Ovisnost brzine enzimske reakcije o temperaturi. Kinetika enzimskih reakcija Ovisnost brzine enzimske reakcije o količini enzima

KINETIKA ENZIMSKE REAKCIJE

proučava obrasce protoka enzimskih p-cija u vremenu, kao i njihov mehanizam; poglavlje kemijska kinetika.

katalitički ciklus pretvorbe in-va S (supstrata) u produkt P pod djelovanjem enzima E teče stvaranjem međuprodukta. spoj x i:

gdje ki- konstante brzine pojedinih osnovnih stupnjeva, stvaranje kompleksa enzim-supstrat X 1 (ES, Michaelisov kompleks).

Pri danom t-re, brzina p-tiona ovisi o koncentraciji enzima, supstrata i sastavu medija. Postoje stacionarne, pretstacionarne i relaksacijske kinetike enzimskih p-cija.

Stacionarna kinetika. U stacionarnom stanju na srednjem Comm. (dX i/dt= 0, i = 1, ..., n) i s viškom supstrata, gdje su [S] 0 i [E] 0 početne koncentracije, redom. supstrata i enzima, kinetiku procesa karakterizira konstantna, vremenski nepromjenjiva razina koncentracija između. komp., i izraz za brzinu procesa v 0 , pozvan početna stacionarna brzina, ima oblik (Michaelis-Mentenova jednadžba):

(1)

gdje su vrijednosti k kat i K m -> funkcije konstanti brzine elementarnih stupnjeva i dane su jednadžbama:

Vrijednost k kat pozvao učinkovit katalizator. konstanta brzine procesa, parametar K m -> Michaelisova konstanta. Vrijednost k kat određena količinama maks. spore faze katalitičke. okruzi i katkad zvali. broj okretaja enzima (enzimski sustav); k mačka karakterizira broj katalitičkih. ciklusi koje enzimski sustav izvodi u jedinici vremena. Naib. uobičajena, koja ima vrijednost k kat. za specifične. supstrati u rasponu od 10 2 -10 3 s -1 . Tipične vrijednosti Michaelisove konstante leže u rasponu od 10 -3 - 10 -4 M.

Pri visokim koncentracijama supstrata, kada je to, brzina p-cije ne ovisi o koncentraciji supstrata i doseže konstantnu vrijednost, tzv. Maks. ubrzati. Grafički, Michaelis-Menten jednadžba je hiperbola. Može se linearizirati metodom dvostrukih recipročnih vrijednosti (Lineweaver-Burk metoda), tj. izgradnjom ovisnosti 1/v o 1/[S] 0, ili drugim metodama. Linearni oblik jednadžbe (1) ima oblik:

(2)

Omogućuje vam grafički određivanje vrijednosti K m i v max (slika 1).

Riža. 1. Grafikon linearne transformacije Michaelis - Mentenove jednadžbe u dvostrukim recipročnim vrijednostima (prema Lineweaveru - Burkeu).

Vrijednost K m > brojčano jednak koncentraciji supstrata, pri kojoj je stopa p-cije jednaka, dakle K mčesto služi kao mjera afiniteta supstrata i enzima, ali to vrijedi samo ako

Količine K m > i mijenjaju ovisno o pH vrijednostima. To je zbog sposobnosti skupina molekula enzima uključenih u katalizu da promijene svoje stanje ionizacije, a time i svoje katalitičko stanje. učinkovitosti. U najjednostavnijem slučaju, promjena pH dovodi do protonacije ili deprotonacije najmanje dvije ionizirajuće skupine enzima uključenih u katalizu. Ako se u ovom slučaju samo jedan oblik kompleksa enzim-supstrat (na primjer, ESH) od tri moguća (ES, ESH i ESH 2) može pretvoriti u produkt otopine, tada se opisuje ovisnost brzine o pH po f-loy:

gdje f= 1 + / i f" = 1 + +K" b/>-T. pozvao pH-funkcije Michaelisa, i K a, K b i K" a, K" b -> grupne ionizacijske konstante a i b, redom. besplatno enzim i kompleks enzim-supstrat. U lg koordinatama - pH ova ovisnost prikazana je na sl. 2, a tangente nagiba tangenti na uzlaznu, o pH neovisnu i silaznu granu krivulje trebaju biti +1, 0, odnosno -1. Iz takvog grafa mogu se odrediti vrijednosti RK a skupine uključene u katalizu.

Riža. 2. Ovisnost katalitičkog konstante od pH do logaritamske. koordinate.

Brzina enzimskog p-cija nije uvijek podložna jednadžbi (1). Jedan od najčešćih slučajeva - sudjelovanje u okrugu alosterije. enzimi (vidi regulatori enzima) za to-rykh ovisnost stupnja zasićenosti enzima o [S] 0 je nehiperbolična. karakter (slika 3). Ovaj fenomen je posljedica kooperativnosti vezanja supstrata, tj. kada vezanje supstrata na jedno od mjesta makromolekule enzima povećava (pozitivna kooperativnost) ili smanjuje (negativna kooperativnost) afinitet za supstrat drugog mjesta.

Riža. H Ovisnost stupnja zasićenosti enzima supstratom o koncentraciji supstrata s pozitivnom (I) i negativnom (II) kooperativnošću, kao iu njegovoj odsutnosti (III).

Prestacionarna kinetika. Brzim miješanjem otopina enzima i supstrata u vremenskom intervalu od 10 -6 -10 -1 s mogu se uočiti prolazni procesi koji prethode nastanku stabilnog stacionarnog stanja. U ovom predstacionarnom načinu rada, kada se koristi veliki višak supstrata, diferencijalni sustav. ur-cija, koja opisuje kinetiku procesa, je linearna. Rješenje ovog tipa sustava linearnih diferencijala. ur-cija je dana zbrojem eksponencijalnih članova. Dakle, za kinetiku gore prikazana shema, kinetika akumulacije proizvoda ima oblik:

gdje ja ->, b i n -> funkcije elementarnih konstanti brzine; -korijeni odgovarajuće karakteristike. ur-cija.

Recipročno od , tzv. karakterističan vrijeme obrade:

Za p-ciju, koja teče uz sudjelovanje niintermediate. Comm., možete dobiti karakteristiku. puta.

Proučavanje kinetike enzimskog okruga u predstacionarnom načinu rada omogućuje vam da dobijete ideju o detaljnom mehanizmu katalitičkog djelovanja. ciklus i odrediti konstante brzine elementarnih faza procesa.

Eksperimentalno se proučava kinetika enzimske otopine u predstacionarnom načinu rada metodom zaustavljenog mlaza (vidi Sl. kinetičke metode mlaza), dopuštajući miješanje komponenti distrikta unutar 1 ms.

Kinetika opuštanja. Uz brzi perturbirajući učinak na sustav (promjene t-ry, tlaka, električnih polja), vrijeme potrebno da sustav postigne novo ravnotežno ili stacionarno stanje ovisi o brzini procesa koji određuju katalitičko. enzimski ciklus.

Sustav jednadžbi koji opisuju kinetiku procesa je linearan ako je pomak od ravnotežnog položaja mali. Rješenje sustava dovodi do ovisnosti koncentracija komponenti razg. faze procesa u obliku zbroja eksponencijalnih članova, čiji eksponenti imaju karakter vremena relaksacije. Rezultat istraživanja je spektar vremena opuštanja koji odgovara broju intervala. Komunikacija uključena u proces. Vremena relaksacije ovise o konstantama brzine elementarnih faza procesa.

Metode opuštanja kinetika omogućuje određivanje konstanti brzine pojedinih elementarnih stupnjeva transformacije međuprodukta. Metode za proučavanje kinetike relaksacije su različite. rezolucija: apsorpcija ultrazvuka - 10 -6 -10 -10 s, temperaturni skok - 1O -4 -10 -6 s, električna metoda. impuls - 10 -4 -10 -6 s, skok pritiska - 10 -2 s. U proučavanju kinetike enzimskih p-cija primjena je pronađena metodom temperaturnog skoka.

Makrokinetika enzimskih procesa. Razvoj metoda za dobivanje heterogenih katalizatora imobilizacijom enzima na dekomp. mediji (vidi Imobilizirani enzimi) zahtijevala je analizu kinetike procesa uzimajući u obzir prijenos mase supstrata. Pravilnosti kinetike p-cija proučavane su teorijski i eksperimentalno, uzimajući u obzir učinke difuzijskog sloja i za sustave s intradifuzijskim poteškoćama u raspodjeli enzima unutar nosača.

U uvjetima u kojima na kinetiku procesa utječe difuzijski prijenos supstrata, katalitički. učinkovitost sustava se smanjuje. Faktor učinkovitosti jednak je omjeru gustoće protoka proizvoda u uvjetima strujanja enzimskog okruga s koncentracijom supstrata smanjene difuzijom prema protoku, što bi se moglo ostvariti u odsutnosti difuzijskih ograničenja. U čisto difuzijskom području, kada je brzina procesa određena prijenosom mase supstrata, faktor učinkovitosti za sustave s vanjskom inhibicijom difuzije obrnuto je proporcionalan modulu difuzije:

gdje debljina difuzijskog sloja, D - koeficijent. difuzija supstrata.

Za sustave s intradifuzijskim usporavanjem u p-cijama prvog reda

gdje je f T- bezdimenzionalni modul (Thiele modul).

Pri analizi kinetičke pravilnosti u reaktorima fermentacije širok teorijski. i eksperimentirati. Razvijeni su "idealni" modeli reaktora, protočni reaktor (protočni reaktor idealnog miješanja), protočni reaktor idealnog pomaka i membranski reaktor.

Kinetika polienzimskih procesa. U tijelu (stanici) enzimi ne djeluju izolirano, već kataliziraju lance transformacije molekula. R-cija u polienzimskim sustavima s kinetičkim. gledišta se mogu smatrati dosljednima. procesi, specifični Značajka to-rykha su enzimi svake od faza:

gdje , odn. max, brzina procesa i Michaelisova konstanta i etapa okruga, odnosno.

Važna značajka procesa je mogućnost formiranja stabilnog stacionarnog stanja. Uvjet za njegovu pojavu može biti nejednakost > v 0 , gdje je v 0 brzina granične faze, koju karakterizira najmanja konstanta brzine i time određuje brzinu cijelog niza. postupak. U stacionarnom stanju, koncentracija metabolita nakon graničnog stupnja manja je od Michaelisove konstante odgovarajućeg enzima.

Specifično skupinu polienzimskih sustava čine sustavi koji provode oksidirajuće.-obnavljanje. p-cija uz sudjelovanje proteinskih nosača elektrona. Nositelji oblik specifični. strukture, kompleksi s determinističkim slijedom prijenosa elektrona. Kinetički opis takvih sustava smatra se nezavisnom varijablom stanja sklopova s ​​dekomp. stupanj naseljenosti elektrona.

Primjena. F. r. naširoko koristi u istraživačkoj praksi za proučavanje mehanizama djelovanja enzima i enzimskih sustava. Praktično značajno područje enzimske znanosti je inženjerska enzimologija, operira konceptima F. r. do. za optimizaciju biotehnologije. procesa.

Lit.: Poltorak O. M., Chukhrai E. S., Fizičke i kemijske osnove enzimske katalize, M., 1971; Berezin IV, Martinek K, Osnove fizikalne kemije enzimske katalize, M., 1977; Varfolomeev S. D., Zaitsev S. V., Kinetičke metode u biokemijskim istraživanjima, M .. 1982. S. D. Varfolomejev.

Kemijska enciklopedija. - M.: Sovjetska enciklopedija. Ed. I. L. Knunyants. 1988 .

Pogledajte što je "KINETIKA ENZIMATIVNE REAKCIJE" u drugim rječnicima:

katalitički rcija ciklički. proces koji se sastoji od niza elementarnih obroka, čije su brzine opisane važećim zakonom mase. Ovaj zakon ima jednostavan oblik za idealne mješavine plinova, idealne p jarke i idealne površinske slojeve. Kemijska enciklopedija

Kinetika kemijskih reakcija, nauk o kemijskim procesima, zakoni njihova tijeka u vremenu, brzinama i mehanizmima. Najvažnija područja moderne kemije i kemije ... ... povezana su s proučavanjem kinetike kemijskih reakcija. Velika sovjetska enciklopedija

KINETIKA KEMIJSKA- (od grč. kinesis pokret), odjel za teorijsku kemiju posvećen proučavanju zakona kemije. reakcije. Postoji nekoliko vrsta kem. interakcije i, prije svega, razlikovati reakcije koje se odvijaju u homogenom (homogenom) mediju od reakcija koje ... ... Velika medicinska enciklopedija

- (biokataliza), ubrzanje biokem. obroci uz sudjelovanje proteinskih makromolekula zvanih enzimi (enzimi). F. do. svojevrsna kataliza, iako je pojam fermentacija (fermentacija) poznat od davnina, kada nije postojao pojam kemijskog. kataliza. Prvo… … Kemijska enciklopedija

- (od latinskog re prefix, što znači obrnuto djelovanje, i actio djelovanje), transformacija jednih in in (početni spojevi) u druge (proizvode reakcije) uz nepromjenjivost jezgri atoma (za razliku od nuklearnih reakcija). Početne veze u R. x. ponekad se zove ... ... Kemijska enciklopedija

- (od lat. fermentum kvasac) (enzimi), proteini koji djeluju kao katalizatori u živim organizmima. Glavni funkcije F. ubrzati transformaciju u, ulazak u tijelo i formiran tijekom metabolizma (obnoviti stanične strukture, osigurati to ... Kemijska enciklopedija

- (od grč. pharmakon medicina i kinetikos pokretanje), proučava kinetiku. obrasci procesa koji se odvijaju s lek. cfd u tijelu. Glavni farmakokinetički. procesi: apsorpcija, distribucija, metabolizam i izlučivanje (izlučivanje). ... ... Kemijska enciklopedija

Pri t=36-38 0 enzimi imaju najveću aktivnost. Ova temperatura se naziva temperaturnim optimumom:

Povećanjem t 0 do optimalnog povećava se aktivnost enzima.

