asigura separarea enantiomerilor, la fazele mobile li se vor adăuga modificatori chirali: complecşi metalici chirali, liganzi chirali neutri, reactivi chirali perechi de ioni etc.

Cromatografie lichidă ultraperformanță

Cromatografia lichidă ultraperformanță este o variantă de cromatografia lichidă care este mai eficientă decât cromatografia lichidă clasică de înaltă performanță.

O caracteristică a cromatografiei lichide de ultra-performanță este utilizarea de absorbanți cu dimensiuni ale particulelor de la 1,5 la 2 microni. Dimensiunile coloanei de cromatografie variază de obicei între 50 și 150 mm în lungime și 1 până la 4 mm în diametru. Volumul probei injectate poate varia de la 1 la 50 µl. Utilizarea unor astfel de coloane cromatografice poate reduce semnificativ timpul de analiză și poate crește eficiența separării cromatografice. Cu toate acestea, în acest caz, presiunea pe coloană poate ajunge la 80-120 MPa, frecvența necesară de colectare a datelor detectorului poate crește la 40-100 herți, iar volumul extracoloană al sistemului cromatografic trebuie redus la minimum. Echipamentele și coloanele de cromatografie utilizate în cromatografia lichidă ultra-performanță sunt special adaptate pentru a îndeplini cerințele acestui tip de cromatografie.

Echipamentele concepute pentru cromatografie lichidă ultra-performanță pot fi utilizate și în versiunea clasică a cromatografiei lichide de înaltă performanță.

9885 0

HPLC este o cromatografie pe coloană lichidă în care pot fi utilizate o varietate de mecanisme de sorbție. În esență, HPLC este o formă modernă de cromatografie clasică pe coloană lichidă. Unele dintre cele mai semnificative caracteristici de calitate ale HPLC sunt enumerate mai jos:
- viteza mare a procesului, care a făcut posibilă reducerea duratei de separare de la câteva ore și zile la minute;
- grad minim de estompare a zonelor cromatografice, ceea ce face posibilă separarea compușilor care diferă doar puțin în constantele de sorbție;
- un grad ridicat de mecanizare și automatizare a separării și procesării informațiilor, datorită căruia cromatografia lichidă pe coloană a atins un nou nivel de reproductibilitate și acuratețe.

Cercetările intense din ultimele decenii și cantitatea enormă de date experimentale acumulate ne permit acum să vorbim despre clasificarea variantelor în cadrul metodei cromatografiei lichide de înaltă performanță. Desigur, clasificarea după mecanismul de sorbție dat mai sus rămâne valabilă.

O clasificare comună se bazează pe polaritatea comparativă a fazelor mobile și staționare. În acest caz, se face o distincție între cromatografia în fază normală și cea inversă.

Cromatografia în fază normală (NPC) este o variantă a HPLC în care faza mobilă este mai puțin polară decât faza staționară și există motive de a crede că principalul factor care determină retenția este interacțiunea sorbaților direct cu suprafața sau volumul sorbantului.

Cromatografia în fază inversă (RPC) este o variantă a HPLC în care faza mobilă este mai polară decât faza staționară, iar retenția este determinată de contactul direct al moleculelor de sorbat cu suprafața sau volumul sorbantului; în acest caz, sorbații ionizați nu sunt schimbați cu ioni de fază mobilă absorbiți la suprafață.

Cromatografia cu schimb de ioni este o opțiune în care sorbția se realizează prin schimbul ionilor sorbiți ai fazei mobile cu ionii substanțelor care sunt cromatografiate; Cromatografia de schimb de ligand poate fi definită într-un mod complet analog.

Cromatografia pe adsorbanți modificați dinamic este o variantă a HPLC în care sorbatul nu interacționează direct cu suprafața sorbantului, ci intră în asociere cu moleculele straturilor de suprafață ale eluentului.
Cromatografia cu perechi de ioni este o variantă a cromatografiei în fază inversă a compușilor ionizați în care se adaugă un contraion hidrofob la faza mobilă, care modifică calitativ caracteristicile de sorbție ale sistemului.

Cromatografia de excludere a mărimii este o metodă de separare a compușilor după greutățile lor moleculare, bazată pe diferența în viteza de difuzie a moleculelor de diferite dimensiuni în porii fazei staționare.

Pentru HPLC, o caracteristică foarte importantă este dimensiunea absorbanților, de obicei 3-5 microni, acum până la 1,8 microni. Acest lucru permite ca amestecurile complexe de substanțe să fie separate rapid și complet (timp mediu de analiză de la 3 la 30 de minute).

Problema separării este rezolvată folosind o coloană cromatografică, care este un tub umplut cu un sorbant. La efectuarea unei analize, un lichid (eluent) cu o anumită compoziție este alimentat printr-o coloană cromatografică cu o viteză constantă. O doză de probă măsurată cu precizie este injectată în acest flux. Componentele unei probe introduse într-o coloană cromatografică, datorită afinităților diferite pentru sorbantul coloanei, se deplasează de-a lungul acesteia cu viteze diferite și ajung secvenţial la detector în momente diferite.

Astfel, coloana cromatografică este responsabilă de selectivitatea și eficiența separării componentelor. Prin selectarea diferitelor tipuri de coloane, se poate controla gradul de separare al analiților. Compușii sunt identificați după timpul lor de retenție. Determinarea cantitativă a fiecăreia dintre componente este calculată pe baza mărimii semnalului analitic măsurat folosind un detector conectat la ieșirea coloanei cromatografice.

Sorbenți. Dezvoltarea HPLC este în mare parte asociată cu crearea de noi generații de adsorbanți cu proprietăți cinetice bune și proprietăți termodinamice diverse. Principalul material pentru absorbanții în HPLC este silicagel. Este puternic mecanic și are o porozitate semnificativă, ceea ce conferă o capacitate mare de schimb cu dimensiuni mici ale coloanei. Dimensiunea cea mai comună a particulelor este de 5-10 microni. Cu cât este mai aproape de forma sferică a particulelor, cu atât rezistența la curgere este mai mică, cu atât eficiența este mai mare, mai ales dacă o fracțiune foarte îngustă este ecranată (de exemplu, 7 +1 microni).

Suprafața specifică a gelului de silice este de 10-600 m/g. Silicagelul poate fi modificat cu diferite grupări chimice grefate la suprafață (C-18, CN, NH2, SO3H), ceea ce permite utilizarea sorbanților pe baza acestuia pentru a separa o mare varietate de clase de compuși. Principalul dezavantaj al gelului de silice este rezistența chimică scăzută la pH< 2 и рН >9 (siliciul se dizolvă în alcalii și acizi). Prin urmare, în prezent există o căutare intensă de adsorbanți pe bază de polimeri stabili la pH de la 1 la 14, de exemplu, pe baza de metacrilat de polimetil, polistiren etc.

Sorbenți pentru cromatografie cu schimb de ioni. Datorită particularităților separării (în mediu acid sau alcalin), materialul principal este sorbant în polistiren cu divinilbenzen de diferite grade de reticulare cu SO3 -H+ (schimbătoare de cationi puternic acide) sau -COO-Naf (cation slab acid). schimbători), grupări -H2N+ (CH3) grefate pe suprafața lor 3Cl- (schimbătoare de anioni bazici puternici) sau -N+HR2Cl- (schimbătoare de anioni de bază slabe).

Absorbanți pentru cromatografia de permeație cu gel. Tipul principal este stirenul-DVB. De asemenea, se folosesc sticle macroporoase, metacrilat de metil și silicagel. Aceiași adsorbanți sunt utilizați pentru cromatografia de excludere ionică.
Pompe. Pentru a asigura debitul fazei mobile (MP) prin coloana cu parametrii specificați, se folosesc pompe de înaltă presiune. Cele mai importante caracteristici tehnice ale pompelor LC includ: intervalul de debit; presiunea maximă de lucru; reproductibilitatea fluxului; intervalul de pulsații de alimentare cu solvent.

În funcție de natura alimentării cu solvent, pompele pot fi de alimentare (debit) și presiune constantă. Practic, în timpul lucrului analitic, se utilizează un mod de debit constant, iar la umplerea coloanelor, se utilizează un mod de presiune constantă. Pe baza principiului lor de funcționare, pompele sunt împărțite în pompe cu seringă și pompe cu piston alternativ.

Pompe cu seringi. Pompele de acest tip se caracterizează printr-o absență aproape completă a pulsațiilor în fluxul fazei mobile în timpul funcționării. Dezavantaje ale pompei: a) consum mare de timp si solvent pentru spalare la schimbarea solventului; b) suspendarea separării în timpul umplerii pompei; c) dimensiuni și greutate mari, asigurând în același timp debit și presiune ridicate (este nevoie de un motor puternic și de o forță mare a pistonului cu suprafața sa mare).