Visok t uzrokuje denaturaciju enzima.

Nizak t smanjuje aktivnost enzima.

Promjena t 0 dovodi do prekida veza koje fiksiraju proteinsku strukturu enzima (tercijarni, kvarterni), t.j. uzrokuje denaturaciju.

Reverzibilna denaturacija se opaža sa smanjenjem t 0 . To vam omogućuje pohranjivanje enzima, tjelesnih tekućina, krvi.

Povećanje temperature nepovratno remeti proteinsku strukturu enzima. Ovo svojstvo koristi se u sterilizaciji materijala i instrumenata.

Groznica je zaštitno svojstvo tijela, jer. dolazi do denaturacije enzima mikroorganizama i stoga je neprikladno koristiti antipiretike.

Ovisnost brzine reakcije o pH

Na grafu ova ovisnost izgleda kao zvono. Na vrhu krivulje nalazi se pH optimalna točka u kojoj enzim ima najveću aktivnost. pH utječe na stupanj ionizacije kiselih i bazičnih skupina. Pri različitim pH vrijednostima aktivno središte može biti u djelomično ioniziranom ili neioniziranom obliku, što utječe na tercijarnu strukturu aktivnog centra i stvaranje kompleksa enzim-supstrat.

Utjecaj pH.

Enzimi, kao i svi proteini, sadrže mnoge pozitivno i negativno inficirane skupine (-NH 2 , -COOH), koje su dio aminokiselina arg, lys, asp i glu. Ukupna naknada ovisi o omjeru između ovih skupina. Naboj proteina-enzima mijenja se ovisno o koncentraciji vodikovih iona u stanici, koji neutraliziraju (suzbijaju disocijaciju) karboksilne skupine:

i formiraju pozitivno nabijene skupine:

Dakle, povećanje pozitivnog naboja ili smanjenje negativnog naboja na površini enzima nastaje zbog povećanja koncentracije vodikovih iona.

Stanje proteinske molekule u kojem je ukupni naboj proteina 0 naziva se izoelektrično stanje.

pH vrijednost pri kojoj je naboj proteinske molekule 0 naziva se izoelektrična točka (IEP).

Većina enzima je najaktivnija i najstabilnija oko izoelektrične točke.

Oštre fluktuacije u pH pospješuju denaturaciju proteina, t.j. smanjenje enzimske aktivnosti.

pH vrijednost pri kojoj enzim pokazuje maksimalnu aktivnost naziva se pH optimumom, koji je karakterističan za dani enzim koji reagira s određenim supstratom.

Unutarstanični enzimi obično imaju optimalni pH koji odgovara neutralnom okruženju (pH = 7) blizu normalnoj pH vrijednosti za tjelesne tekućine. Postoje enzimi čiji je optimalni pH u jako kiseloj i jako alkalnoj sredini.

Klasifikacija enzima.

Postoji šest klasa enzima:

1. Hidrolaze – enzimi koji razgrađuju supstrat uz sudjelovanje molekula vode.

2. Liaze – enzimi koji razgrađuju molekule supstrata bez sudjelovanja vode, pri čemu često nastaju proizvodi male molekularne mase – CO 2, NH 3, H 2 O.

3. Izomeraze – enzimi koji uzrokuju izomerne transformacije u molekuli.

4. Feraze (transferaze) – enzimi koji prenose skupine s jedne molekule na drugu ili s jednog položaja na drugi unutar jedne molekule.

5. Oksidoreduktaze - enzimi koji kataliziraju prijenos protona i elektrona (tj. redoks reakcije).

6. Ligaze (sintetaze) – enzimi koji kataliziraju sintezu velikih molekula iz manjih.

Nomenklatura enzima.

Radni naziv enzima sastoji se od naziva supstrata, vrste katalizirane reakcije i završetka -aza.

Sustavni naziv sastoji se od naziva supstrata, naziva vrste katalizirane kemijske transformacije i završetka -aza.

Naziv klase označava vrstu kemijske reakcije koju kataliziraju enzimi. Klase se dijele na podrazrede - specificira djelovanje enzima, jer ukazuje na prirodu kemijske skupine supstrata napadnutog enzimom. Potklasa je podijeljena na podrazrede. Podrazrede specificiraju djelovanje enzima, specificirajući prirodu napadnute veze supstrata ili prirodu akceptora.

I. Oksidoreduktaze kataliziraju redoks reakcije. Oksidoreduktaze se također nazivaju dehidrogenazama ili reduktazama. Oksidoreduktaze nose protone i elektrone. Oksidoreduktaze se dijele u podklase:

1. Aerobne dehidrogenaze – prenose protone i elektrone na kisik.

Koenzimi oksidoreduktaza su:

NAD – nikotinamid adenin dinukleotid – sadrži vitamin B 5 – nikotinamid.

NADP - nikotinamid adenin dinukleotid fosfat, sadrži vitamin B 5.

FAD - flavin adenin dinukleotid, sadrži vitamin B 2 - riboflavin.

FMN - flavin mononukleotid, sadrži vitamin B 2 - riboflavin.

Oksidoreduktaze kataliziraju reakcije dehidrogenacije, t.j. eliminacija vodika.

Oksidoreduktaze oksidiraju sljedeće funkcionalne skupine:

OH, -C \u003d O, -NH2

Koenzimi dehidrogenaze vežu protone i elektrone.

NAD-ovisne dehidrogenaze oksidiraju sljedeće funkcionalne skupine: alkohol hidroksil (OH), aldehidnu skupinu (COH), amino skupinu (NH 2).

NAD-ovisne dehidrogenaze kataliziraju sljedeće vrste reakcija:

1. Dehidrogenacija hidroksilnih skupina

| laktat dehidrogenaza |

COOH PREKO + NADH + H + CH 3

laktat piruvat

Mliječna kiselina

2. Dehidrogenacija aldehidnih skupina (dehidrogenacija gliceraldehida - 3 - fosfata)

| + PREKO + + H 3 RO 4 | + NADH + H +

CH 2 OPO 3 H 2 CH 2 OPO 3 H 2

Gliceraldehid-3-fosfat 1,3-bifosfoglicerinska kiselina

3. Dehidrogenacija amino skupina

UNSD UNSD

CH 2 + PREKO CH 2

| | + NADH + H +

CH 2 glutamat dehidrogenaza CH 2

Glutaminska kiselina

FAD - ovisne dehidrogenaze oksidiraju (dehidrogeniraju) sljedeće funkcionalne skupine: eliminacija vodika iz skupina -CH 2 - CH 2 - uz stvaranje dvostruke veze.

UNSD UNSD

| FADH FADN 2 |

CH 2 sukcinat dehidrogenaza CH

UNSD UNSD

Sukcinat fumarat

2. Anaerobne dehidrogenaze prenose protone i elektrone ne na kisik, nego na neki drugi supstrat. Ovi enzimi se također nazivaju oksigenaze.

II. Transferaze su enzimi koji kataliziraju prijenos različitih skupina s jednog supstrata na drugi.

Podklase transferaze:

1. Aminotransferaze provode prijenos amino skupine iz aminokiseline u keto kiselinu. Katalizirati reakciju transaminacije.

2. Metiltransferaze kataliziraju prijenos metilnih skupina (CH 3 -).

3. Fosfotransferaze kataliziraju prijenos ostatka fosforne kiseline. Potklasa fosfotransferaza uključuje kinaze koje koriste ATP kao donor fosfatnih ostataka.

III. Liaze su enzimi koji kataliziraju kidanje C-O, C-C, C-N i drugih veza, kao i reverzibilne reakcije cijepanja različitih skupina, bez sudjelovanja vode.

1. Karboksilaza - adicija karboksilne skupine (CO 2).

2. Dehidrataza – uklanjanje molekule vode sa supstrata.

3. Aldolaze – cijepaju C-C vezu.

4. Hidrataze - enzimi vode na dvostrukoj vezi.

IV. Izomeraze su enzimi koji kataliziraju transformaciju unutar jedne molekule.

Katalizirati reakcije izomerizacije. Podklase: mutaze, tautomeraze, racemaze, epimeraze, izomeraze.

V. Hidralaze su enzimi koji kataliziraju razbijanje veza u prisutnosti vode.

VI. Ligaze (sintetaze) su enzimi koji kataliziraju spajanje dviju molekula koristeći energiju ATP fosfatne veze.

Utjecaj niskomolekularnih tvari na djelovanje enzima.

Tvari male molekularne težine koje mijenjaju brzinu enzimskih reakcija dijele se u 2 skupine:

1. Aktivatori – ubrzavaju tijek enzimske reakcije.

2. Inhibitori – usporavaju tijek enzimskih reakcija.

Aktivatori su podijeljeni u 2 grupe:

1. Može djelovati kao aktivator koenzima ili prostetske skupine(uglavnom vitamini).

Ovu skupinu karakteriziraju isti obrasci koji su opisani za interakciju enzima i supstrata F+S i A+Ko podliježu istim obrascima

K m određuje koliko treba unijeti Ko.

2. Aktivatori koji su poveznica između F i S (orijentacija enzima i supstrata) i osiguravaju interakciju enzima i supstrata (F A S), interakciju apoenzima i kofaktora Apof A Ko

Često su to ioni Me-Co, Mn, Mg, Zn.

Značaj inhibicije aktivnosti enzima.

1. Inhibicija je u osnovi djelovanja lijekova i toksičnih sredstava.

2. Inhibicija je jedan od pristupa proučavanju enzimskog djelovanja (na primjer, strukture aktivnog centra).

Inhibicija je 2 vrste:

1. Nepovratan

2. Reverzibilni

Ireverzibilna inhibicija nastaje kada je vezanje inhibitora na enzim ireverzibilno.

Na primjer: to je djelovanje alkilirajućih sredstava (podacetamida) koji nepovratno djeluju na tio skupinu enzima. Nepovratnost je posljedica činjenice da je ravnoteža pomaknuta udesno, prema stvaranju kovalentnog derivata enzima:

F-S-H + J-CH 2 CONH 2 F-S-CH 2 -CONH 2 + HJ

Djelovanje toksičnih organofosfornih spojeva, koji se nazivaju živčani otrovi, je nepovratno, oni inhibiraju acetilkolinesterazu, koja je uključena u prijenos živčanih impulsa.

nepovratna inhibicija

Mnogi inhibitori se nepovratno vežu na E ili ES, a budući da to utječe na Vmax, ova se inhibicija smatra nekonkurentnom.

Inhibitori ovog tipa često se kovalentno vežu na enzim ili na kompleks enzim-supstrat, nepovratno mijenjajući nativnu konfiguraciju. To objašnjava toksični učinak spojeva Hg 2+, Pb 2+ i arsena.

Djelovanje penicilina temelji se na nepovratnoj inhibiciji. Penicilin inhibira djelovanje jednog od enzima uključenih u sastavljanje bakterijske stanične stijenke. Stanice koje nemaju staničnu stijenku lako se liziraju.

Djelovanje aspirina temelji se na kovalentnoj modifikaciji enzima. Aspirin smanjuje brzinu sinteze prostaglandina, djelujući kao inhibitor komponente ciklooksigenaze endoperoksid sintetaze. Smatra se da je pojava boli, upale, temperature povezana s prostaglandinima.

U slučaju intoksikacije, vezanje otrova ili njegovo istiskivanje iz enzimsko-inhibitornog kompleksa moguće je uz pomoć reaktivatora, odnosno antidota. To uključuje sve kompleksone koji sadrže SH (cistein, dimerkaptopropanol), limunsku kiselinu.

Reverzibilna inhibicija ima 2 vrste:

1. Natjecateljski

2. Nekonkurentni

Reverzibilna kompetitivna inhibicija – aktivnost enzima se obnavlja nakon uklanjanja inhibitora povećanjem koncentracije supstrata.

Posebnost kompetitivnog inhibitora je da je kompetitivni inhibitor po strukturi sličan supstratu. Kompetitivni inhibitor natječe se sa supstratom za aktivno mjesto enzima.

Primjer: sukcinat dehidrogenaza katalizira pretvorbu sukcinata u fumarat. Kompetitivni inhibitor sukcinat dehidrogenaze je malonska kiselina, koja sadrži jednu CH2 skupinu manje od sukcinata.

COOH COOH COOH

CH 2 CH CH 2

CH 2 CH COOH

| | malonska kiselina

UNSD UNSD

Sukcinat i malonska kiselina su strukturni analozi i natječu se za aktivno mjesto enzima. (Ovo je potvrda da aktivno mjesto nije kruta formacija, prikladna za podlogu, poput "ključ-brave".)

Kod kompetitivne inhibicije stupanj inhibicije enzima ne ovisi o apsolutnoj koncentraciji inhibitora, već o omjeru inhibitora i supstrata, ako je taj omjer J:S=1:50, tada aktivnost enzima inhibira 50%.