Pompe cu piston alternativ. Pompele de acest tip asigură o alimentare volumetrică constantă a fazei mobile pentru o perioadă lungă de timp. Presiune maximă de lucru 300-500 atm, debit 0,01-10 ml/min. Reproductibilitatea debitului volumic este de 0,5%. Principalul dezavantaj este că solventul este furnizat sistemului sub forma unei serii de impulsuri succesive, deci există pulsații de presiune și debit.

Acesta este motivul principal pentru zgomotul crescut și sensibilitatea redusă a aproape tuturor detectorilor utilizați în LC, în special a celor electrochimici. Modalități de combatere a pulsațiilor: folosind pompe duble sau o pompă Bag-Lai cu piston dublu, folosind dispozitive de amortizare și dispozitive electronice.

Cantitatea de alimentare volumetrică este determinată de trei parametri: diametrul pistonului (de obicei 3,13; 5,0; 7,0 mm), amplitudinea acestuia (12-18 mm) și frecvența (care depinde de viteza de rotație a motorului și a cutiei de viteze).

Dozatoare. Scopul dozatorului este de a transfera o probă la presiunea atmosferică la intrarea unei coloane la o presiune de până la câteva atmosfere. Este important ca în dozator să nu existe volume „mort” care să nu poată fi spălate de faza mobilă și să nu existe erodare a probei în timpul dozării. La început, dozatoarele LC erau similare cu dozatoarele de gaz cu o perforare a membranei. Cu toate acestea, membranele nu rezistă la mai mult de 50-100 atm; rezistența lor chimică este insuficientă; piesele lor contaminează filtrele coloanei și capilarele.

Faza lichidă are o rată de difuzie mult mai mică decât faza gazoasă. Prin urmare, puteți doza prin oprirea fluxului - proba nu are timp să se erodeze în dozator. În timp ce proba este introdusă în dozator, o supapă specială oprește fluxul de solvent. Presiunea la intrarea în coloană scade rapid; după câteva secunde, proba poate fi injectată în camera dozatorului cu o microseringă convențională. Apoi, dozatorul este blocat, fluxul de solvent este pornit și are loc separarea.

Presiunea pe care o deține acest robinet este de până la 500-800 atm. Dar atunci când fluxul se oprește, echilibrul în coloană este perturbat, ceea ce poate duce la apariția unor vârfuri suplimentare „vacante”.

Dozatoarele cu buclă sunt cele mai utilizate. Când dozatorul este umplut, orificiile de admisie 1, 2 și canalul dintre ele sunt sub presiune ridicată. Intrările 3-6, canalele dintre ele și bucla de dozare sunt sub presiune atmosferică, ceea ce vă permite să umpleți bucla folosind o seringă sau o pompă. Când distribuitorul este rotit, fluxul fazei mobile deplasează proba în coloană. Pentru a reduce eroarea, bucla este spălată cu de 5-10 ori volumul probei. Dacă proba este mică, poate fi injectată în buclă cu o microseringă. Volumul buclei este de obicei de 5-50 µl.

PE. Voinov, T.G. Volova

Introducere.

Dezvoltarea rapidă a cromatografiei lichide în ultimii 10 ani se datorează în principal dezvoltării intensive a fundamentelor teoretice și utilizării practice a versiunii sale extrem de eficiente, precum și creării și producției industriale a absorbanților și echipamentelor necesare.

O caracteristică distinctivă a cromatografiei lichide de înaltă performanță (HPLC) este utilizarea de adsorbanți cu o dimensiune a granulelor de 3-10 microni, care asigură un transfer rapid de masă cu o eficiență de separare foarte mare.

În prezent, HPLC a ocupat primul loc printre metodele instrumentale în ceea ce privește ratele de dezvoltare, depășind chiar și cromatografia de gaze. Cel mai important avantaj al HPLC în comparație cu cromatografia în gaz este capacitatea de a studia aproape orice obiect fără nicio restricție asupra proprietăților lor fizico-chimice, de exemplu, punctele de fierbere sau greutatea moleculară.

Astăzi, HPLC este o metodă instrumentală bine concepută, care este utilizată pe scară largă într-o mare varietate de domenii ale științei și tehnologiei. Importanța sa este deosebit de mare în domenii critice precum biochimia, biologia moleculară, controlul poluării mediului, precum și în industria chimică, petrochimică, alimentară și farmaceutică.

întrucât este necesar să se țină seama de o serie de cerințe foarte specifice datorită următoarelor caracteristici ale metodologiei.

A. Coloanele HPLC sunt împachetate cu medii cu diametru de particule foarte mic. Ca rezultat, la vitezele volumetrice ale solventului necesare pentru separarea rapidă a probei, se creează o presiune ridicată pe coloană.

b. Detectoarele utilizate în HPLC sunt sensibile la fluctuațiile debitului de eluant și ale presiunii (zgomot). Mai mult, atunci când se utilizează detectoare de concentrație, este necesară o stabilitate și mai mare a vitezei volumetrice a eluantului.

V. Procesul de separare cromatografică este însoțit de o serie de efecte antagoniste, de exemplu, dispersia probei în faza mobilă duce la amestecarea componentelor separate și reduce concentrația maximă a substanței în vârful eluat (în detector). Dispersia este observată în toate zonele sistemului de la punctul de injectare a probei până la detector.

d. Solvenții care acționează ca o fază mobilă pot provoca adesea coroziunea echipamentului. Acest lucru se aplică în primul rând solvenților utilizați în cromatografia în fază inversă, care este preferată în aplicațiile HPLC biochimice.

Specificul HPLC ca tehnică instrumentală trebuie să fie luate în considerare în timpul dezvoltării, creării și exploatării acestor sisteme. A fost nevoie de mai mult de zece ani de căutare și cercetare pentru a crea mostre comerciale de sisteme cromatografice și componentele acestora care sunt suficient de fiabile, simple și sigure pentru a fi operate, cu un raport acceptabil între preț și caracteristicile tehnice. Tendințele recente de reducere a coloanelor (atât lungimea cât și diametrul) impun noi cerințe asupra instrumentelor.

1.1. EFICIENŢĂȘISELECTIVITATEA

Cromatografia este o metodă de separare a componentelor unui amestec pe baza diferenței în distribuția lor de echilibru între două „faze nemiscibile, dintre care una staționară și cealaltă mobilă. Componentele probei se deplasează de-a lungul coloanei atunci când se află în faza mobilă, și rămân pe loc atunci când sunt în faza staționară. Cu cât afinitatea componentei pentru faza staționară este mai mare și cu atât este mai mică pentru faza mobilă, cu atât se deplasează mai lent prin coloană și cu atât este reținută mai mult în ea. Datorită diferenței de afinitate a componentelor amestecului pentru fazele staționare și mobile, obiectivul principal al cromatografiei este atins - separarea unei perioade acceptabile de timp a amestecului în benzi individuale (vârfuri) ale componentelor pe măsură ce se deplasează de-a lungul coloana cu faza mobila.

Din aceste concepte generale, este clar că separarea cromatografică este posibilă numai dacă componentele probei, care intră în coloană la introducerea probei, în primul rând, sunt dizolvate în faza mobilă și, în al doilea rând, interacționează (reținute) cu faza staționară. . Dacă, la introducerea unei probe, orice componente nu sunt sub formă de soluție, acestea vor fi filtrate și nu vor participa la procesul cromatografic. De asemenea, componentele care nu interacționează cu faza staționară vor trece prin coloana cu faza mobilă fără a se separa în componentele lor.

Să acceptăm condiția ca vreo două componente să fie solubile în faza mobilă și să interacționeze cu faza staționară, adică procesul croiatografic poate decurge fără perturbări. În acest caz, după trecerea amestecului prin coloană, puteți obține cromatograme ale formei a, b sau V(Fig. 1.1). Aceste cromatograme ilustrează separări cromatografice care diferă ca eficiență (Ași b) cu selectivitate și selectivitate egale (bȘi V) cu eficiență egală.

Cu cât vârful obținut în același timp de retenție este mai îngust, cu atât eficiența coloanei este mai mare. Eficiența coloanei este măsurată prin numărul de plăci teoretice (NPT) N: cu atât eficiența este mai mare

Orez. 1.2. Parametrii de vârf cromatografici și calculul numărului de plăci teoretice:

t R - timpul de retenție maxim; h - înălțimea vârfului; Wj/j - lățimea vârfului la jumătatea înălțimii sale

Orez. 1.1. Tip de cromatogramă în funcție de eficiența și selectivitatea coloanei:

A- selectivitate normală, eficiență redusă (mai puține plăci teoretice); b - selectivitatea si eficienta obisnuita; V - eficiență normală, selectivitate crescută (raport mai mare al timpilor de retenție al componentelor)

eficiență, cu cât FTT este mai mare, cu atât este mai mică lărgirea vârfului benzii inițial înguste pe măsură ce trece prin coloană și cu atât vârful este mai îngust la ieșirea din coloană. PTT caracterizează numărul de pași în stabilirea echilibrului între fazele mobile și staționare.