Djelovanje kompetitivnog inhibitora otklanja se povećanjem koncentracije supstrata, budući da je afinitet enzima i supstrata veći od afiniteta enzima i inhibitora.

Km F i S i Km F i J su različiti i to je poznato po crtanju Michaelis-Mentena i Lineever-Burka

Vmax - isto

K m raste s inhibitorom.

Djelovanje mnogih kemoterapeutskih sredstava temelji se na kompetitivnoj inhibiciji. Na primjer, sulfanilamidni pripravci koji se koriste za liječenje bolesti uzrokovanih mikrobnim infekcijama. Sulfanilamidni pripravci strukturno su slični p-aminobenzovoj kiselini. PABA je prekursor u mikrobiološkoj sintezi folne kiseline iz koje je koenzim neophodan za sintezu nukleinskih kiselina mikroorganizama. Uvođenjem sulfanilamidnih pripravaka uočava se inhibicija enzima i smrt mikroorganizama.

Primjena fluorouracila, koji se koristi u liječenju raka, također se temelji na kompetitivnoj inhibiciji.

Nekonkurentna, reverzibilna inhibicija.

Djelovanje nekompetitivnog inhibitora ne može se eliminirati povećanjem koncentracije supstrata.

Nekompetitivni inhibitor ne veže se na aktivno mjesto, može se vezati na slobodni enzim, ili na FS kompleks, ili oboje, ali su oba oblika JF i JFS neaktivna.

K m - ne mijenja se, jer nema vezanja na aktivnom mjestu.

Vmax - smanjuje se.

Najčešći tip nekonkurentne inhibicije javlja se pod djelovanjem reagensa koji reverzibilno vežu SH-skupine cis-a smještene u katalitičkom centru ili blizu njega. To su ioni Cu 2+, Hg 2+, Ag + i njihovi derivati ​​s stvaranjem merkaptida:

Enzimi koji zahtijevaju Me ione za aktivaciju inhibiraju se na ovaj način sredstvima koja vežu ove ione:

fero ili ferocijanid.

Regulacija aktivnosti enzima.

Primjena enzima u farmaciji, medicini.

Vrste regulacije aktivnosti enzima:

1. Alosterična modifikacija.

2. Aktivacija zimogena.

3. Regulacija kemijskom modifikacijom.

Kraj rada -

Ova tema pripada:

Struktura, svojstva i funkcije proteina

Razjašnjavanje strukture proteina jedan je od glavnih problema moderne biokemije.. Proteinske molekule su visokomolekularni spojevi.. Većina proteina ima razinu organizacije strukture proteinske molekule..

Ako vam je potreban dodatni materijal na ovu temu, ili niste pronašli ono što ste tražili, preporučujemo pretragu u našoj bazi radova:

Što ćemo s primljenim materijalom:

Ako vam se ovaj materijal pokazao korisnim, možete ga spremiti na svoju stranicu na društvenim mrežama:

PREDMETNI RAD

Kinetika enzimskih reakcija

Uvod

Temelj života svakog organizma su kemijski procesi. Gotovo sve reakcije u živom organizmu odvijaju se uz sudjelovanje prirodnih biokatalizatora - enzima.

Berzelius je 1835. prvi put sugerirao da se reakcije živog organizma provode zahvaljujući novoj sili, koju je nazvao "katalitičkom". Tu ideju je potkrijepio uglavnom eksperimentalnim opažanjem: dijastaza iz krumpira hidrolizira škrob brže od sumporne kiseline. Već 1878. Kuhne je tvar koja ima katalitičku moć u živom organizmu nazvao enzimom.

Kinetika djelovanja enzima je grana enzimskog proučavanja koja proučava ovisnost brzine reakcije koju kataliziraju enzimi o kemijskoj prirodi i uvjetima interakcije supstrata s enzimom, kao i o čimbenicima okoliša. Drugim riječima, kinetika enzima omogućuje razumijevanje prirode molekularnih mehanizama djelovanja čimbenika koji utječu na brzinu enzimske katalize. Ovaj odjeljak nastao je na sjecištu takvih znanosti kao što su biokemija, fizika i matematika. Najraniji pokušaj matematičkog opisivanja enzimskih reakcija napravio je Duclos 1898. godine.

Zapravo, ovaj dio o proučavanju enzima vrlo je važan u naše vrijeme, naime za praktičnu medicinu. Farmakolozima daje alat za promjenu staničnog metabolizma, ogroman broj lijekova i raznih otrova – to su inhibitori enzima.

Svrha ovog rada je razmotriti pitanje ovisnosti brzine reakcije o različitim čimbenicima, kako se brzina reakcije može kontrolirati i kako se može odrediti.

1. Michaelis-Menten kinetika

Preliminarni pokusi na proučavanju kinetike enzimskih reakcija pokazali su da brzina reakcije, suprotno teoretskim očekivanjima, ne ovisi o koncentraciji enzima (E) i supstrata (S) na isti način kao u slučaju konvencionalnog reakcija drugog reda.

Brown i, neovisno o njemu, Henri prvi su iznijeli hipotezu o stvaranju kompleksa enzim-supstrat tijekom reakcije. Zatim su ovu pretpostavku potvrdile tri eksperimentalne činjenice:

a) papain je tvorio netopivi spoj s fibrinom (Wurtz, 1880);

b) invertazni supstrat saharoza mogla bi zaštititi enzim od toplinske denaturacije (O'Sullivan i Thompson, 1890);

c) enzimi su se pokazali kao stereokemijski specifični katalizatori (Fischer, 1898-1899).

Uveli su koncept maksimalne brzine i to pokazali krivulja zasićenja(tj. ovisnost brzine reakcije o koncentraciji supstrata) je jednakokračna hiperbola. Dokazali su da je najveća promatrana brzina jedna od asimptota krivulje, a segment odsječen na osi apscise (u području njezinih negativnih vrijednosti) drugom asimptotom, t.j. konstanta u jednadžbi brzine, jednaka apsolutnoj vrijednosti koncentraciji supstrata potrebnoj za postizanje polovice najveće brzine.

Michaelis i Menten su sugerirali da je brzina reakcije određena razgradnjom ES kompleksa, t.j. konstanta k 2 . To je moguće samo pod uvjetom da je k 2 je najmanja od konstanti brzine. U ovom slučaju, ravnoteža između kompleksa enzim-supstrat, slobodnog enzima i supstrata uspostavlja se brzo u usporedbi sa brzinom reakcije (brza ravnoteža).

Početna brzina reakcije može se izraziti sljedećom formulom:

v = k2

Budući da je konstanta disocijacije kompleksa enzim-supstrat

K S \u003d [E] [S] / \u003d k -1 / k 1

tada se koncentracija slobodnog enzima može izraziti kao

[E]=K S / [S]

Ukupna koncentracija enzima u reakcijskoj smjesi određena je formulom

[E] t = [E] + [ES] = K S [ES] / [S] + [ES]

Reakcija doseže svoju maksimalnu brzinu kada je koncentracija supstrata dovoljno visoka tako da su sve molekule enzima u obliku ES kompleksa (beskonačno veliki višak supstrata). Omjer početne brzine i teoretski moguće najveće brzine jednak je omjeru [ES] prema [E] t:

v / V max = / [E] t = / (K S / [S] + ) = 1 / (K S + [S] +1)

Ovo je klasična jednadžba Michaelis i Menten, koji je od svoje objave 1913. desetljećima bio temeljno načelo svih enzimskih kinetičkih studija i, uz neka ograničenja, ostao do danas.

Kasnije se pokazalo da je izvorna Michaelis-Mentenova jednadžba imala nekoliko ograničenja. Pošteno je, tj. ispravno opisuje kinetiku reakcije koju katalizira ovaj enzim samo ako su ispunjeni svi sljedeći restriktivni uvjeti:

) nastaje kinetički stabilan kompleks enzim-supstrat;

) konstanta K S je konstanta disocijacije kompleksa enzim-supstrat: to je točno samo ako ;

) koncentracija supstrata se tijekom reakcije ne mijenja, t.j. koncentracija slobodnog supstrata jednaka je njegovoj početnoj koncentraciji;

) produkt reakcije se brzo odcijepi od enzima, t.j. ne formira se kinetički značajna količina ES kompleksa;

) druga faza reakcije je nepovratna; točnije, uzimamo u obzir samo početnu brzinu, kada se povratna reakcija (zbog stvarnog nedostatka proizvoda) još može zanemariti;

) samo jedna molekula supstrata veže se na svako aktivno mjesto enzima;

) za sve reaktante, njihove se koncentracije mogu koristiti umjesto aktivnosti.

Michaelis-Mentenova jednadžba služi kao početna točka za svaki kvantitativni opis djelovanja enzima. Treba naglasiti da je kinetičko ponašanje većine enzima puno kompliciranije nego što proizlazi iz idealizirane sheme na kojoj se temelji Michaelis-Menten jednadžba. U izvođenju ove jednadžbe pretpostavlja se da postoji samo jedan kompleks enzim-supstrat. U međuvremenu, u stvarnosti, u većini enzimskih reakcija nastaju barem dva ili tri takva kompleksa koji nastaju određenim slijedom.

Ovdje EZ označava kompleks koji odgovara pravom prijelaznom stanju, a EP označava kompleks između enzima i produkta reakcije. Također se može istaknuti da u većini enzimskih reakcija sudjeluje više od jednog supstrata i da nastaju dva ili više proizvoda. U reakciji s dva supstrata, S 1 i S 2 , mogu nastati tri kompleksa enzim-supstrat, i to ES 1 , ES 2 i ES 1 S 2 . Ako reakcija proizvede dva produkta, P 1 i P 2 , tada mogu postojati najmanje tri dodatna kompleksa EP 1 , EP 2 i EP 1 P 2 . U takvim reakcijama postoji mnogo međufaza, od kojih je svaki karakteriziran svojom konstantom brzine. Kinetička analiza enzimskih reakcija koje uključuju dva ili više reaktanata često je iznimno složena i zahtijeva korištenje elektroničkih računala. Međutim, kada se analizira kinetika svih enzimskih reakcija, početna točka je uvijek Michaelis-Mentenova jednadžba o kojoj smo gore govorili.

1.1 Priroda konstanteKu jednadžbi

jednadžba kinetika enzimske reakcije

Drugi postulat kaže da konstanta K S u jednadžbi je konstanta disocijacije kompleksa enzim-supstrat.

Briggs i Haldane su 1925. dokazali da izvorna Michaelis-Mentenova jednadžba vrijedi samo za , tj. kada se ravnoteža elementarnog stupnja E+S ES uspostavi vrlo brzo u usporedbi sa stopom sljedećeg stupnja. Stoga se takvi kinetički mehanizmi (poštivaju Michaelis-Menten početni uvjet i imaju jedan spori elementarni stupanj, u odnosu na koji se ravnoteže u svim ostalim elementarnim fazama brzo uspostavljaju) nazivaju zadovoljavanjem pretpostavke "brze ravnoteže". Ako je, međutim, k 2 po redu veličine usporediv s k -1 , promjena koncentracije kompleksa enzim-supstrat tijekom vremena može se izraziti sljedećom diferencijalnom jednadžbom:

d / dt \u003d k 1 [E] [S] - k -1 - k 2

Budući da razmatramo početnu brzinu reakcije, t.j. u trenutku kada se obrnuta reakcija još ne dogodi, a predstacionarni stupanj je već prošao, tada je zbog viška supstrata količina formiranog kompleksa enzim-supstrat jednaka količini razloženog ( princip stacionarnosti, ili kinetika Briggsa i Haldanea, ili Bodensteinov princip u kemijskoj kinetici) i istina je da

d/dt=0

Zamijenivši to u diferencijalnu jednadžbu, dobivamo izraz za koncentraciju slobodnog enzima:

[E] \u003d (k -1 + k 2) / k 1 [S]

[E] T = [E] + = [(k -1 + k 2) / k -1 [S] + 1] =

= (k -1 + k 2 + k -1 [S]) / k 1 [S]

Jednadžba stabilnog stanja:

K 1 [S] [E] T / (k -1 + k 2 + k 1 [S])

Jer v = k 2 , onda dobivamo to

v = k 1 k 2 [S] [E] T / (k -1 + k 2 + k 1 [S]) = k 2 [S] [E] T / [(k -1 + k 2) / k 1 + [S]]

U ovom slučaju

V max = k 2 [E] T

i jednaka je maksimalnoj brzini dobivenoj iz Michaelis-Mentenove jednadžbe. Međutim, konstanta u nazivniku Michaelis-Mentenove jednadžbe nije K S , oni. ne konstanta disocijacije kompleksa enzim-supstrat, nego tzv Michaelisova konstanta:

K m \u003d (k -1 + k 2) / k 1

K m je jednako K S samo ako je .

U slučaju da je konstanta u nazivniku jednadžbe brzine izražena formulom

K k \u003d k 2 / k 1

i zove se, prema Van Slykeu, kinetička konstanta.

Jednadžba stacionarnog stanja također se može dobiti iz diferencijalne jednadžbe bez pretpostavke da je d / dt = 0. Ako vrijednost [E] = [E] T - zamijenimo u diferencijalnu jednadžbu, nakon transformacija dobivamo

= (k 1 [S] [E] T - d / dt) / (k 1 [S] + k -1 + k 2)

Da bi se iz ove jednadžbe dobila jednadžba stacionarnog stanja, ona ne mora biti d / dt = 0. Dovoljno je da nejednakost d / dt<< k 1 [S] [E] T . Этим объясняется, почему можно достичь хорошего приближения в течение длительного времени при использовании принципа стационарности.