Cunoscând numărul de plăci teoretice pe coloană și lungimea coloanei L (µm), precum și diametrul mediu al granulelor de absorbant DC (µm), este ușor de obținut valorile înălțimii echivalente cu o placă teoretică (HETT), precum și ale înălțimii reduse echivalente cu o placă teoretică (RHETT):

BETT = L/ N

PVETT =B3TT/d c .

Având valorile FTT, HETT și PHETT, se poate compara cu ușurință eficiența coloanelor de diferite tipuri, lungimi diferite, umplute cu adsorbanți de natură și granularitate diferite. Prin compararea PTT a două coloane de aceeași lungime, se compară eficiența acestora. Când se compară HETP, se compară coloanele cu absorbanți de aceeași dimensiune a granulelor și lungimi diferite. În cele din urmă, valoarea PVETT permite oricăror două coloane să evalueze calitatea sorbantului, în primul rând și calitatea umplerii coloanelor și, în al doilea rând, indiferent de lungimea coloanelor, granularea sorbanților de natura sa.

Selectivitatea coloanei joacă un rol important în realizarea separării cromatografice.

Selectivitatea unei coloane depinde de mulți factori, iar priceperea experimentatorului este în mare măsură determinată de capacitatea de a influența selectivitatea separării. Pentru aceasta, trei factori foarte importanți sunt în mâinile cromatografului: alegerea naturii chimice a sorbantului, alegerea compoziției solventului și a modificatorilor săi și luarea în considerare a structurii chimice și a proprietăților componentelor separate. . Uneori, o modificare a temperaturii coloanei, care modifică coeficienții de distribuție a substanțelor între fazele mobile și staționare, are un efect vizibil asupra selectivității.

Atunci când se analizează și se evaluează separarea a două componente într-o cromatogramă, rezoluția este un parametru important. R s, care raportează timpii de ieșire și lățimile de vârf ale ambelor componente separate

Rezoluția ca parametru care caracterizează separarea vârfurilor crește pe măsură ce selectivitatea crește, reflectată de o creștere a numărătorului, iar eficiența crește, reflectată printr-o scădere a valorii numitorului datorită scăderii lățimii vârfurilor. Prin urmare, progresul rapid al cromatografiei lichide a condus la o schimbare a conceptului de „cromatografie lichidă de înaltă presiune” - a fost înlocuită cu „cromatografie lichidă de înaltă rezoluție” (în timp ce forma prescurtată a termenului în limba engleză a fost păstrată). HPLC ca fiind cel mai corect care caracterizează direcţia de dezvoltare a cromatografiei lichide moderne).

Astfel, spălarea coloanei este redusă și eficiența crește atunci când se folosește un sorbant mai fin, mai uniform ca compoziție (fracție îngustă), mai dens și mai uniform împachetat în coloană, folosind straturi mai subțiri de fază grefa, solvenți mai puțin vâscoși și debite optime.

Cu toate acestea, împreună cu estomparea benzii zonei cromatografice în timpul procesului de separare în coloană, aceasta poate fi, de asemenea, spălată în dispozitivul de introducere a probei, în injectorul capilar de legătură - coloană și coloană - detector, în celula detector și în unele dispozitive auxiliare (microfiltre pentru captarea particulelor mecanice din probele instalate după injector, precoloane, reactoare cu bobine etc.) - Cu cât volumul extracoloană este mai mare în comparație cu volumul reținut al vârfului, cu atât eroziunea este mai mare. De asemenea, contează unde se află volumul mort: cu cât semnalul cromatografic este mai îngust, cu atât este mai mare estomparea volumului mort. Prin urmare, trebuie acordată o atenție deosebită designului acelei părți a cromatografului în care zona cromatografică este cea mai îngustă (injectorul și dispozitivele de la injector la coloană) - aici eroziunea extracoloană este cea mai periculoasă și are cel mai mare impact. Deși se crede că în cromatografele bine concepute sursele de diluție suplimentară extra-coloană ar trebui reduse la minimum, cu toate acestea, fiecare dispozitiv nou, fiecare modificare a cromatografului trebuie în mod necesar să se încheie cu testarea pe o coloană și compararea cromatogramei rezultate. cu cel de pașaport. Dacă se observă o distorsiune maximă sau o scădere bruscă a eficienței, capilarele și alte dispozitive nou introduse în sistem trebuie inspectate cu atenție.

Spălarea în afara coloanei și evaluarea greșită a acesteia pot duce la o pierdere semnificativă (peste 50%) a eficienței, în special în cazurile în care se încearcă utilizarea cromatografelor relativ vechi pentru HPLC de mare viteză, HPLC pe microcoloană și alte variante ale HPLC moderne care necesită microinjectoare, capilare de conectare cu interne cu un diametru de 0,05-0,15 mm lungime minimă, coloane cu o capacitate de 10-1000 µl, detectoare cu microcuve cu o capacitate de 0,03-1 µl și cu înregistratoare și integratoare de mare viteză, de mare viteză .

1.2. RETENȚIA SOLVENTULUI ȘI REZISTENTA

Pentru ca analiții să fie separați pe coloană, așa cum sa menționat mai sus, coeficientul de capacitate k" trebuie să fie mai mare decât 0, adică substanțele trebuie reținute de faza staționară, sorbant. Cu toate acestea, factorul de capacitate nu trebuie să fie prea mare pentru a obține un timp de eluție acceptabil. Dacă pentru un anumit amestec de substanțe este selectată o fază staționară care le reține, atunci munca ulterioară pentru dezvoltarea unei tehnici de analiză constă în alegerea unui solvent care ar oferi în mod ideal diferit pentru toate componentele, dar acceptabil nu foarte mare. k". Acest lucru se realizează prin modificarea puterii de eluare a solventului.

În cazul cromatografiei de adsorbție pe silicagel sau oxid de aluminiu, de regulă, puterea unui solvent cu două componente (de exemplu, hexan cu adăugarea de izopropanol) este crescută prin creșterea conținutului de componentă polară (izopropanol), sau a scăzut prin scăderea conținutului de izopropanol. Dacă componenta polară care o conține devine prea mică (mai puțin de 0,1%), ar trebui înlocuită cu o forță de eluare mai slabă. La fel se procedează, înlocuind fie o componentă polară, fie o componentă nepolară cu altele, chiar dacă acest sistem nu asigură selectivitatea dorită în raport cu componentele de interes din amestec. La selectarea sistemelor de solvenți se ține cont atât de solubilitatea componentelor amestecului, cât și de seria eluotropă a solvenților compilați de diferiți autori.

Puterea solventului este selectată aproximativ în același mod atunci când se utilizează faze polare grefate (nitril, amino, diol, nitro etc.), ținând cont de posibilele reacții chimice și excluzând solvenții periculoși pentru fază (de exemplu, cetone pentru faza amino).

În cazul cromatografiei în fază inversă, puterea solventului este crescută prin creșterea conținutului de component organic din eluent (metanol, acetonitril sau THF) și scade prin adăugarea mai multor apă. Dacă nu este posibilă atingerea selectivității dorite, aceștia folosesc o altă componentă organică sau încearcă să o schimbe folosind diverși aditivi (acizi, reactivi perechi de ioni etc.).

În separările prin cromatografie cu schimb de ioni, puterea solventului este modificată prin creșterea sau scăderea concentrației soluției tampon sau prin modificarea pH-ului; în unele cazuri, se utilizează modificarea cu substanțe organice.

Cu toate acestea, în special în cazul amestecurilor naturale și biologice complexe, adesea nu este posibil să se selecteze puterea solventului în așa fel încât toate componentele probei să elueze într-un timp acceptabil. Apoi trebuie să recurgeți la eluția în gradient, adică să utilizați un solvent a cărui putere de eluție se modifică în timpul procesului de analiză, astfel încât să crească în mod constant conform unui program predeterminat. Această tehnică face posibilă eluarea tuturor componentelor amestecurilor complexe într-o perioadă de timp relativ scurtă și separarea lor în componente sub formă de vârfuri înguste.