Diferencirana jednadžba stabilnog stanja izgleda ovako:

d / dt \u003d T / (k 1 [S] + k -1 + k 2) 2] (d [S] / dt)

Ovaj izraz očito nije jednak 0.

1.2 Transformacija Michaelis-Mentenove jednadžbe

Izvorna Michaelis-Mentenova jednadžba je hiperbolička jednadžba, gdje je jedna od konstanti (V max) asimptota krivulje. Druga konstanta (K m), čija je negativna vrijednost određena drugom asimptotom, jednaka je koncentraciji supstrata potrebnoj za postizanje V max / 2. To je lako provjeriti, budući da ako

v=Vmax / 2, dakle

Vmax / 2 = Vmax [S] / (Km + [S])

V max / V max = 1 = 2 [S] / (K m + [S]) m + [S] = 2 [S], tj. [S] = K m za v = V max /2.

Michaelis-Mentenova jednadžba može se algebarski transformirati u druge oblike koji su prikladniji za grafički prikaz eksperimentalnih podataka. Jedna od najčešćih transformacija je jednostavno izjednačiti recipročne vrijednosti lijeve i desne strane jednadžbe

Kao rezultat transformacije dobivamo izraz

koji nosi ime Lineweaver-Burk jednadžbe. Prema ovoj jednadžbi, graf ucrtan u koordinatama 1/[S] i 1/v je ravna linija čiji je nagib jednak K m /V max , a segment odsječen na y-osi jednak je do 1/V max. Takav dvostruki recipročni graf ima prednost što omogućuje preciznije određivanje V max; na krivulji ucrtanoj u koordinatama [S] i v, V max je asimptotska veličina i određena je mnogo manje točno. Odsječeni segment na x-osi na grafici Lineweaver-Burk jednak je -1/K m . Iz ovog grafikona također se mogu izvući vrijedne informacije o inhibiciji enzima.

Druga transformacija Michaelis-Menten jednadžbe je da se obje strane Lineweaver-Burk jednadžbe pomnože s V max *v i nakon nekih dodatnih transformacija dobivamo

Odgovarajući dijagram u koordinatama v i v/[S] predstavlja s e 4, sl. jedan]. Takav graf ( Edie-Hofstyjev grafikon) ne samo da olakšava određivanje vrijednosti V max i K m , već vam također omogućuje da identificirate moguća odstupanja od linearnosti koja nisu otkrivena na Lineweaver-Burk grafikonu.

Jednadžba se također može linearizirati u drugom obliku

[S] / v = K m / V max + [S] / V max

U tom slučaju treba izgraditi ovisnost [S] / v na [S]. Nagib rezultirajuće ravne linije je 1/V max; odsječeni segmenti na osi ordinate i apscise jednaki su (K m / V max) i (- K m), respektivno. Ovaj grafikon je nazvan po autoru Haynesov grafikon.

Statistička analiza je pokazala da metode Edie-Hofstee i Haynes daju točnije rezultate od Lineweaver-Burk metode. Razlog tome je što su u grafovima Edie - Hofstee i Haynes i zavisne i nezavisne varijable uključene u vrijednosti ucrtane na obje koordinatne osi.

1.3. Utjecaj koncentracije supstrata na kinetiku reakcije

U mnogim slučajevima uvjet stalne koncentracije supstrata nije zadovoljen. S jedne strane, višak supstrata se ne koristi u in vitro reakciji s nekim enzimima zbog česte inhibicije enzimske aktivnosti supstrata. U ovom slučaju može se koristiti samo njegova optimalna koncentracija, a to ne osigurava uvijek višak supstrata koji je neophodan za ispunjavanje kinetičkih jednadžbi mehanizama o kojima se raspravljalo gore. Štoviše, u stanici in vivo obično se ne postiže višak supstrata koji je potreban za ispunjavanje ovog uvjeta.

U enzimskim reakcijama gdje supstrat nije u suvišku pa se njegova koncentracija mijenja tijekom reakcije, konstanta disocijacije kompleksa enzim-supstrat je

K S = ([S] 0 - - [P]) [E] T - )/

([S] 0 - koncentracija supstrata pri t = 0). U ovom slučaju, početna brzina reakcije (u stacionarnom stanju) je dana sa

v= V max / (K m + )

gdje je koncentracija supstrata u trenutku.

Međutim, moguće je napisati približno rješenje za dva slučaja gdje je [S] o = :

) ako je ova nejednakost zadovoljena zbog velikih vrijednosti t, t.j. kada je tijekom reakcije potrošeno više od 5% početne koncentracije supstrata;

) ako se koncentracija enzima ne može zanemariti u usporedbi s koncentracijom supstrata pa se stoga mora uzeti u obzir koncentracija kompleksa enzim-supstrat.

Ako je t velik i koncentracija zanemariva u usporedbi s [S] 0 , tada jednadžba za konstantu disocijacije kompleksa enzim-supstrat postaje sljedeća:

K S = ([S] 0 - [P]) ([E] T - ) /

Za vrijednost koncentracije , koja se mijenja tijekom reakcije, vrijednost ([S] 0 + )/2 služi kao zadovoljavajuća aproksimacija. Budući da je = [S] 0 - [P], prosječna brzina; može se izraziti kao

Zamjena ovog izraza i približne vrijednosti u

v= V max / (K m + ),

dobivamo:

Kada se uspoređuju vrijednosti izračunate na temelju ove aproksimacije s vrijednostima dobivenim iz točne, integrirane Michaelis-Menten jednadžbe, ispada da je greška u određivanju K m iznosi 1 i 4% pri trošenju 30 odnosno 50% supstrata. Stoga je pogreška u ovoj aproksimaciji zanemariva u usporedbi s pogreškom mjerenja.

Kada potrošnja supstrata ne prelazi 5% početne koncentracije, ali je koncentracija enzima toliko visoka da se, u usporedbi s [S] 0, ne može zanemariti, konstanta disocijacije kompleksa enzim-supstrat jednaka je do:

K s = ([S] 0 - ) ([E] T - ) /

Njegovo rješenje u vezi daje

Od dva moguća rješenja može se odabrati samo negativno, jer samo ono zadovoljava početne uvjete: = 0 na [S] 0 = 0 ili [E] T = 0. Po analogiji s jednadžbom za omjer v/V max, dobili smo početnu jednadžbu brzine. Kvadratna jednadžba dobivena iz jednadžbe konstante disocijacije kompleksa enzim-supstrat, koja se nalazi neposredno iznad, koristeći formule v = k 2 i V max = k 2 [E] T, može se svesti na sljedeći oblik:

[S] 0 V max / v = K s V max / (V max - v) + [E] T

Treba uzeti u obzir dva ograničavajuća slučaja. U prvom slučaju [S]<

v = (Vmax/Km) [S] = k[S]

Tako smo dobili prividnu reakciju prvog reda i k=V max /K m - prividnu kinetičku konstantu prvog reda. Njegova stvarna dimenzija je vrijeme -1, ali je kombinacija konstanti brzine prvog i drugog reda nekoliko elementarnih stupnjeva, t.j. k 1 k 2 [E] T /(k -1 + k 2) . Pod uvjetima prividnog prvog reda k je mjera napredovanja reakcije.

Još jedan ograničavajući slučaj: [S] >> K m . Ovdje je konstanta K m zanemarivo je u usporedbi s [S], pa tako dobivamo v = V max .

1.4. Stvaranje kinetički stabilnog kompleksa enzim-proizvod

Ako se tijekom reakcije formira kinetički stabilan kompleks enzim-proizvod, mehanizam reakcije je sljedeći:

Primjenom pretpostavke stacionarnog stanja možemo napisati diferencijalne jednadžbe:

d / dt = k 1 [E] [S] + k -2 - (k -1 + k 2) = 0 / dt = k 2 - (k -2 + k 3) = 0

Iz ovih jednadžbi slijedi da

= [(k -2 + k 3) / k 2]

[E] = [(k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 k 2 [S]]

Budući da je v = k 3

i [E] T = [E] + + =

= [(k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 k 2 [S] + (k -2 + k 3) / k 2 + 1] =

= ( (k -2 + k 3) + k 1 k 2 [S]] / k 1 k 2 [S])

dobivamo

K 1 k 2 [S] [E] T / (k -2 + k 3 + k 2)]= k 1 k 2 k 3 [S] [E] T / (k -2 + k 3 + k 2) ]=

= [E] T [S] / [(k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 (k -2 + k 3 + k 2) + [S]]

To je

V max \u003d [E] Tm \u003d (k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 (k -2 + k 3 + k 2)

U ovom slučaju već je vrlo teško izračunati specifične vrijednosti pojedinačnih konstanti brzine, jer se samo njihov omjer može izravno izmjeriti. Situacija postaje još složenija kada mehanizam enzimske reakcije postane složeniji, kada je u reakciji uključeno više od dva kompleksa, jer je broj konstanti brzine u jednadžbi, naravno, puno veći, a i njihovi omjeri su također kompliciraniji.

Međutim, situacija je pojednostavljena ako su, nakon reverzibilne reakcije stvaranja prvog kompleksa, sljedeći elementarni koraci nepovratni. Važni predstavnici enzima koji se pokoravaju ovom mehanizmu su proteolitički enzimi i esteraze. Mehanizam njihove reakcije može se zapisati na sljedeći način:

gdje je ES` acil-enzimski intermedijer koji se razgrađuje pri izlaganju vodi. Možemo pisati

V max = k 2 k 3 [E] 0 / (k 2 + k 3) = k mačka [E] 0m \u003d k 3 (k -1 + k 2) / (k 2 + k 3) k 1 mačka / K m \u003d k 2 k 1 / (k -1 + k 2) \u003d k 2 / K m '

Michaelisova konstanta koraka acilacije je K m "K s. Što je veći omjer k cat / K m , to je veća specifičnost supstrata.

Određivanje konstanti je uvelike pojednostavljeno ako se pokus provodi u prisutnosti nukleofilnog agensa (N) sposobnog natjecati se s vodom. Zatim

k 3 \u003d k 3 ’ i P i (i = 1, 2, 3) su proizvodi.

vi = k mačka, i [S] / (K m + [S]) mačka, 1 = k 2 (k 3 + k 4 [N]) / (k 2 + k 3 + k 4 [N]) mačka, 2 = k 2 k 3 / (k 2 + k 3 + k 4 [N]) mačka, 3 = k 2 k 4 [N] / (k 2 + k 3 + k 4 [N]) m = K s ( k 3 + k 4 [N]) / (k 2 + k 3 + k 4 [N])

/v N = K s (k 3 + k 4 [N]) / k 2 k 3 [S] + (k 2 + k 3 + k 4 [N]) / k 2 k 3

Budući da je poznato da je K s / k 2 = K m / k mačka, a ako je nukleofil odsutan, tada

1/v = K s / k 2 [S] + (k 2 + k 3) / k 2 k 3

a za određivanje konstanti možete koristiti točku presjeka linija u koordinatama 1/v N (i 1/v) - 1/[S]. Dvije ravne u dvostrukim inverznim koordinatama sijeku se u drugom kvadrantu. U nedostatku nukleofila, točka presjeka linije s vertikalnom osi definirana je kao 1/V max i 1/k cat , a s horizontalnom osi kao -1/K m . Koordinate točke presjeka dvaju pravih: -1/K s i 1/k 3 . Udaljenost između 1/V max i 1/k 3 je 1/k 2 .

1.5 Analiza potpune kinetičke krivulje reakcije

Michaelis - Mentenova jednadžba se u svom izvornom obliku odnosi samo na nepovratne reakcije, t.j. na reakcije gdje se uzima u obzir samo početna brzina, a obrnuta reakcija se ne pojavljuje zbog nedovoljne količine produkta i ne utječe na brzinu reakcije. U slučaju ireverzibilne reakcije, kompletna kinetička krivulja može se lako analizirati (za proizvoljni vremenski interval t ), integrirajući izvornu Michaelis-Mentenovu jednadžbu. U ovom slučaju, dakle, ostaje pretpostavka da u tijeku reakcije nastaje samo jedan intermedijarni kompleks enzim-supstrat. Budući da je za vremenski interval t nema ograničenja, koncentracija supstrata u trenutku analize ne može biti jednaka početno uvedenoj koncentraciji. Stoga je također potrebno uzeti u obzir promjenu [S] tijekom reakcije. Neka je S 0 početna koncentracija supstrata, (S 0 - y ) - koncentracija u trenutku t . Zatim, na temelju izvorne Michaelis-Menten jednadžbe (ako je y je količina pretvorene podloge), možemo napisati

dy / dt \u003d V max (S 0 - y) / (K m + S 0 - y)

Uzimajući recipročne vrijednosti i dijeleći varijable, integriramo preko y između 0 i y (V max je označen kao V):

(2,303 / t) lg = V / K m - (1 / K m) (y / t)

Dakle, nakon što je nacrtana ovisnost lijeve strane jednadžbe o y / t (foster-Niemannove koordinate) , dobiti ravnu liniju s nagibom (-1/K m) , granični segment na y-osi (V/K m) , a na osi apscise - segment V. Integralna jednadžba se može linearizirati i na drugačiji način:

t / 2,3031 lg = y / 2,303 V lg + K m / V

ili t/y = 2,3031 K m lg / V y +1/V

Ako proučavamo reverzibilnu reakciju, potrebno je obratiti pažnju na to s kojim vremenskim intervalom imamo posla. U trenutku miješanja enzima sa supstratom počinje takozvana predstacionarna faza, koja traje nekoliko mikro- ili milisekundi, tijekom koje nastaju kompleksi enzim-supstrat koji odgovaraju stacionarnom stanju. U proučavanju reverzibilnih reakcija u dovoljno dugim vremenskim intervalima ova faza nema značajnu ulogu, budući da se u toj fazi reakcija ne odvija punom brzinom ni u jednom smjeru.