1.3. DIMENSIUNEA, PERMEABILITATEA ŞI EFICIENŢA PARTICULUI SORBENT

Având în vedere eroziunea din coloană, am indicat că eficiența coloanei (HETT) depinde de dimensiunea particulelor de sorbant. În mare măsură, dezvoltarea rapidă a HPLC în ultimii 10-12 ani s-a datorat, în primul rând, dezvoltării metodelor de producere a absorbanților cu dimensiuni ale particulelor de la 3 până la 10 microni și cu o compoziție fracționată îngustă, oferind eficiență ridicată cu o bună eficiență. permeabilitatea și, în al doilea rând, metodele de dezvoltare pentru umplerea coloanelor cu acești adsorbanți și, în al treilea rând, dezvoltarea și producția în serie de cromatografe lichide cu pompe de înaltă presiune, injectoare și detectoare cu cuve de volum mic capabile să înregistreze vârfuri de volum mic.

Pentru coloanele bine împachetate cu nămol, înălțimea teoretică echivalentă redusă a plăcii (LPHE) poate fi 2, indiferent dacă sunt utilizate particule de 3, 5, 10 sau 20 μm pentru împachetare. În acest caz, vom primi respectiv coloane (cu lungimea standard de 250 mm) cu randamentul de 41670, 25000, 12500 și 6250 t.t. Pare natural să selectați cea mai eficientă coloană plină cu particule de 3 µm. Cu toate acestea, această eficiență va veni cu prețul funcționării la presiune foarte mare și al vitezei de separare relativ scăzute, deoarece pompa existentă va putea, cel mai probabil, să pompeze solventul printr-o astfel de coloană la o viteză volumetrică mare. Aici ne confruntăm cu întrebarea relației dintre dimensiunea particulelor sorbantului, eficiența și permeabilitatea coloanelor.

Dacă exprimăm de aici factorul de rezistență al coloanei - o mărime adimensională, obținem următoarea ecuație:

Factorul de rezistență pentru coloanele împachetate cu microparticule de același tip folosind aceeași metodă variază ușor și are următoarele valori:

Tipul de particule „... Neregulat Sferic

formă de formă

Ambalaj uscat. . . . . 1000-2000 800-1200

Ambalaj cu suspensie. . . 700-1500 500-700

Presiunea de intrare a coloanei este proporțională cu viteza de curgere liniară, factorul de rezistență al coloanei, vâscozitatea solventului și lungimea coloanei și invers proporțională cu pătratul diametrului particulei.

Aplicând această relație coloanelor descrise mai sus cu particule cu diametre de 3, 5, 10 și 20 µm și presupunând debitul liniar constant, factorul de rezistență al coloanei și vâscozitatea solventului, obținem un raport al presiunii de intrare de 44:16:4:1. pentru coloane de lungime egală. Astfel, dacă pentru un sorbent în fază inversă cu o dimensiune a particulei de 10 μm atunci când se utilizează sisteme de solvenți cu metanol - . apă (70:30) de obicei pe o coloană standard la un debit de solvent de 1 ml/min, presiunea la intrarea în coloană este de 5 MPa, apoi pentru particule de 5 μm - 20 MPa și pentru 3 μm - 55 MPa . Când se utilizează silicagel și un sistem de solvent mai puțin vâscos, hexan - izopropanol (100:2), valorile vor fi semnificativ mai mici: 1, 4 și, respectiv, 11 MPa. Dacă în cazul unui sorbent cu fază inversă, utilizarea particulelor cu o dimensiune de 3 μm este foarte problematică și 5 μm este posibilă, dar nu pe toate dispozitivele, atunci pentru un sorbent în fază normală nu există probleme cu presiunea. Trebuie remarcat faptul că HPLC modernă de mare viteză utilizează de obicei un debit de solvent mai mare decât în ​​exemplul de mai sus, astfel încât cerințele de presiune cresc și mai mult.

Cu toate acestea, în cazurile în care este necesar un anumit număr de plăci teoretice pentru separare și este de dorit să se efectueze o analiză a vitezei, imaginea se schimbă oarecum. Deoarece lungimile coloanelor cu adsorbanți cu granule de 3, 5, 10 microni, cu eficiență egală, vor fi, respectiv, de 7,5; 12,5 și 25 cm, apoi raportul de presiune la intrarea în coloane se va schimba la 3:2:1. În consecință, durata analizei pe astfel de coloane de eficiență egală va fi în raportul 0,3:0,5:1, adică atunci când se trece de la 10 la 5 și 3 microni, durata analizei va fi redusă de 2 și 3,3 ori. Această analiză mai rapidă vine cu prețul unei presiuni proporțional mai mari la intrarea în coloană.

Datele prezentate sunt valabile pentru acele cazuri în care adsorbanții de diferite dimensiuni ale granulelor au aceleași curbe de distribuție a dimensiunii particulelor, coloanele sunt împachetate în același mod și au același factor de rezistență al coloanei. Trebuie avut în vedere faptul că dificultatea de a obține fracții înguste ale sorbantului crește pe măsură ce dimensiunea particulelor scade și că. Fracțiile de la diferiți producători au compoziții fracționale diferite. Prin urmare, factorul de rezistență al coloanei va varia în funcție de mărimea granulelor, tipul de absorbant, metoda de împachetare a coloanei etc.

CLASIFICAREA METODELOR HPLC PRIN MECANISM DE SEPARARE

Majoritatea separărilor efectuate prin HPLC se bazează pe un mecanism mixt de interacțiune a substanțelor cu un sorbant, asigurând o retenție mai mare sau mai mică a componentelor în coloană. Mecanismele de separare într-o formă mai mult sau mai puțin pură sunt destul de rare în practică, de exemplu, adsorbția atunci când se utilizează silicagel absolut anhidru și hexan anhidru pentru a separa hidrocarburile aromatice.

Cu un mecanism de retenție mixt pentru substanțe cu diferite structuri și greutăți moleculare, este posibil să se evalueze contribuția la retenția de adsorbție, distribuție, excludere și alte mecanisme. Cu toate acestea, pentru o mai bună înțelegere și înțelegere a mecanismelor de separare în HPLC, este recomandabil să se ia în considerare separările cu o predominanță a unuia sau altuia mecanism ca fiind legate de un anumit tip de cromatografie, de exemplu, cromatografia cu schimb ionic.

2.1.1 CROMATOGRAFIA ADSORBIEI

Separarea prin cromatografie de adsorbție se realizează ca urmare a interacțiunii unei substanțe cu adsorbanți, cum ar fi silicagel sau oxid de aluminiu, care au centrii activi la suprafață. Diferența în capacitatea de a interacționa cu centrele de adsorbție ale diferitelor molecule de probă duce la separarea acestora în zone în timpul mișcării cu faza mobilă de-a lungul coloanei. Separarea zonei a componentelor realizată în acest caz depinde de interacțiunea atât cu solventul, cât și cu adsorbantul.

Sorpția pe suprafața unui adsorbant care conține grupări hidroxil se bazează pe o interacțiune specifică între suprafața polară a adsorbantului și grupările sau secțiunile polare (sau polarizabile) de molecule. Astfel de interacțiuni includ interacțiunea dipol-dipol între dipoli permanenți sau induși, formarea unei legături de hidrogen, până la formarea de complexe r sau complexe de transfer de sarcină. O posibilă și destul de frecventă apariție în munca practică este manifestarea chimiosorbției, care poate duce la o creștere semnificativă a timpului de retenție, o scădere bruscă a eficienței, apariția produselor de descompunere sau sorbția ireversibilă a substanței.

Izotermele de adsorbție ale substanțelor au formă liniară, convexă sau concavă. Cu o izotermă de adsorbție liniară, vârful substanței este simetric și timpul de retenție nu depinde de dimensiunea probei. Cel mai adesea, izotermele de adsorbție ale substanțelor sunt neliniare și au o formă convexă, ceea ce duce la o anumită asimetrie a vârfului cu formarea unei cozi.

Cele mai utilizate pe scară largă în HPLC sunt adsorbanții de silicagel cu diferite volume de pori, suprafețe și diametre ale porilor. Oxidul de aluminiu este folosit mult mai rar, iar alți adsorbanți, utilizați pe scară largă în cromatografia clasică pe coloană și în strat subțire, sunt utilizați extrem de rar. Motivul principal pentru aceasta este rezistența mecanică insuficientă a majorității celorlalți adsorbanți, care nu le permite să fie ambalate sau utilizate la presiuni ridicate caracteristice HPLC.

Grupările polare care provoacă adsorbția și sunt situate pe suprafața gelului de silice și a oxidului de aluminiu sunt similare ca proprietăți. Prin urmare, de obicei, ordinea de eluție a amestecurilor de substanțe și seria eluotropă de solvenți sunt aceleași pentru acestea. Cu toate acestea, diferența în structura chimică a gelului de silice și a oxidului de aluminiu duce uneori la diferențe de selectivitate - apoi se acordă preferință unuia sau altui adsorbant care este mai potrivit pentru o anumită sarcină specifică. De exemplu, alumina oferă o selectivitate mai mare pentru separarea anumitor hidrocarburi aromatice polinucleare.

Preferința acordată de obicei gelului de silice în comparație cu oxidul de aluminiu se explică printr-o gamă mai largă de geluri de silice în ceea ce privește porozitatea, suprafața și diametrul porilor, precum și activitatea catalitică semnificativ mai mare a oxidului de aluminiu, care duce adesea la denaturarea rezultatelor analizei. din cauza descompunerii componentelor probei sau a chimisorbţiei ireversibile a acestora .

2.1.2 Dezavantajele cromatografiei de adsorbție care limitează utilizarea acesteia

Popularitatea cromatografiei de adsorbție a scăzut treptat pe măsură ce s-a dezvoltat metoda HPLC; aceasta a fost din ce în ce mai înlocuită și continuă să fie înlocuită cu alte opțiuni, cum ar fi HPLC în fază inversă și fază normală pe sorbanți cu fază grefată. Care sunt dezavantajele cromatografiei de adsorbție care au condus la aceasta?

În primul rând, aceasta este durata lungă a proceselor de echilibrare a adsorbanților cu solvenți care conțin apă în urme, dificultatea preparării unor astfel de solvenți cu o umiditate certă și reproductibilă. Acest lucru are ca rezultat o reproductibilitate slabă a parametrilor de retenție, rezoluție și selectivitate. Din același motiv, este imposibil să se utilizeze eluția cu gradient - revenirea la starea inițială este atât de lungă încât depășește semnificativ timpul câștigat prin utilizarea unui gradient.

Dezavantaje semnificative ale adsorbanților, în special oxidul de aluminiu, asociate cu cazuri frecvente de rearanjare a compușilor sensibili la cataliză, descompunerea acestora și sorbția ireversibilă, sunt de asemenea bine cunoscute și au fost remarcate în mod repetat în literatură. Substantele absorbite ireversibil, care se acumuleaza la sectiunea initiala a coloanei, schimba natura sorbantului si pot duce la cresterea rezistentei coloanei sau chiar la infundarea sa completa. Ultimul dezavantaj poate fi eliminat folosind o precoloană, care De- Pe măsură ce rezistența și înfundarea crește, acesta este înlocuit cu unul nou* sau reumplut cu un nou sorbant. Cu toate acestea, sorbția ireversibilă, care apare și în acest caz, are ca rezultat o cromatogramă în care componentele probei sensibile la sorbție sau descompunere catalitică sunt complet sau parțial absente.

2.2. CROMATOGRAFIE DE DISTRIBUȚIE

Cromatografia de partiție este o variantă a HPLC în care separarea unui amestec în componente se realizează datorită diferenței dintre coeficienții lor de distribuție între două faze nemiscibile: un solvent (fază mobilă) și o fază pe sorbent (fază staționară). Din punct de vedere istoric, primii au fost adsorbanții de acest tip, care au fost obținuți prin aplicarea de faze lichide (oxidipropionitril, ulei de parafină, etc.) pe suporturi poroase, similar modului în care au fost și sunt pregătiți absorbanții pentru cromatografia gaz-lichid (GLC). Cu toate acestea, au fost dezvăluite imediat dezavantajele unor astfel de adsorbanți, principalul dintre acestea fiind clătirea relativ rapidă a fazei din purtător. Din această cauză, cantitatea de fază din coloană a scăzut treptat, timpii de retenție au scăzut și ei, iar în secțiunea inițială a coloanei au apărut centre de adsorbție neacoperite de fază, determinând formarea cozilor de vârf. Acest dezavantaj a fost combatet prin saturarea solventului cu faza aplicată înainte ca acesta să intre în coloană. Antrenarea a fost, de asemenea, redusă atunci când s-au folosit faze polimerice mai vâscoase și mai puțin solubile, dar în acest caz, din cauza dificultății difuzării din peliculele groase de polimer, eficiența coloanei a fost redusă semnificativ.

S-a dovedit a fi logic să grefăm faza lichidă pe purtător prin legături chimice în așa fel încât îndepărtarea ei să devină imposibilă din punct de vedere fizic, adică să transformăm purtătorul și faza într-una singură - în așa-numitul sorbent de fază grefată.

Eforturile ulterioare ale cercetătorilor au vizat căutarea de reactivi a căror altoire să decurgă destul de rapid și complet, iar legăturile formate să fie cât mai stabile. Astfel de reactivi au fost alchilclorosilanii și derivații acestora, care au făcut posibilă, folosind o tehnologie similară, obținerea de adsorbanți în fază grefa de diferite tipuri și cu diferite grupări polare și nepolare la suprafață.

Aplicarea cu succes a celui din urmă tip de adsorbanți pentru HPLC a contribuit la creșterea producției lor de către o mare varietate de producători. Fiecare companie a produs astfel de adsorbanți, de regulă, pe baza propriului tip de silicagel și folosind propria tehnologie, care de obicei constituie „know-how” de producție. Ca urmare, un număr mare de adsorbanți, numiți chimic exact la fel (de exemplu, silicagel grefat cu octadecilsilan), au caracteristici cromatografice foarte diferite. Acest lucru se datorează faptului că silicagelul poate avea pori mai largi sau mai îngusti, o suprafață diferită, porozitate, suprafața sa înainte de altoire poate fi hidroxilată sau nu, pot fi grefați mono-, di- sau triclorosilani, condițiile de altoire pot da monomeri, polimeri. sau faza de strat mixt, diferite metode sunt utilizate pentru a îndepărta reactivii reziduali, dezactivarea suplimentară a silanolului și a altor grupări active poate fi sau nu utilizată.

Complexitatea tehnologiei de altoire a reactivilor și prepararea materiilor prime și materialelor, natura sa în mai multe etape, duce la faptul că chiar și loturile de adsorbanți obținute folosind aceeași tehnologie de la o firmă de producție pot avea caracteristici cromatografice ușor diferite. Acest lucru este valabil mai ales în cazurile în care astfel de adsorbanți sunt utilizați pentru analiza amestecurilor multicomponente care conțin substanțe care diferă semnificativ în ceea ce privește numărul și poziția grupurilor funcționale și tipul de funcționalitate.

Ținând cont de cele de mai sus, ar trebui să se străduiască întotdeauna să se asigure că atunci când se utilizează tehnica de analiză descrisă în literatură, se utilizează același sorbant și aceleași condiții de funcționare. În acest caz, probabilitatea ca opera să nu fie reprodusă este minimă. Dacă acest lucru nu este posibil, dar este luat un sorbent de la o altă companie cu o fază de altoit similară, trebuie să fiți pregătit pentru faptul că va dura mult timp pentru a relua tehnica. În același timp, există posibilitatea (și ar trebui luată în considerare) ca cu acest sorbant, chiar și după o dezvoltare îndelungată, separarea necesară să nu fie realizată. Prezența în literatură a multor tehnici de separare descrise pe adsorbanți vechi care au fost produși de mult timp stimulează producția și utilizarea ulterioară a acestora din acest motiv. Cu toate acestea, în cazurile în care este necesar să se treacă la dezvoltarea metodelor originale, în special în ceea ce privește substanțele predispuse la descompunere, chimisorbție, rearanjare, este indicat să se înceapă lucrul la adsorbanți care au fost dezvoltați recent și produși folosind noi, îmbunătățiți. versiuni ale tehnologiei. Noii adsorbanți au o compoziție fracționată mai uniformă, o acoperire a suprafeței mai uniformă și completă cu faza de altoit și stadii finale mai avansate de prelucrare a sorbantului.

2.3. CROMATOGRAFIE DE SCHIMB DE IONI

În cromatografia cu schimb ionic, separarea componentelor amestecului se realizează prin interacțiunea reversibilă a substanțelor ionizante cu grupările ionice ale sorbantului. Păstrarea neutralității electrice a sorbantului este asigurată de prezența contraionilor capabili de schimb ionic situat în imediata apropiere a suprafeței. Ionul probei introduse, interacționând cu sarcina fixă ​​a sorbantului, schimbă cu contraionul. Substantele cu afinitati diferite pentru sarcinile fixe sunt separate pe schimbatoare de anioni sau schimbatoare de cationi.Schimbatoarele de anioni au grupe incarcate pozitiv la suprafata si absorb anioni din faza mobila.Schimbatoarele de cationi contin, in consecinta, grupuri cu sarcina -negativa care interactioneaza cu cationii.