Za reakciju koja se odvija s lijeva na desno, kompleksi enzim-supstrat uključeni u reakciju postižu koncentraciju koja ograničava brzinu tek na kraju prestacionarne faze. Kvazistacionarno stanje, u kojem se koncentracije kompleksa enzim-supstrat koji određuju brzinu približavaju maksimalnim vrijednostima koncentracija u stacionarnom stanju, traje nekoliko desetinki sekunde ili sekunde. Tijekom ove faze, brzina stvaranja proizvoda (ili potrošnje supstrata) je gotovo linearna u vremenu. Teoretski, ovdje još nije došlo do stvaranja produkta, ali u praksi je njegova koncentracija toliko niska da brzina obrnute reakcije ne utječe na brzinu izravne. Ova linearna faza naziva se početna brzina reakcije i do sada smo je samo uzimali u obzir.

Reakcija s desna na lijevo u sljedećoj fazi također se ubrzava zbog postupnog povećanja koncentracije proizvoda. (prijelazno stanje; do sada uočena linearnost u vremenu nestaje). Ova faza se nastavlja sve dok brzina reakcije s lijeva na desno ne postane jednaka brzini reakcije s desna na lijevo. Ovo je država dinamička ravnoteža, jer se reakcija nastavlja u oba smjera istom brzinom.

2. Čimbenici o kojima ovisi brzina enzimske reakcije

.1 Ovisnost brzine enzimske reakcije o temperaturi

S povećanjem temperature medija, brzina enzimske reakcije raste, dostižući maksimum na nekoj optimalnoj temperaturi, a zatim pada na nulu. Za kemijske reakcije postoji pravilo da se s porastom temperature za 10 °C brzina reakcije povećava dva do tri puta. Za enzimske reakcije, ovaj temperaturni koeficijent je niži: za svakih 10°C, brzina reakcije se povećava za faktor 2 ili čak manje. Naknadno smanjenje brzine reakcije na nulu ukazuje na denaturaciju enzimskog bloka. Optimalne vrijednosti temperature za većinu enzima su u rasponu od 20 - 40 0 ​​C. Termolabilnost enzima povezana je s njihovom proteinskom strukturom. Neki enzimi su već denaturirani na temperaturi od oko 40 0 ​​C, ali većina ih se inaktivira na temperaturama iznad 40 - 50 0 C. Neki enzimi se inaktiviraju hladnoćom, t.j. pri temperaturama blizu 0°C dolazi do denaturacije.

Povećanje tjelesne temperature (groznica) ubrzava biokemijske reakcije katalizirane enzimima. Lako je izračunati da povećanje tjelesne temperature za svaki stupanj povećava brzinu reakcije za oko 20%. Pri visokim temperaturama od oko 39-40°C potrebna je rasipnička upotreba endogenih supstrata u stanicama bolesnog organizma kako bi se njihov unos nadoknadio hranom. Osim toga, na temperaturi od oko 40°C neki od vrlo termolabilnih enzima mogu biti denaturirani, što narušava prirodni tijek biokemijskih procesa.

Niska temperatura uzrokuje reverzibilnu inaktivaciju enzima zbog male promjene u njihovoj prostornoj strukturi, ali dovoljnu da poremeti odgovarajuću konfiguraciju aktivnog centra i molekula supstrata.

2.2 Ovisnost brzine reakcije o pH medija

Za većinu enzima postoji određena pH vrijednost pri kojoj je njihova aktivnost maksimalna; iznad i ispod ove pH vrijednosti, aktivnost ovih enzima se smanjuje. Međutim, nisu u svim slučajevima krivulje koje opisuju ovisnost aktivnosti enzima o pH u obliku zvona; ponekad se ta ovisnost može izraziti i izravno. Ovisnost brzine enzimske reakcije o pH uglavnom ukazuje na stanje funkcionalnih skupina aktivnog centra enzima. Promjena pH medija utječe na ionizaciju kiselih i bazičnih skupina aminokiselinskih ostataka aktivnog centra, koji sudjeluju ili u vezivanju supstrata (u kontaktnom području) ili u njegovoj transformaciji (u katalitičkom području). Stoga, specifični učinak pH može biti uzrokovan ili promjenom afiniteta supstrata za enzim, ili promjenom katalitičke aktivnosti enzima, ili oboje.

Većina supstrata ima kisele ili bazične skupine, pa pH utječe na stupanj ionizacije supstrata. Enzim se poželjno veže na ionizirani ili neionizirani oblik supstrata. Očito, pri optimalnom pH, obje funkcionalne skupine aktivnog centra su u najreaktivnijem stanju, a supstrat je u obliku koji je poželjniji za vezanje ovih skupina enzima.

Prilikom konstruiranja krivulja koje opisuju ovisnost aktivnosti enzima o pH, mjerenja pri svim pH vrijednostima obično se provode u uvjetima zasićenosti enzima supstratom, budući da se vrijednost K m za mnoge enzime mijenja s pH.

Krivulja koja karakterizira ovisnost aktivnosti enzima o pH može imati posebno jednostavan oblik u onim slučajevima kada enzim djeluje na elektrostatički neutralne supstrate ili supstrate u kojima nabijene skupine ne igraju značajnu ulogu u katalitičkom djelovanju. Primjer takvih enzima je papain, kao i invertaza, koja katalizira hidrolizu neutralnih molekula saharoze i održava stalnu aktivnost u pH rasponu od 3,0-7,5.

pH vrijednost koja odgovara maksimalnoj aktivnosti enzima ne mora se podudarati s pH vrijednošću karakterističnom za normalnu intracelularnu okolinu ovog enzima; potonji može biti i iznad i ispod pH optimuma. To sugerira da bi učinak pH na aktivnost enzima mogao biti jedan od čimbenika odgovornih za regulaciju enzimske aktivnosti unutar stanice. Budući da stanica sadrži stotine enzima, a svaki od njih različito reagira na promjene pH vrijednosti, pH vrijednost unutar stanice možda je jedan od važnih elemenata u složenom sustavu regulacije staničnog metabolizma.

2.3 Određivanje količine enzima prema njegovoj aktivnosti

) ukupna stehiometrija katalizirane reakcije;

) moguća potreba za kofaktorima - u metalnim ionima ili koenzimima;

) ovisnost aktivnosti enzima o koncentracijama supstrata i kofaktora, t.j. K m vrijednosti i za supstrat i za kofaktor;

) pH vrijednost koja odgovara maksimalnoj aktivnosti enzima;

) temperaturni raspon na kojem je enzim stabilan i zadržava visoku aktivnost.

Osim toga, potrebno je imati na raspolaganju neku prilično jednostavnu analitičku tehniku ​​koja vam omogućuje da odredite brzinu nestanka supstrata ili brzinu pojavljivanja produkta reakcije.

Kad god je moguće, analiza enzima se provodi u standardnim uvjetima koji održavaju optimalni pH i održavaju koncentraciju supstrata iznad koncentracije zasićenja; u ovom slučaju početna brzina odgovara nultom redu reakcije u odnosu na supstrat i proporcionalna je samo koncentraciji enzima. Za enzime koji zahtijevaju kofaktore, metalne ione ili koenzime, koncentracija tih kofaktora također mora premašiti koncentraciju zasićenja tako da je koncentracija enzima faktor koji ograničava brzinu. Općenito, mjerenje brzine formiranja produkta reakcije može se izvesti s većom preciznošću od mjerenja brzine nestajanja supstrata, budući da supstrat općenito mora biti prisutan u relativno visokim koncentracijama da bi se održala kinetika nultog reda. Brzina stvaranja reakcijskog produkta (ili produkata) može se mjeriti kemijskim ili spektrofotometrijskim metodama. Druga metoda je prikladnija jer vam omogućuje kontinuirano bilježenje tijeka reakcije na grinju rekordera.

Prema međunarodnom sporazumu, jedinica enzimske aktivnosti je količina enzima sposobna izazvati pretvorbu jednog mikromola supstrata u minuti pri 25°C pod optimalnim uvjetima. Specifična aktivnost enzim je broj jedinica enzimske aktivnosti po 1 mg proteina. Ova vrijednost se koristi kao kriterij za čistoću enzimskog pripravka; povećava se kako se enzim pročišćava i dostiže svoju maksimalnu vrijednost za idealno čist pripravak. Pod, ispod broj okretaja razumjeti broj molekula supstrata koje prolaze transformaciju u jedinici vremena po jednoj molekuli enzima (ili po jednom aktivnom centru) u uvjetima u kojima je brzina reakcije ograničena koncentracijom enzima.

2.4 Aktivacija enzima

Regulacija enzima može se provoditi interakcijom s njima različitih bioloških komponenti ili stranih spojeva (npr. lijekova i otrova), koji se obično nazivaju modifikatorima odnosno regulatori enzimi. Pod utjecajem modifikatora na enzim, reakcija se može ubrzati (aktivatori) ili usporiti ( inhibitori).

Aktivacija enzima određena je ubrzanjem biokemijskih reakcija koje nastaju nakon djelovanja modifikatora. Jednu skupinu aktivatora čine tvari koje utječu na područje aktivnog mjesta enzima. To uključuje enzimske kofaktore i supstrate. Kofaktori (ioni metala i koenzimi) nisu samo obvezni strukturni elementi složenih enzima, već u biti i njihovi aktivatori.

Metalni ioni su prilično specifični aktivatori. Neki enzimi često zahtijevaju ione ne jednog, već nekoliko metala. Na primjer, za Na + , K + -ATPazu, koja prenosi monovalentne katione kroz staničnu membranu, neophodni su ioni magnezija, natrija i kalija kao aktivatori.

Aktivacija uz pomoć metalnih iona provodi se različitim mehanizmima. U nekim enzimima oni su dio katalitičkog mjesta. U nekim slučajevima ioni metala olakšavaju vezanje supstrata na aktivni centar enzima, tvoreći svojevrsni most. Često se metal ne kombinira s enzimom, već sa supstratom, tvoreći kompleks metal-supstrat, koji je poželjniji za djelovanje enzima.

Specifičnost sudjelovanja koenzima u vezivanju i katalizi supstrata objašnjava njihovu aktivaciju enzimskih reakcija. Aktivirajući učinak kofaktora posebno je uočljiv pri djelovanju na enzim koji nije zasićen kofaktorima.

Supstrat je također aktivator unutar poznatih koncentracijskih granica. Nakon postizanja zasićenih koncentracija supstrata, aktivnost enzima se ne povećava. Supstrat povećava stabilnost enzima i olakšava stvaranje željene konformacije aktivnog mjesta enzima.

Metalni ioni, koenzimi i njihovi prekursori i aktivni analozi,

supstrati se u praksi mogu koristiti kao pripravci koji aktiviraju enzime.

Aktivacija nekih enzima može se provesti modifikacijom koja ne utječe na aktivno središte njihovih molekula. Moguće je nekoliko modifikacija:

1) aktivacija neaktivnog prethodnika - proenzim, ili zimogen. Na primjer, pretvorba pepsinogena u pepsin ;

2) aktivacija spajanjem bilo koje specifične modificirajuće skupine na molekulu enzima;

3) aktivacija disocijacijom neaktivnog kompleksnog proteina – aktivnog enzima.

2.5 Inhibicija enzima

Postoje reagensi koji mogu djelovati više ili manje specifično s jednim ili drugim bočnim lancem proteina, što dovodi do inhibicije aktivnosti enzima. Ovaj fenomen omogućuje proučavanje prirode bočnih ostataka aminokiselina uključenih u ovu enzimsku reakciju. Međutim, u praksi treba uzeti u obzir brojne suptilnosti koje čine nedvosmislenu interpretaciju rezultata dobivenih specifičnim inhibitorima prilično teškim i često sumnjivim. Prije svega, da bi reakcija s inhibitorom bila prikladna za proučavanje prirode bočnih lanaca uključenih u reakciju, mora zadovoljiti sljedeće kriterije:

) biti konkretan, tj. inhibitor bi trebao blokirati samo željene skupine;

) inhibiraju aktivnost enzima, a ta bi inhibicija trebala postati potpuna s povećanjem broja modificiranih skupina;

) reagens ne bi trebao uzrokovati nespecifičnu denaturaciju proteina.

Postoje 2 skupine inhibitora: reverzibilno i ireverzibilno djelovanje. Podjela se temelji na kriteriju obnavljanja enzimske aktivnosti nakon dijalize ili jakog razrjeđenja enzimske otopine inhibitorom.

Prema mehanizmu djelovanja razlikuju se kompetitivna, nekonkurentska, nekonkurentna, supstratna i alosterična inhibicija.

Kompetitivna inhibicija

Kompetitivna inhibicija otkrivena je u proučavanju inhibicije uzrokovane analozima supstrata. To je inhibicija enzimske reakcije uzrokovana vezanjem na aktivno središte enzima inhibitora sličnog strukturi supstratu i sprječavanjem stvaranja kompleksa enzim-supstrat. U kompetitivnoj inhibiciji, inhibitor i supstrat, budući da su slične strukture, natječu se za aktivno mjesto enzima. Spoj molekula, koji je veći, veže se na aktivno središte.