Ca fază mobilă se folosesc soluții apoase de săruri de acizi, baze și solvenți precum amoniacul lichid, adică sisteme de solvenți cu o constantă dielectrică mare și o tendință mai mare de ionizare a compușilor, care lucrează de obicei cu soluții tampon care permit pH-ul. valoare de ajustat.

În timpul separării cromatografice, ionii analitului concurează cu ionii conținuți în eluent, tinzând să interacționeze cu grupurile încărcate opus ale sorbantului. Rezultă că cromatografia cu schimb de ioni poate fi utilizată pentru a separa orice compuși care pot fi ionizați într-un fel. Este posibil să se analizeze chiar și molecule neutre de zahăr sub forma complecșilor lor cu ion de borat:

Zahăr + VO 3 2 - = Zahăr -VO 3 2 -.

Cromatografia cu schimb de ioni este indispensabilă pentru separarea substanțelor extrem de polare, care nu pot fi analizate prin GLC fără conversie în derivați. Acești compuși includ aminoacizi, peptide și zaharuri.

Cromatografia cu schimb de ioni este utilizată pe scară largă în medicină, biologie, biochimie, pentru monitorizarea mediului, în analiza conținutului de medicamente și a metaboliților acestora în sânge și urină, pesticide din materiile prime alimentare, precum și pentru separarea compușilor anorganici, inclusiv radioizotopi, lantanide, actinide etc. Analiza biopolimerilor (proteine, acizi nucleici etc.), care de obicei dura ore sau zile, folosind cromatografia de schimb ionic se realizează în 20-40 minute cu o mai bună separare. Utilizarea cromatografiei cu schimb de ioni în biologie a făcut posibilă observarea probelor direct în medii biologice, reducând posibilitatea de rearanjare sau izomerizare, ceea ce poate duce la interpretarea incorectă a rezultatului final. Este interesant să folosim această metodă pentru a monitoriza modificările care apar în fluidele biologice. Utilizarea schimbătorilor de anioni slabi poroși pe bază de silicagel a permis separarea peptidelor. V

Mecanismul schimbului de ioni poate fi reprezentat sub forma următoarelor ecuații:

pentru schimbul de anioni

X-+R+Y- h ->■ Y-+R+X-.

pentru schimb cationic |

X+ + R-Y+ h=* Y++R-X+.

În primul caz, ionul eșantionului X~ concurează cu ionul de fază mobilă Y~ pentru centrele de ioni R+ ale schimbătorului de ioni, iar în al doilea caz, cationii probei X+ concurează cu ionii Y+ ai fazei mobile pentru R. ~ centri ionici.

Desigur, ionii de probă care interacționează slab cu schimbătorul de ioni vor fi slab reținuți pe coloană în timpul acestei competiții și vor fi primii care vor fi spălați din aceasta și, dimpotrivă, ionii reținuți mai puternic vor fi ultimii care vor elua din coloană. . De obicei, interacțiunile BTqpH4Hbie de natură neionică apar datorită adsorbției sau legăturilor de hidrogen ale probei cu partea neionică a matricei sau datorită solubilității limitate a probei în faza mobilă. Este dificil să izolați cromatografia cu schimb de ioni „clasică” în forma sa „pură” și, prin urmare, unii cromatografi pornesc de la principii mai degrabă empirice decât teoretice în cromatografia cu schimb de ioni.

Separarea substanțelor specifice depinde în primul rând de alegerea celui mai potrivit sorbent și faza mobilă. Rășinile schimbătoare de ioni și silicagelurile cu grupări ionogene grefate sunt utilizate ca faze staționare în cromatografia schimbătoare de ioni.

2.4. CROMATOGRAFIE DE EXCLUDERE DE SECȚIUNE

Cromatografia de excludere este o opțiune! cromatografia lichidă, în care separarea are loc datorită distribuției moleculelor între solventul situat în interiorul porilor sorbentului și solventul care curge " între particulele sale.

Spre deosebire de alte opțiuni HPLC, unde separarea venire Datorită interacțiunilor diferite ale componentelor cu suprafața sorbantului, rolul umpluturii solide în cromatografia de excludere dimensională este doar acela de a forma pori de o anumită dimensiune, iar faza staționară este solventul care umple acești pori. Prin urmare, utilizarea termenului „sorbent” la aceste materiale de umplutură este într-o anumită măsură arbitrară.

O caracteristică fundamentală a metodei este capacitatea de a separa moleculele în funcție de dimensiunea lor în soluție în intervalul aproape oricărei greutăți moleculare - de la 10 2 la 10 8, ceea ce o face indispensabilă pentru studiul sintetic și al biopolimerilor.

În mod tradițional, procesul desfășurat în solvenți organici este încă adesea numit cromatografia de permeație pe gel, iar în sistemele apoase - cromatografia de filtrare pe gel. În această carte, este adoptat un singur termen pentru ambele opțiuni, care provine din limba engleză „Size Exclusion” - excludere după mărime - și reflectă cel mai pe deplin mecanismul procesului.

O analiză detaliată a ideilor existente despre teoria foarte complexă a procesului de cromatografie de excludere a mărimii este realizată în monografii.

Volumul total de solvent în coloană Vt (acesta este adesea numit volumul total al coloanei, deoarece Vd nu participă la procesul cromatografic) este suma volumelor fazelor mobile și staționare.

Reținerea moleculelor într-o coloană de excludere este determinată de probabilitatea difuzării lor în pori și depinde de raportul dintre dimensiunile moleculelor și porilor, care este prezentat schematic în Fig. 2.15. Coeficientul de distribuție Ka, ca și în alte variante de cromatografie, este raportul dintre concentrațiile unei substanțe în fazele staționare și mobile.

Întrucât fazele mobile și staționare au aceeași compoziție, atunci Kd o substanță pentru care ambele faze sunt la fel de accesibile este egală cu unitatea. Această situație este realizată pentru moleculele C cu dimensiunile cele mai mici (inclusiv moleculele de solvent), care pătrund în toți porii (vezi Fig. 2.15) și, prin urmare, se deplasează prin coloană cel mai lent. Volumul lor de retenție este egal cu volumul total al solventului Vt-

Orez. 2.15. Model de separare moleculară prin măsurare în cromatografia de excludere dimensională

Toate moleculele a căror dimensiune este mai mare decât dimensiunea porilor absorbanților nu pot intra în ele (excluderea completă) și trec prin canalele dintre particule. Eluează din coloană cu același volum de retenție egal cu volumul fazei mobile V 0 - Coeficientul de partiție pentru aceste molecule este zero.

Moleculele de mărime intermediară, capabile să pătrundă doar o parte din pori, sunt reținute în coloană în funcție de dimensiunea lor. Coeficientul de distribuție al acestor molecule variază de la zero la unu și caracterizează fracția din volumul porilor accesibilă moleculelor de o dimensiune dată.Volumul lor reținut este determinat de suma lui V o și porțiunea accesibilă a volumului porilor.

ANALIZA CALITATIVA

Un cromatograf care intră în domeniul cromatografiei lichide de înaltă performanță trebuie să se familiarizeze cu fundamentele analizei calitative. Analiza calitativă este folosită pentru a identifica un produs cunoscut, obținut într-un mod nou sau găsit în amestec cu alte produse." Este necesar la izolarea diferitelor componente din amestecuri biologice și chimice complexe, ceea ce este deosebit de important în medicină, criminalistică, ecologie, pentru monitorizarea prezenței unor produse chimice medicinale și a metaboliților acestora în bioml.ter.ials.. Analiza „Familiaritatea cu elementele de bază ale calitative” va ajuta la evitarea greșelilor comune, de exemplu, diferențierea impurităților dintr-o probă de impuritățile dintr-un solvent sau verificarea purității unei substanțe la mai mult de un spectrofotometru cu lungimi de undă, dar pe altele diferite etc.

Înainte de a continua cu analiza, este necesar să se determine dacă întreaga probă este eluată din coloană printr-un sistem de solvenți dat sau nu. Pentru a fi siguri de eluarea completă, este necesar să colectați tot lichidul care curge din coloană, să evaporați solventul, să cântăriți reziduul și să găsiți gradul de recuperare a probei.

Identificarea componentelor în HPLC se poate face în trei moduri: 1) folosind informațiile de reținere; 2) se examinează zonele obţinute în timpul separării într-o coloană de cromatograf lichid folosind metode de analiză spectrală sau chimică; 3) conectați direct analizorul de spectru la coloană.

Volumul de retenție este utilizat pentru a înregistra vârfurile în cromatografie. V R sau timp de retenție t R. Ambele cantități sunt caracteristice unei substanțe dintr-un sistem cromatografic dat. Deoarece timpul de reținere al substanței care este separată constă din timpul de interacțiune în coloană și timpul de trecere a secțiunilor goale ale tubului, acesta variază de la instrument la instrument. Este convenabil să existe o substanță nereținută de o coloană dată, luând-o ca standard al cărui timp și volum de retenție t 0 , V o. Cromatografia substanței și a standardului trebuie efectuată în aceleași condiții (presiune și debit). Atunci când sunt identificate prin datele de retenție, substanțele individuale cunoscute care pot fi prezente în probe sunt separate în același sistem cromatografic și se obțin valori pentru acestea. t R. Comparând aceste valori t R cu timpul de retenție al vârfului necunoscut, se poate constata că acestea fie coincid, caz în care este probabil ca vârfurile să corespundă aceleiași substanțe, fie t R substanta cunoscuta nu corespunde t R zona necunoscuta. Atunci o estimare aproximativă a valorilor este încă posibilă t R substanțe care nu sunt disponibile pentru măsurarea directă a gradului de retenție a acestora. Să luăm în considerare ambele opțiuni.

În primul caz, un studiu preliminar al probei este evident necesar pentru a postula prezența unor substanțe specifice în ea. Când se lucrează cu amestecuri simple, nu este dificil să se determine dacă gradul de retenție al zonelor probei și al substanțelor cunoscute coincide sau nu, adică valorile tB la fel sau diferit. În cazul amestecurilor complexe, mai multe substanțe pot elua cu valori similare t R, iar zonele efectiv obţinute în timpul separării cromatografice se suprapun. Ca urmare, obținerea unor valori exacte t R devine imposibil pentru diferite zone. Fiabilitatea identificării crește odată cu creșterea rezoluției, un control mai atent al condițiilor de separare și măsurarea repetată a valorilor t R și realizarea mediei valorilor găsite. În acest caz, separarea cromatografică a substanțelor cunoscute și necunoscute trebuie să alterneze. La separarea amestecurilor complexe, valoarea t R substanțele se pot modifica sub influența matricei probei în sine. Acest efect este posibil la începutul cromatogramei și atunci când vârfurile se suprapun; De asemenea, este posibil să strângeți zonele, așa cum sa menționat deja.

În astfel de cazuri, standardul trebuie adăugat la probă într-un raport de 1: 1. Dacă substanțele sunt identice, valoarea t R materialul de pornire nu se modifică și se obține un singur vârf în cromatogramă. Dacă aveți un dispozitiv cu un sistem de cromatografie ciclică, atunci pentru o identificare fiabilă este recomandabil să treceți amestecul prin coloană de mai multe ori.

Informații despre ratele de retenție pot fi găsite și în literatura de specialitate, dar valoarea acestor informații este limitată. Deoarece coloanele chiar și din același lot oferă o reproductibilitate slabă, valorile din literatură nu corespund întotdeauna cu valoarea adevărată t R pe această coloană. Pentru cromatografia de adsorbție, totuși, este posibil să se prevadă t R pe baza datelor din literatură. O altă dificultate asociată cu utilizarea sensurilor literare t R, - dificultatea de a le găsi în literatura de specialitate, deși recenziile bibliografice publicate în Jurnalul de cromatografie au un index actualizat pe tip de substanță.

În al doilea caz, când timpii de retenție ai compușilor cunoscuți și zonele de probă nu coincid, este posibil să se prezică timpul de retenție al componentei necunoscute. Predicțiile privind retenția relativă bazate pe datele de structură în cromatografia de excludere steric sunt destul de fiabile. Ele sunt mai puțin precise în cromatografia de adsorbție și partiție, și mai ales atunci când se lucrează pe o fază legată chimic. Pentru cromatografia de ioni și perechi de ioni a substanțelor cu p Ka Sunt posibile doar determinări aproximative ale valorilor tR. Este întotdeauna mai ușor să preziceți retenția relativă sau valorile *x decât valorile absolute k". Valori relative t R mai ușor de evaluat pentru compuși sau derivați înrudiți, cum ar fi acizii alchilcarboxilici substituiți sau derivații de benzen.

Când se separă izocratic omologii sau oligomerii, se observă uneori următorul model:

\ gk" = A + Bn,

Unde AȘi ÎN- constante pentru un număr de probe selectate și pentru un sistem cromatografic dat (pe aceeași coloană, cu aceleași faze mobile și staționare); P- numarul de unitati structurale identice din molecula proba.

Introducerea unei grupe funcționale / în molecula probă va duce la o schimbare k" în prima ecuaţie printr-un coeficient constant a/ într-un sistem cromatografic dat. Este posibil să se obțină constante de grup a/ pentru diferite grupări substituente/, ale căror valori vor crește odată cu creșterea polarității grupurilor funcționale în toate tipurile de cromatografie, cu excepția fazei inverse, unde valorile constantelor vor scădea cu polaritate crescândă.

Unele constante de grup a/ pentru diferite grupări substituente/ sunt date în tabel. 9.1.

În cromatografia de adsorbție, prima ecuație nu este întotdeauna aplicabilă, deoarece este valabilă cu condiția ca toți izomerii să aibă aceeași valoare k", ceea ce nu este întotdeauna respectat. Este posibil, totuși, să se grafice logfe" a acelorași compuși pe o coloană față de logfe" a acelorași compuși pe o coloană diferită sau față de caracteristicile corespunzătoare în cromatografia în strat subțire, de exemplu, log[(l- Rf) IRf].

Valorile coeficientului de capacitate pot fi utilizate la compararea datelor de retenție k", pentru că spre deosebire de el t R viteza fazei mobile și caracteristicile geometrice ale coloanei nu sunt afectate.

Separările de fază legate chimic sunt similare cu separările prin cromatografie de partiție cu faze similare și, prin urmare, datele de extracție la starea de echilibru pot fi utilizate pentru a prezice timpii de retenție.

În cromatografia cu schimb de ioni, trei factori influențează gradul de retenție: gradul de ionizare a acizilor și bazelor, sarcina moleculei ionizate și capacitatea substanței din faza mobilă apoasă utilizată în cromatografia cu schimb de ioni de a migra în substanța organică. fază. Acesta din urmă depinde de greutatea moleculară a compusului și de hidrofobicitatea acestuia. Prin urmare, acizii sau bazele mai puternice sunt reținute mai puternic în timpul separării schimbului de anioni sau schimbului de cationi. Când scade pK a a unui acid individual inclus în probă, retenția crește atunci când un număr de acizi sunt separați datorită schimbului de anioni, iar odată cu creșterea p/C o, retenția bazelor crește atunci când sunt separați datorită schimbului de cationi.

Astfel, coincidența timpilor de retenție ai unei substanțe cunoscute cu cea observată face posibilă asumarea identității acestora. Fiabilitatea identificării crește dacă cromatogramele unei substanțe cunoscute și ale unei componente necunoscute sunt comparate în condiții diferite. Dacă substanțele se comportă identic în cromatografia de adsorbție și fază inversă sau schimb de ioni și excludere prin mărime, fiabilitatea identificării crește. Dacă fiabilitatea identificării cu retenție relativă egală este de 90%, atunci când se studiază comportamentul acelorași substanțe în condiții semnificativ diferite, fiabilitatea identificării este deja de 99%.

O caracteristică valoroasă a unei substanțe utilizate în identificare este raportul dintre semnalele obținute pentru o anumită substanță pe doi detectori diferiți. Substanța analizată, după ce iese din coloană, trece mai întâi prin primul detector, apoi prin al doilea, iar semnalele provenite de la detectoare sunt înregistrate simultan cu ajutorul unui reportofon multipen sau pe două reportofone. În mod obișnuit, se utilizează o conexiune în serie a unui detector de ultraviolete (mai sensibil, dar selectiv) cu un refractometru, sau a unui ultraviolet cu un detector de fluorescență sau a doi detectoare de ultraviolete care funcționează la lungimi de undă diferite. Răspunsul relativ, adică raportul dintre semnalul refractometrului și semnalul fotometrului, este o caracteristică a substanței, cu condiția ca ambii detectoare să funcționeze în domeniul lor liniar; aceasta este testată prin administrarea de cantități diferite din aceeași substanță. Informațiile calitative pot fi obținute lucrând cu detectoare fotometrice echipate cu un dispozitiv de oprire a fluxului care permite înregistrarea spectrului vârfului care iese din coloană în timp ce se află în celula de flux, comparându-l cu spectrul unui compus cunoscut.

Spectrofotometrele moderne, încă scumpe, cu o matrice de diode prezintă un interes semnificativ în identificare.

O substanță complet necunoscută nu poate fi identificată numai folosind cromatografia lichidă de înaltă performanță; sunt necesare și alte metode.