Takve ideje o mehanizmu inhibicije potvrđene su eksperimentima o kinetici kompetitivnih reakcija inhibicije. Tako se pokazalo da u slučaju kompetitivne inhibicije analog supstrata ne utječe na brzinu razgradnje već formiranog kompleksa enzim-supstrat; kada se koristi "beskonačno veliki" višak supstrata, ista maksimalna brzina se postiže i u prisutnosti i u odsutnosti inhibitora. Naprotiv, inhibitor utječe na vrijednost konstante disocijacije i Michaelisove konstante. Iz ovoga možemo zaključiti da inhibitor reagira s proteinskim skupinama koje sudjeluju na ovaj ili onaj način u vezivanju supstrata, pa se zbog njegove interakcije s tim skupinama smanjuje snaga vezanja supstrata (tj. broj molekula enzima sposobnih za vezanje supstrata). supstrat se smanjuje) .

Kasnije se pokazalo da kinetički kompetitivnu inhibiciju mogu uzrokovati ne samo analozi supstrata, već i drugi reagensi čija je kemijska struktura potpuno drugačija od strukture supstrata. U tim slučajevima također se pretpostavljalo da ovaj reagens stupa u interakciju sa grupom odgovornom za vezanje supstrata.

Teoretski postoje dvije mogućnosti za kompetitivnu inhibiciju:

1) vezna i katalitička mjesta enzima se preklapaju; inhibitor se veže na njih, ali utječe samo na skupine veznog središta;

2) vezno središte i katalitičko središte u molekuli enzima su prostorno izolirani; inhibitor stupa u interakciju s veznim mjestom.

gdje je I inhibitor, a K I je konstanta disocijacije kompleksa enzim-inhibitor.

Relativna brzina (omjer brzine enzimske reakcije mjerene u prisutnosti inhibitora (v i) , do najveće brzine) jednaka je

v i / V = ​​/ [E] T

budući da za ukupnu koncentraciju enzima vrijedi

[E]T = [E] + +

tada je 1 / v i = (K s / V[S]) (1 + [I] / K I) + 1 / V

Očito, ako je [I] = K I , tada nagib ravne crte postaje dvostruko veći nego kod ovisnosti 1/v 0 o [S] (v 0 je brzina enzimske reakcije u odsutnosti inhibitora).

Vrsta inhibicije obično se određuje grafički. Kompetitivnu inhibiciju najlakše je prepoznati crtanjem Lineweaver-Burk dijagrama (tj. dijagrama u 1/v i i 1/[S]) pri različitim koncentracijama inhibitora. Uz istinsku kompetitivnu inhibiciju, dobiva se skup ravnih linija koje se razlikuju po tangentu kuta nagiba i sijeku y-os (os 1/v i) u jednom trenutku. Pri bilo kojoj koncentraciji inhibitora moguće je koristiti tako visoku koncentraciju supstrata da će aktivnost enzima biti maksimalna.

Primjer kompetitivne inhibicije je učinak različitih tvari na aktivnost sukcinat dehidrogenaze. Ovaj enzim dio je enzimskog cikličkog sustava – Krebsovog ciklusa. Njegov prirodni supstrat je sukcinat, a kompetitivni inhibitor je oksaloacetat, međuprodukt istog Krebsovog ciklusa:

Sličan kompetitivni inhibitor sukcinat dehidrogenaze je malonska kiselina, koja se često koristi u biokemijskim istraživanjima.

Djelovanje mnogih farmakoloških pripravaka, pesticida koji se koriste za uništavanje poljoprivrednih štetnika i kemijskih ratnih sredstava temelji se na principu kompetitivne inhibicije.

Na primjer, skupina antikolinesteraznih lijekova, koja uključuje derivate kvaternarnih amonijevih baza i organofosfornih spojeva, kompetitivni su inhibitori enzima kolinesteraze u odnosu na njegov supstrat acetilkolin. Kolinesteraza katalizira hidrolizu acetilkolina, posrednika kolinergičkih sustava (neuromuskularne sinapse, parasimpatički sustav itd.). Antikolinesterazne tvari natječu se s acetilkolinom za aktivno mjesto enzima, vežu se na njega i isključuju katalitičku aktivnost enzima. Lijekovi kao što su prozerin, fizostigmin, sevin reverzibilno inhibiraju enzim, dok organofosforni lijekovi kao što su armin, nibufin, klorofos, soman djeluju ireverzibilno, fosforilirajući katalitičku skupinu enzima. Njihovim djelovanjem acetilkolin se nakuplja u onim sinapsama gdje je posrednik živčane ekscitacije, t.j. organizam se truje nakupljenim acetilkolinom. Djelovanje reverzibilnih inhibitora postupno nestaje, jer što se više acetilkolina nakuplja, to brže istiskuje inhibitor iz aktivnog centra kolinesteraze. Toksičnost ireverzibilnih inhibitora je neusporedivo veća, stoga se koriste za suzbijanje poljoprivrednih štetnika, kućnih insekata i glodavaca (na primjer, klorofos) te kao kemijska bojna sredstva (na primjer, sarin, soman itd.).

Nekonkurentna inhibicija

Kod nekonkurentne inhibicije, specifični inhibitor ne utječe na konstantu disocijacije kompleksa enzim-supstrat. S druge strane, maksimalna moguća brzina reakcije niža je u prisutnosti inhibitora nego u njegovoj odsutnosti, čak i pri beskonačno velikom višku supstrata. Prisutnost inhibicije dokazuje da se inhibitor veže na protein. Invarijantnost konstante disocijacije i u prisutnosti i u odsutnosti inhibitora, zauzvrat, ukazuje da se, za razliku od supstrata, inhibitor veže na drugu skupinu. S teorijske točke gledišta, mehanizam takve inhibicije može se tumačiti na različite načine.

a) Mjesto vezanja i katalitičko mjesto enzima su različiti. U tom slučaju, inhibitor povezan s katalitičkim centrom smanjuje aktivnost enzima i maksimalno dostiže
brzinom bez utjecaja na stvaranje kompleksa enzim-supstrat.

b) Mjesto vezanja i katalitičko mjesto se preklapaju
površine enzima, a inhibitor se veže na druge skupine proteina. Zbog vezanja inhibitora na površinu enzima, informacija proteina se mijenja i postaje nepovoljna za provedbu katalize.

c) Inhibitor se ne veže ni na katalitičko ni na vezno mjesto, te stoga ne utječe na konformaciju proteina. Međutim, može lokalno promijeniti raspodjelu naboja na području površine proteina. Do inhibicije aktivnosti može doći i u tom slučaju ako je, na primjer, onemogućena ionizacija skupina bitnih za očitovanje aktivnosti, ili ako se, naprotiv, dogodi ionizacija skupina aktivnih samo u neioniziranom obliku. Ovaj fenomen se uglavnom opaža kada se koriste jako kiseli ili jako alkalni reagensi.

Inhibitor i supstrat ne utječu na međusobno vezanje za enzim, ali su enzimski kompleksi koji sadrže inhibitor potpuno neaktivni. U ovom slučaju mogu se pretpostaviti sljedeće osnovne faze:

v i / V = ​​/ [E] T

[E] T = [E] + + +

/ v i = (K s / V [S]) (1 + [I] / K I) + (1 / V) (1 + [I] / K I)

Ako je [I] = K I, nagibi ravnih linija i ordinate točke presjeka s okomitom osi se udvostručuju u usporedbi s 1/v 0 .

Nekonkurentni inhibitori su, na primjer, cijanidi, koji su snažno povezani s feri željezom, koje je dio katalitičkog mjesta enzima hemin – citokrom oksidaze. Blokada ovog enzima isključuje dišni lanac, a stanica umire. Nekonkurentni inhibitori enzima uključuju ione teških metala i njihove organske spojeve. Stoga su ioni teških metala žive, olova, kadmija, arsena i drugi vrlo otrovni. Oni blokiraju, na primjer, SH-skupine uključene u katalitičko mjesto enzima.

Nekonkurentni inhibitori su cijanidi, koji su snažno povezani s feri željezom, koje je dio katalitičkog mjesta hemičkog enzima - citokrom oksidaze. Blokada ovog enzima isključuje dišni lanac, a stanica umire. Nemoguće je otkloniti djelovanje nekompetitivnog inhibitora viškom supstrata (kao djelovanje kompetitivnog), već samo tvarima koje vežu inhibitor - reaktivatorima.

Nekonkurentni inhibitori koriste se kao farmakološka sredstva, otrovne tvari za suzbijanje štetnika u poljoprivredi i u vojne svrhe. U medicini se koriste pripravci koji sadrže živu, arsen, bizmut, koji nekonkurentno inhibiraju enzime u stanicama tijela ili patogene bakterije, što određuje jedan ili drugi njihov učinak. U slučaju intoksikacije moguće je vezanje otrova ili njegovo istiskivanje iz enzimsko-inhibitornog kompleksa uz pomoć reaktivatora. To uključuje sve kompleksone koji sadrže SH (cistein, dimerkaptopropanol), limunsku kiselinu, etilendiamintetraoctenu kiselinu itd.

Nekonkurentna inhibicija

Ova vrsta inhibicije se u literaturi naziva i antikompetitivna inhibicija. ili povezana inhibicija , međutim, izraz "nekonkurentna inhibicija" je najčešće korišten. Karakteristika ove vrste inhibicije je da se inhibitor ne može vezati za enzim, ali se veže za kompleks enzim-supstrat.

U slučaju nekonkurentne inhibicije, kompleks koji sadrži inhibitor je neaktivan:

v i / V = ​​/ [E]

[E]T = [E] + +

/ v i = Ks / V[S] + (1 / V) (1 + [I] / K I)

inhibicija supstrata

Inhibicija supstrata je inhibicija enzimske reakcije uzrokovane viškom supstrata. Takva inhibicija nastaje zbog stvaranja kompleksa enzim-supstrat koji nije sposoban za katalitičke transformacije.Kompleks ES 2 je neproduktivan i čini molekulu enzima neaktivnom. Inhibiciju supstrata uzrokuje višak supstrata, stoga se uklanja kada se njegova koncentracija smanji.

Alosterična inhibicija

Alosterična regulacija karakteristična je samo za posebnu skupinu enzima kvartarne strukture, koji imaju regulacijske centre za vezanje alosteričnih efektora. Negativni efektori koji inhibiraju pretvorbu supstrata na aktivnom mjestu enzima djeluju kao alosterični inhibitori. Pozitivni alosterični efektori, naprotiv, ubrzavaju enzimsku reakciju, pa se stoga nazivaju alosterični aktivatori. Alosterički efektori enzima su najčešće različiti metaboliti, kao i hormoni, ioni metala i koenzimi. U rijetkim slučajevima molekule supstrata igraju ulogu alosteričkog efektora enzima.

Mehanizam djelovanja alosteričnih inhibitora na enzim je promjena konformacije aktivnog mjesta. Smanjenje brzine enzimske reakcije ili je posljedica povećanja K m ili smanjenja maksimalne brzine V max pri istim koncentracijama supstrata zasićenja, t.j. enzim je djelomično neaktivan.

Alosterični enzimi razlikuju se od ostalih enzima po specifičnoj krivulji u obliku slova S, ovisno o koncentraciji supstrata. Ova krivulja je slična krivulji zasićenja hemoglobina kisikom; ona ukazuje da aktivni centri podjedinica ne funkcioniraju autonomno, već kooperativno, tj. afinitet svakog sljedećeg aktivnog centra za supstrat određen je stupnjem zasićenosti prethodnih centara. Koordinirani rad centara određuju alosterični efektori.

Alosterična regulacija se očituje u obliku inhibicije krajnjeg produkta prvog enzima u lancu. Struktura konačnog produkta nakon niza transformacija polazne tvari (supstrata) nije slična supstratu, pa konačni produkt može djelovati na početni enzim lanca samo kao alosterički inhibitor (efektor). Izvana je takva regulacija slična regulaciji mehanizmom povratne sprege i omogućuje vam kontrolu izlaza konačnog proizvoda, u slučaju nakupljanja kojeg prestaje rad prvog enzima u lancu. Na primjer, aspartat karbamoiltransferaza (ACTase) katalizira prvu od šest reakcija u sintezi citidin trifosfata (CTP). CTP je alosterični inhibitor AKTaze. Stoga, kada se CTP akumulira, dolazi do inhibicije AKTaze i daljnja sinteza CTP-a prestaje. Otkrivena je alosterična regulacija enzima uz pomoć hormona. Na primjer, estrogeni su alosterički inhibitor enzima glutamat dehidrogenaze, koji katalizira deaminaciju glutaminske kiseline.

Dakle, čak i najjednostavnija kinetička jednadžba za enzimsku reakciju sadrži nekoliko kinetičkih parametara, od kojih svaki ovisi o temperaturi i okolišu u kojem se reakcija odvija.

Inhibitori omogućuju ne samo razumijevanje suštine enzimske katalize, već su i svojevrsno oruđe za proučavanje uloge pojedinih kemijskih reakcija, koje se mogu posebno isključiti uz pomoć inhibitora određenog enzima.