ANALIZA CANTITATIVA

Cromatografia lichidă cantitativă este o metodă analitică bine dezvoltată, care nu este inferioară ca acuratețe față de cromatografia cantitativă de gaz și depășește semnificativ acuratețea TLC sau electroforezei.Din păcate, în HPLC nu există un detector care să aibă o sensibilitate apropiată pentru compuși cu structuri chimice diferite ( ca un catarometru în GLC) Prin urmare, pentru a obține rezultate cantitative, calibrarea dispozitivului este obligatorie.

Analiza cantitativă constă în următoarele etape: 1) separarea cromatografică; 2) măsurarea zonelor de vârf sau înălțimii; 3) calculul compoziției cantitative a amestecului pe baza datelor cromatografice; 4) interpretarea rezultatelor obținute, adică prelucrarea statistică. Să luăm în considerare toate aceste etape.

4.1. SEPARARE CRMATOGRAFICĂ

Pot fi făcute erori în timpul colectării probelor. Este deosebit de important să se evite erorile și să se obțină un eșantion reprezentativ adecvat de solide eterogene, substanțe volatile sau instabile și produse agricole și biomateriale. Probele eterogene, de exemplu produsele alimentare, sunt bine amestecate și tăiate în sferturi. Efectuând această operație de mai multe ori, se obține omogenitatea probei.

Erorile si pierderile de substante pot fi facute in stadiul de extractie, izolare, purificare etc.

Probele trebuie să fie complet dizolvate și soluțiile lor trebuie preparate cu o precizie de ±0,1%. Se recomandă dizolvarea probei în faza mobilă, ceea ce va elimina posibilitatea precipitării acesteia după introducerea în cromatograf. Dacă dizolvarea în faza mobilă nu este posibilă, atunci trebuie utilizat un solvent miscibil cu acesta și volume de probă (mai puțin de 25 µl) trebuie introduse în cromatograf.

Pot apărea erori semnificative în timpul injectării probei din cauza fracționării probei, a scurgerilor și a decolorării vârfurilor. Încețoșarea vârfurilor determină formarea cozilor, ducând la suprapunerea parțială a vârfurilor și, în consecință, la erori de detectare. Dispozitivele cu supapă cu buclă sunt preferabile seringilor pentru introducerea probelor în analiza cantitativă datorită preciziei mai mari și dependenței mai mici de operator.

La separarea cromatografică a substanțelor pot apărea și complicații care duc la denaturarea datelor: analiză cantitativă. Poate exista descompunere sau conversie a probei în timpul procesului cromatografic sau adsorbție ireversibilă a substanței pe coloană. Este important să se asigure absența acestor fenomene nedorite și, dacă este necesar, să se regenereze coloana sau să o înlocuiască. Suprapunerea vârfurilor și coada pot fi, de asemenea, reduse prin variarea condițiilor cromatografice.

Vârfuri cu forme false sau neclare, precum și vârfuri al căror timp de eliberare este aproape de la, întrucât separarea lor poate să nu fie suficientă. În mod obișnuit, se folosesc vârfuri cu o valoare d"^0,5. Cea mai mare eficiență a coloanei se realizează prin introducerea a 10~ 5 -10~ 6 g de substanță dizolvată la 1 g de sorbent. La introducerea unor cantități mari de probă, dependența de înălțimea vârfului la sarcină se poate dovedi a fi neliniară și este necesară o evaluare cantitativă a zonelor de vârf.

Erorile asociate cu detectarea sau amplificarea duc la o distorsiune semnificativă a rezultatelor separării cromatografice. Fiecare detector se caracterizează prin specificitate, liniaritate și sensibilitate. Testarea selectivității este deosebit de importantă atunci când se analizează urmele de impurități. Răspunsul detectorilor UV poate varia cu un factor de 104 la substanțe cu grupe funcționale similare. Este necesar să se calibreze răspunsul detectorului pentru fiecare analit. Desigur, substanțele care nu se absoarbe în regiunea UV nu vor da un semnal înregistratorului atunci când sunt utilizate ca detector fotometru. Când utilizați un refractometru, pot apărea vârfuri negative. In plus, acest detector trebuie sa fie termostatat, ceea ce nu este necesar pentru detectorul UV.

Linearitatea detectorului determină dimensiunea probei injectate. Este important să ne amintim că debitul coloanei, temperaturile coloanei și detectorului și designul detectorului afectează toate precizia analizei cantitative. Erorile în transmiterea unui semnal electric către un dispozitiv de ieșire (recorder), integrator sau computer pot apărea din cauza inducției de zgomot, lipsă de împământare, fluctuații de tensiune în rețea etc.

4.2. MĂSURAREA AREA SAU A ÎNĂLȚIMII DE Vârf

Înălțimea vârfului h (Fig. 10.1) este distanța de la vârful vârfului până la linia de bază, se măsoară liniar sau prin numărarea numărului de diviziuni pe un înregistrator. Unii integratori electronici și calculatoare oferă informații despre înălțimile de vârf. Poziția liniei de bază a vârfurilor deplasate este găsită prin interpolarea valorilor ordonatelor corespunzătoare începutului și sfârșitului vârfului (vârf). 1 și 3 vezi fig. 10.1). Pentru a îmbunătăți acuratețea, este necesar să existe o linie de bază plată și stabilă. În cazul vârfurilor nedivizate, linia de bază este trasată între începutul și sfârșitul vârfului, mai degrabă decât înlocuită cu o linie zero. Deoarece înălțimile vârfurilor depind mai puțin de influența vârfurilor suprapuse adiacente, estimarea înălțimii vârfurilor este mai precisă și este aproape întotdeauna utilizată în analiza urmelor.

Zona de vârf poate fi determinată în diferite moduri. Să ne uităm la unele dintre ele.

1. Metoda planimetrică implică trasarea vârfului cu un planimetru de mână, care este un dispozitiv care determină mecanic aria vârfului. Metoda este precisă, dar necesită forță de muncă și puțin reproductibilă. Această metodă nu este recomandată.

2. Metoda siluetei de hârtie - vârful este decupat și cântărit. Metoda este foarte reproductibilă, dar necesită multă muncă, iar cromatograma este distrusă. Aplicabilitatea sa depinde de uniformitatea benzii de diagramă. De asemenea, metoda nu poate fi recomandată pe scară largă.

4. Metoda triangulației constă în construirea unui triunghi desenând tangente la laturile vârfului. Vârful triunghiului este mai înalt decât vârful vârfului. Creșterea ariei formate de acest vârf extins va fi consecventă pe tot parcursul cromatogramei și nu va afecta foarte mult precizia. În plus, o anumită zonă pierdută la desenarea tangentelor va fi compensată. Baza triunghiului este determinată de intersecția tangentelor cu linia de bază, iar aria este determinată de produsul dintre 7 g de bază și înălțime. Această metodă este cea mai bună pentru a determina zonele vârfurilor asimetrice. Cu toate acestea, reproductibilitatea la construirea tangentelor de către diferiți operatori este diferită și, prin urmare; scăzut.

5. Metoda de integrare a discurilor se bazează pe un dispozitiv electromecanic atașat la un recorder. Stiloul atașat la integrator se deplasează de-a lungul unei benzi din partea de jos a benzii cu o viteză proporțională cu mișcarea stiloului înregistrator.

Ca și în cazul măsurătorilor manuale, vârful ar trebui să rămână pe scara înregistratorului, dar ajustările pentru a compensa deplasările liniei de bază și separarea incompletă a vârfurilor adiacente reduc fiabilitatea și măresc timpul de analiză.

Metoda este mai precisă decât metodele de măsurare manuală, în special pentru vârfurile asimetrice, și oferă un avantaj de viteză. În plus, oferă o înregistrare cantitativă permanentă a analizei.

6. Metodele care utilizează integratori electronici care determină zona de vârf și imprimă informații despre acea zonă și timpii de retenție pot include corecția deplasării liniei de bază și determină zona vârfurilor doar parțial rezolvate. Principalele avantaje sunt precizia, viteza, independența de acțiune față de funcționarea reportofonului. Integratorii au memorie și pot fi programați pentru o analiză specifică folosind un program preinstalat. Avantajele integratorului includ capacitatea sa de a utiliza factori de corecție pentru răspunsul detectorului atunci când se recalculează datele originale pe zonele de vârf, compensând diferențele de sensibilitate a detectorului la diferite substanțe. Astfel de sisteme economisesc timp, îmbunătățesc acuratețea analitică și sunt utile pentru analiza analitică de rutină.

7. În cromatografia lichidă, calculatoarele sunt utilizate pe scară largă pentru a măsura zonele de vârf. Ei imprimă un mesaj complet, inclusiv numele substanțelor, zonele de vârf, timpii de retenție, factorii de corecție a răspunsului detectorului și abundența (% în greutate) pentru diferitele componente ale probei.