3. Neki uređaji korisni za određivanje početnih brzina reakcije

Mnogi problemi enzimske kinetike dovode do određivanja početnih brzina reakcije (v 0). Glavna prednost ove metode je da će vrijednosti v0 određene u početnom trenutku dati najtočniji prikaz aktivnosti enzima koji se proučavaju, budući da akumulirani produkti reakcije još nemaju vremena da ispolje inhibitorni učinak. na enzim i, osim toga, reakcijski sustav je u stanju stacionarne ravnoteže.

U laboratorijskoj praksi, međutim, kada se koriste konvencionalne spektrofotometrijske, titrimetrijske ili druge tehnike za bilježenje tijeka takvih reakcija, u najboljem slučaju gubi se do 15-20 sekundi od početnog vremena za uvođenje enzima u supstrat, miješanje reakcijske smjese. sustav, postavljanje ćelije itd. A to je neprihvatljivo, jer se u ovom slučaju tangenta dovodi do točke u kojoj je tg ά 2< tg ά 1 . Не компенсируется потеря начального времени и при математической обработке таких кривых при записи выхода v 0 на максимальный уровень (V). Кроме того, протекание реакций без stalno miješanje dodatno je komplicirano fluktuacijama u volumnim koncentracijama reagensa.

Dolje predloženi jednostavni uređaji za spektrofotometar, pH metar i slično omogućuju značajno smanjenje izvora naznačenih pogrešaka pri određivanju v 0 .

3.1 Uređaj za spektrofotometar

Uređaj za spektrofotometar sastoji se od dozatora 1, rotirajuće teflonske niti 2 (mješalica) i pričvrsne kapice 3.

Dozator je mikropipeta, čiji je jedan kraj oblikovan s iglom 4, a drugi - s proširenjem 5 (kako bi se spriječilo da enzim uđe u gumeni vrh 6).

Teflonski poklopac 3 koji pokriva spektralnu kivetu 7 ima dvije rupe: jednu (8) u sredini poklopca, drugu (9) iznad sredine razmaka između neprozirne stijenke kivete 7 i svjetlosnog snopa 10. Teflon cijev 11 (unutarnji promjer 1 -1,5 mm) je pričvršćena jednim krajem u rupu 9, a drugim - na fiksnoj izbočini 12 ispred rotora motora 13. Teflonski navoj 2 je umetnut unutar cijevi (debljina navoja 0,5-0,6 mm ). Jedan kraj navoja pričvršćen je na rotirajući rotor motora 13, drugi - uvučen u kivetu 7 - oblikovan je u obliku spirale (za poboljšanje miješanja). Položaj navoja određen je fiksirajućim poklopcem 3, bez obzira na udaljenost motora, što je prikladno kada se radi o čestim promjenama kiveta.

Princip rada. Kvarcna kiveta spektrofotometra 7 napunjena je supstratom 14 (oko 1,5-2,0 ml), umetnutom u termostatski držač kivete spektrofotometra, zatvoren poklopcem 3 s rotirajućim teflonskim navojem 2, koji je uronjen u podlogu14. a sve daljnje operacije izvode se već u snopu svjetlosti spektrofotometra i bilježe na snimaču.

Na početku rada, podloga se miješa, a olovka diktafona ispisuje ravnu horizontalnu (ili "nultu") liniju. Dozator (s enzimom) se ubacuje u otvor 8 (igla je uronjena u otopinu supstrata 14), brzim stiskanjem vrha 6 enzim (obično oko 0,03-0,05 ml) se unosi u supstrat, a dozator je uklonjena. Miješanje komponenti završava za 2,5-3 s, a olovka snimača fiksira početak reakcije odstupanjem krivulje optičke gustoće (ΔA) u odnosu na vrijeme.

Takav uređaj također omogućuje uzimanje uzoraka iz reakcijskog sustava za analizu; dodati inhibitore i aktivatore u sustav; promijenite reakcijske uvjete (promijenite pH, ionsku snagu, itd.) bez ometanja registracije tijeka reakcije, što je vrlo zgodno, na primjer, kada se proučava cijepanje n-NFF "kisele" fosfataze, gdje se cijepanje n-NFF se provodi pri pH 5,0 (ili pH 6-7), a aktivnost enzima određena je akumulacijom n-nitrofenolat ioni pri pH 9,5-10,0.

Takav je uređaj prikladan i za provođenje spektrofotometrijske titracije enzima itd.

3.2 Uređaj za pH metar

Uređaj za pH metar sastoji se od modificiranog vrha protočne elektrode 1, polumikroćelije 2, dozatora 3 i elektroničkog sklopa za spajanje pH metra na snimač. Osim toga, uređaj uključuje standardnu ​​elektrodu za pH metar (4), poklopac držača ćelije (5), termostatsku protočnu komoru (6), otopinu supstrata (7), pasivni magnet (8) i aktivni magnet ( 9).

Standardni vrh protočne elektrode pH metra (LPU-01) zamijenjen je teflonskom cijevi 1 (unutarnjeg promjera 1,3-1,5 mm), ispunjenom azbestnim navojem, prethodno obrađenom zasićenom otopinom KCl. Gustoća punjenja niti se kontrolira tako da je brzina protoka otopine KCl kroz cijev blizu brzini protoka izvorne nemodificirane elektrode. Ova zamjena vrha omogućuje smanjenje veličine izvorne radne ćelije s 20-25 na 2 ml, što omogućuje upravljanje s minimalnim volumenima (1,5 ml) otopina skupih biokemijskih pripravaka.

Elektronički sklop za spajanje pH metra (LPU-01) na snimač sastoji se od izvora napajanja (DC baterija 12 V), promjenjivog otpora žice R 1 (10 - 100 Ohm), koji postavlja napon od 9 V na D809 zener dioda prema očitanju voltmetra, promjenjivi otpor žice R 2 (15-150 Ohm), koji regulira postavku "nule" (referentne točke) očitanja pH metra na skali rekordera, i promjenjivi otpor žice R 3 (35-500 Ohm), koji regulira ljestvicu proširenja (pojačanja) očitanja pH skale - metara na snimaču. Krug radi pouzdano sve dok napon izvora ne padne ispod 9 V.

Princip rada. U ćeliju se unosi 1,5 ml supstrata (stakleni cilindar 1,7x2,4 cm), a ćelija se fiksira na fiksirajući čep 5. Uključeno je miješanje 9, a olovka za snimanje ispisuje parnu (osnovnu) referentnu liniju . Uz pomoć dozatora u supstrat se unosi 0,03 ml otopine enzima, a olovka rekordera fiksira početak reakcije odstupanjem krivulje pH u odnosu na vrijeme (t).

Takav uređaj ne zamjenjuje pH stat, ali uzimajući u obzir mogućnost proširenja skale pH metra, omogućuje pouzdano bilježenje manjih promjena u pH 0,004-0,005.

3.3 Nomogramska ravnala, pogodna za određivanje početne brzine

Značajnu složenost određivanja početne brzine u metodi tangenata predstavlja proračun omjera promjena koncentracija reagensa (Δ[S]) u jedinici vremena (Δt), t.j. izraz v 0 u M/min iz uvjeta da

v 0 = lim Δ[S] / Δt, at, t 0.

U praksi se takav postupak obično sastoji od tri ili četiri odvojene operacije: povlači se tangenta na početni dio reakcijske krivulje, zatim broj jedinica registrirane vrijednosti (optička gustoća, kut rotacije, itd.) po određenoj broji se vremenski interval, a to dovodi do jedinice vremena i, na kraju, ponovno se izračunava očitanja pisača za promjenu koncentracije reagensa za 1 min (M/min). Predložena dva tipa ravnala nomograma omogućuju pojednostavljenje ovog postupka.

Pravokutni ravnalo. v 0 je omjer Δ[S]/Δt, tj. tg ά, gdje je ά kut nagiba tangente na vremensku os t. Ista tangenta je i hipotenuza odgovarajućeg pravokutnog trokuta s kracima [S] i t. Što je veći v 0, to je strmiji nagib tangente. Stoga, ako se ograničimo na određeni vremenski interval, na primjer 1 min, tada ćemo dobiti niz pravokutnih trokuta s različitim vrijednostima kraka [S] (zapravo, različite vrijednosti v 0) . Ako su, međutim, obje noge graduirane: horizontalno - u jedinicama vremenske reference (1 min) i vertikalno - u jedinicama promjene koncentracije reagensa, na primjer, u milimolima (mM), i primijenite rezultirajuće segmente u prikladan format od prozirnog materijala (pleksiglas debljine oko 2 mm) , tada možete dobiti prikladno ravnalo za određivanje početnih brzina reakcije. Svi brojevi i crti ispisani su na poleđini ravnala kako bi se uklonile pogreške paralakse prilikom određivanja v 0 .

Postupak za određivanje v 0 svodi se u ovom slučaju na dvije jednostavne operacije: tangenta se povlači na početni dio kinetičke krivulje t 2 i kombinirati nultu točku vodoravnog kraka t ravnala s početkom tangente, nastavak tangente će sada prijeći skalu koncentracije [S] u točki koja određuje vrijednost v 0 u M/min (kada noga t je vodoravna, nisu potrebne dodatne operacije.

Lučna linija. Postupak za određivanje v 0 može se pojednostaviti na jednu operaciju ako se skala koncentracije nacrta duž luka određenog polumjera.

Ravna ("osnovna") linija 2 nanesena je na ploču od prozirnog materijala (svi brojevi i linije su također naneseni na poleđinu ravnala) i od nulte točke (t=0, min) ove linije pomoću polumjer jednak duljini kraka t=1 min [ , nacrtajte luk [S], od vrha do dna duž kojeg je položena skala promjena koncentracija reagensa (na primjer, supstrata u mM).

Opisani tipovi ravnala, uređaj za spektrofotometar i pH metar koriste se već niz godina za određivanje početnih brzina reakcija (v 0), u proučavanju supstratne specifičnosti enzima, za spektrofotometrijsku titraciju itd.

Zaključak

U ovom radu razmatran je dio enzimologije koji proučava ovisnost brzine kemijskih reakcija koje kataliziraju enzimi o nizu okolišnih čimbenika. Utemeljiteljima ove znanosti smatraju se Michaelis i Menten, koji su objavili svoju teoriju općeg mehanizma enzimske reakcije, izvedena jednadžba koja je postala temeljni princip svih kinetičkih studija enzima, služi kao polazište za svaki kvantitativni opis djelovanja enzima. Izvorna Michaelis-Mentenova jednadžba je hiperbolička jednadžba; Lineweaver i Burke pridonijeli su kinetici transformacijom Michaelis-Mentenove jednadžbe i dobivanjem grafa ravne linije iz koje se može najtočnije odrediti vrijednost V max.

S vremenom se promjena brzine enzimske reakcije u enzimskoj reakciji u eksperimentalnim uvjetima smanjuje. Do smanjenja brzine može doći zbog brojnih čimbenika: smanjenja koncentracije supstrata, povećanja koncentracije proizvoda koji može imati inhibicijski učinak, promjena pH otopine i promjena u može doći do temperature medija. Dakle, za svakih 10°C porasta temperature, brzina reakcije se udvostručuje ili čak manje. Niska temperatura reverzibilno inaktivira enzime. Ovisnost brzine enzimske reakcije o pH ukazuje na stanje funkcionalnih skupina aktivnog centra enzima. Svaki enzim drugačije reagira na promjene pH. Kemijske reakcije mogu se zaustaviti djelovanjem na njih raznim vrstama inhibicije. Početna brzina reakcije može se brzo i točno odrediti uz pomoć uređaja kao što su nomogramska ravnala, spektrofotometar i pH metar. To omogućuje najtočniji prikaz aktivnosti proučavanih enzima.

Sve se to danas aktivno koristi u medicinskoj praksi.

Popis korištenih izvora

1. Belyasova N.A. Biokemija i molekularna biologija. - Minsk: Kuća knjiga, 2004. - 416 str., ilustr.

Keleti T. Osnove enzimske kinetike: Per. s engleskog. - M.: Mir, 1990. -350 str., ilustr.

3. Knorre D.G. Biološka kemija: Proc. za kemijsku, biol. i med. specijalista. sveučilišta. - 3. izd., vlč. - M.: Više. škola 2002. - 479 str.: ilustr.

4. Krupyanenko V.I. Vektorska metoda za predstavljanje enzimskih reakcija. - M.: Nauka, 1990. - 144 str.

5. Lehninger A. Biokemija. Molekularne osnove strukture i funkcije stanice: Per. s engleskog. - M.: Mir, 1974.

6. Stroev E.A. Biološka kemija: udžbenik za farmaciju. in-tov i farmak. fak. med. u-drugu. - M.: Viša škola, 1986. - 479 str., ilustr.

Severin E.S. Biokemija. a. - 5. izd. - M.: GEOTAR - Mediji, 2009. - 786 str., ilustr.

Ovaj dio enzimologije proučava utjecaj različitih čimbenika na brzinu enzimske reakcije. Uzimajući u obzir opću jednadžbu enzimske katalize reverzibilne reakcije transformacije jednog supstrata u jedan produkt (1),

treba imenovati glavne čimbenike koji utječu na brzinu enzimske reakcije: koncentraciju supstrata [S], koncentraciju enzima [E] i koncentraciju produkta reakcije [P].

Interakcija nekih enzima s njihovim supstratom može se opisati hiperboličkom krivuljom ovisnosti brzine enzimske reakcije V o koncentraciji supstrata [S] (slika 19):

Slika 19. Ovisnost brzine enzimske reakcije o koncentraciji supstrata.

Na ovoj krivulji mogu se razlikovati tri segmenta, što se može objasniti pozicijama mehanizma interakcije enzima sa supstratom: OA je segment izravno proporcionalne ovisnosti V o [S], aktivnim mjestima enzima postupno se pune molekulama supstrata uz stvaranje nestabilnog kompleksa ES; dio AB - krivolinijska ovisnost V o [S], još nije postignuto potpuno zasićenje aktivnih centara enzima molekulama supstrata. ES kompleks prije postizanja prijelaznog stanja je nestabilan, vjerojatnost povratne disocijacije na E i S je još uvijek visoka; presjek BC - ovisnost je opisana jednadžbom nultog reda, presjek je paralelan s [S] osi, postiže se potpuno zasićenje aktivnih enzima molekulama supstrata, V=V max .

Karakterističan oblik krivulje matematički je opisan Briggs-Haldaneovom jednadžbom:

V=V max ● [S]/ Km + [S] (2),

gdje je Km Michaelis-Menten konstanta, numerički jednaka koncentraciji supstrata pri kojoj je brzina enzimske reakcije jednaka polovici V max .

Što je niži K m enzima, to je veći afinitet enzima za supstrat, brže se postiže prijelazno stanje za supstrat, te se pretvara u produkt reakcije. Potraga za vrijednostima Km za svaki od supstrata enzima s grupnom specifičnošću važna je u određivanju biološke uloge ovog enzima u stanici.

Za većinu enzima nemoguće je konstruirati hiperboličku krivulju (slika 19.) U ovom slučaju se koristi dvostruka recipročna metoda (Lineweaver-Burk), t.j. ucrtana je grafička ovisnost 1/[V] od 1/[S] (slika 20). Metoda konstruiranja takvih krivulja u eksperimentu vrlo je zgodna kada se proučava učinak različitih vrsta inhibitora na aktivnost enzima (vidi tekst ispod).

sl.20. Grafikon 1/[V] naspram 1/[S] (Lineweaver-Burk metoda),

gdje je y granična površina - , a x - granična površina - , tangenta kuta α - .

Ovisnost brzine enzimske reakcije V o koncentraciji enzima [E].

Ova grafička ovisnost (slika 21) razmatra se pri optimalnoj temperaturi i pH okoliša, pri koncentracijama supstrata koje su značajno veće od koncentracije zasićenja aktivnih mjesta enzima.

Riža. 21. Utjecaj koncentracije enzima na brzinu enzimske reakcije.

Ovisnost brzine enzimske reakcije o koncentraciji kofaktora ili koenzima. Za složene enzime treba imati na umu da nedostatak koenzimskih oblika vitamina u hipovitaminozi, kršenje unosa metalnih iona u tijelo nužno dovodi do smanjenja koncentracije odgovarajućih enzima potrebnih za tijek metaboličkog procesa. procesa. Stoga treba zaključiti da aktivnost enzima izravno ovisi o koncentraciji kofaktora ili koenzima.

Utjecaj koncentracije produkata na brzinu enzimske reakcije. Za reverzibilne reakcije koje se događaju u ljudskom tijelu, mora se uzeti u obzir da produkte izravne reakcije enzim može koristiti kao supstrate za obrnutu reakciju. Stoga smjer strujanja i trenutak postizanja V max ovise o omjeru koncentracija početnih supstrata i produkta reakcije. Na primjer, aktivnost alanin aminotransferaze, koja katalizira transformaciju:

Alanin + Alfa-ketoglutarat ↔ Piruvat + Glutamat

ovisi u stanici o omjeru koncentracija:

[alanin + alfa-ketoglutarat] / [piruvat + glutamat].

MEHANIZAM DJELOVANJA ENZIMA. TEORIJE ENZIMATIVNE KATALIZE

Enzimi, poput neproteinskih katalizatora, povećavaju brzinu kemijske reakcije zbog svoje sposobnosti da smanje aktivacijsku energiju te reakcije. Energija aktivacije enzimske reakcije izračunava se kao razlika između vrijednosti energije u sustavu reakcije u tijeku koja je dosegla prijelazno stanje i energije određene na početku reakcije (vidi grafičku ovisnost na slici 22).

Riža. 22. Grafička ovisnost energetskog stanja kemijske reakcije bez enzima (1) i u prisutnosti enzima (2) o vremenu reakcije.

Radovi V. Henryja i, posebice, L. Michaelisa, M. Mentena o proučavanju mehanizma monosupstratskih reverzibilnih enzimskih reakcija omogućili su pretpostavku da se enzim E najprije reverzibilno i relativno brzo spaja sa svojim supstratom S kako bi nastao kompleks enzim-supstrat (ES):

E+S<=>ES (1)

Do stvaranja ES dolazi zbog vodikovih veza, elektrostatičkih, hidrofobnih interakcija, u nekim slučajevima kovalentnih, koordinacijskih veza između bočnih radikala aminokiselinskih ostataka aktivnog centra i funkcionalnih skupina supstrata. U složenim enzimima neproteinski dio strukture također može obavljati funkciju kontakta sa supstratom.

Kompleks enzim-supstrat se tada razgrađuje u drugoj sporijoj reverzibilnoj reakciji da nastane produkt reakcije P i slobodni enzim E:

ES<=>EP<=>E + P (2)

Trenutno, zahvaljujući radu gore navedenih znanstvenika, kao i Kaylin D., Chance B., Koshland D. (teorija "inducirane usklađenosti"), postoje teorijske odredbe o četiri glavne točke u mehanizmu djelovanje enzima na supstrat, koji određuju sposobnost enzima da ubrzaju kemijske reakcije. reakcije:

1. Orijentacija i blizina . Enzim je u stanju vezati molekulu supstrata na način da veza koju enzim napada ne samo da se nalazi u neposrednoj blizini katalitičke skupine, već je i pravilno orijentirana u odnosu na nju. Vjerojatnost da će ES kompleks doći u prijelazno stanje zbog orijentacije i pristupa je znatno povećana.

2. Stres i naprezanje : inducirano pristajanje. Pričvršćivanje supstrata može uzrokovati konformacijske promjene u molekuli enzima, koje dovode do napetosti u strukturi aktivnog mjesta, a također donekle deformiraju vezani supstrat, čime se olakšava postizanje prijelaznog stanja ES kompleksom. Između molekula E i S postoji takozvana inducirana korespondencija.

Enzimska kinetika proučava brzinu reakcija koje kataliziraju enzimi ovisno o različitim uvjetima (koncentracija, temperatura, pH, itd.) njihove interakcije sa supstratom.

Međutim, enzimi su proteini koji su osjetljivi na utjecaj raznih vanjskih utjecaja. Stoga se pri proučavanju brzine enzimskih reakcija uglavnom uzimaju u obzir koncentracije reaktanata, te se nastoji minimizirati utjecaj temperature, pH medija, aktivatora, inhibitora i drugih čimbenika i stvoriti standardni uvjeti. Prvo, ovo je optimalna pH vrijednost medija za ovaj enzim. Drugo, preporuča se održavati temperaturu na 25°C, gdje je to moguće. Treće, postiže se potpuno zasićenje enzima supstratom. Ova točka je posebno važna, jer pri niskoj koncentraciji supstrata ne sudjeluju sve molekule enzima u reakciji (slika 6.5, a), što znači da će rezultat biti daleko od maksimalnog mogućeg. Najveća snaga katalizirane reakcije, pod jednakim uvjetima, postiže se ako svaka molekula enzima sudjeluje u transformaciji, t.j. pri visokoj koncentraciji kompleksa enzim-supstrat (slika 6.5, v). Ako koncentracija supstrata ne osigurava potpunu zasićenost enzima (slika 6.5, b), tada brzina reakcije koja se odvija ne doseže maksimalnu vrijednost.

Riža. 65.

a - pri niskoj koncentraciji supstrata; 6 - s nedovoljnom koncentracijom supstrata; v - kada je enzim potpuno zasićen supstratom

Brzina enzimske reakcije, mjerena pod gornjim uvjetima, i potpuno zasićenje enzima supstratom naziva se maksimalna brzina enzimske reakcije (V).

Brzina enzimske reakcije, određena kada enzim nije potpuno zasićen supstratom, označava se v.

Enzimska kataliza može se pojednostavljeno opisati shemom

gdje je F enzim; S - supstrat; FS - kompleks enzim-supstrat.

Svaka faza ovog procesa karakterizira određena brzina. Jedinica za mjerenje brzine enzimske reakcije je broj molova supstrata pretvorenih u jedinicu vremena(kao stopa normalne reakcije).

Interakcija enzima sa supstratom dovodi do stvaranja kompleksa enzim-supstrat, ali je taj proces reverzibilan. Brzine direktne i reverzne reakcije ovise o koncentracijama reaktanata i opisane su odgovarajućim jednadžbama:

Jednadžba (6.3) vrijedi u ravnoteži, budući da su brzine prednje i obrnute reakcije jednake.

Zamjenom brzina izravne (6.1) i obrnute (6.2) reakcije u jednadžbu (6.3), dobivamo jednakost:

Stanje ravnoteže karakterizira odgovarajuća konstanta ravnoteže K p, jednak omjeru konstanti izravne i reverzne reakcije (6.5). Recipročna vrijednost konstante ravnoteže naziva se konstanta supstrata K s , ili konstanta disocijacije kompleksa enzim-supstrat:

Iz jednadžbe (6.6) jasno je da konstanta supstrata opada pri visokoj koncentraciji kompleksa enzim-supstrat, t.j. s velikom stabilnošću. Stoga konstanta supstrata karakterizira afinitet enzima i supstrata te omjer konstanti brzine za nastanak i disocijaciju kompleksa enzim-supstrat.

Fenomen zasićenja enzima supstratom proučavale su Leonor Michaelis i Maud Mepten. Na temelju matematičke obrade rezultata izveli su jednadžbu (6.7) koja je dobila svoje nazive iz kojih je jasno da pri visokoj koncentraciji supstrata i niskoj vrijednosti konstante supstrata brzina enzimske reakcije teži do maksimuma. Međutim, ova je jednadžba ograničena jer ne uzima u obzir sve parametre:

Kompleks enzim-supstrat tijekom reakcije može se transformirati u različitim smjerovima:

• disocirati u izvorne tvari;
• pretvoriti u proizvod iz kojeg se enzim odvaja nepromijenjen.

Stoga, za opisivanje cjelokupnog učinka enzimskog procesa, koncept Michaelisove konstante K t, koji izražava odnos konstanti brzine sve tri reakcije enzimske katalize (6.8). Ako se oba člana podijele s konstantom brzine reakcije stvaranja kompleksa enzim-supstrat, tada će se dobiti izraz (6.9):

Važan zaključak slijedi iz jednadžbe (6.9): Michaelisova konstanta je uvijek veća od konstante supstrata za k 2 /kv

Numerički K t jednaka je takvoj koncentraciji supstrata pri kojoj je brzina reakcije polovica najveće moguće brzine i odgovara takvoj zasićenosti enzima supstratom, kao na sl. 6.5, b. Budući da u praksi nije uvijek moguće postići potpunu zasićenost enzima supstratom, jest K t koristi se za usporedbu kinetičkih karakteristika enzima.

Brzina enzimske reakcije u slučaju nepotpune zasićenosti enzima supstratom (6.10) ovisi o koncentraciji kompleksa enzim-supstrat. Koeficijent proporcionalnosti je reakcijska konstanta za oslobađanje enzima i produkta, budući da se time mijenja koncentracija kompleksa enzim-supstrat:

Nakon transformacija, uzimajući u obzir gore prikazane ovisnosti, brzina enzimske reakcije u slučaju nepotpune zasićenosti enzima supstratom opisuje se jednadžbom (6.11), tj. ovisi o koncentraciji enzima, supstrata i njihovom afinitetu Ks:

Grafička ovisnost brzine enzimske reakcije o koncentraciji supstrata nije linearna. Kao što je očito iz sl. 6.6, s povećanjem koncentracije supstrata, uočava se povećanje aktivnosti enzima. Međutim, kada se postigne maksimalna zasićenost enzima supstratom, brzina enzimske reakcije postaje maksimalna. Stoga je čimbenik koji ograničava brzinu reakcije stvaranje kompleksa enzim-supstrat.

Praksa je pokazala da se koncentracije supstrata u pravilu izražavaju u vrijednostima znatno manjim od jedinice (10 6 -10 3 mol). Prilično je teško operirati s takvim količinama u izračunima. Stoga su G. Lineweaver i D. Burke predložili da se grafička ovisnost brzine enzimske reakcije izrazi ne u izravnim koordinatama, već u obrnutim. Polazili su od pretpostavke da su za jednake vrijednosti i njihove recipročne vrijednosti jednake:

Riža. 6.6.

Nakon transformacije izraza (6.13) dobiva se izraz tzv Lineweaver-Burk jednadžba (6.14):

Grafička ovisnost Lineweaver-Burk jednadžbe je linearna (slika 6.7). Kinetičke karakteristike enzima određuju se na sljedeći način:

• segment odsječen na y-osi jednak je 1/V;
• segment odsječen na x-osi je -1 /K t.

Riža. 6.7.

Vjeruje se da metoda Lineweaver - Burke omogućuje točnije određivanje maksimalne brzine reakcije nego u izravnim koordinatama. Iz ovog grafikona također se mogu izvući vrijedne informacije o inhibiciji enzima.

Postoje i drugi načini za transformaciju Michaelis-Mentenove jednadžbe. Grafičke ovisnosti koriste se u proučavanju utjecaja različitih vanjskih utjecaja na enzimski proces.