Зависимостта на скоростта на ензимната реакция от температурата. Кинетика на ензимните реакции Зависимост на скоростта на ензимната реакция от количеството на ензимите

КИНЕТИКА НА ЕНЗИМНАТА РЕАКЦИЯ

изучава моделите на протичане във времето на ензимните p-ции, както и техния механизъм; глава химическа кинетика.

каталитичен цикълът на превръщане на in-va S (субстрат) в продукта P под действието на ензима Е протича с образуването на междинно съединение. съедин. х и:

където ки-скоростни константи на отделните елементарни етапи, образуване на ензим-субстратен комплекс X 1 (ES, комплекс на Михаелис).

При даден t-re скоростта на p-tion зависи от концентрациите на ензима, субстрата и състава на средата. Има стационарна, предстационарна и релаксационна кинетика на ензимните p-ции.

Стационарна кинетика.В неподвижно състояние на междинна Ком. (dX и/dt= 0, i = 1, ..., н) и с излишък от субстрат , където [S] 0 и [E] 0 са съответно началните концентрации. субстрат и ензим, кинетиката на процеса се характеризира с постоянно, инвариантно във времето ниво на концентрации между тях. comp., и изразът за скоростта на процеса v 0 , наречен начална стационарна скорост, има формата (уравнение на Майкълис-Ментен):

(1)

където стойностите k cat и K m ->функции на константите на скоростта на елементарните етапи и се дават от уравненията:

Стойността на k кат Наречен ефективен каталитик. константа на скоростта на процеса, параметър K m ->Константа на Михаелис. Стойността на k кат определени от количествата макс. бавни етапи каталитични. райони и понякога наричани. броят на оборотите на ензима (ензимна система); k котка характеризира броя на каталитичния. цикли, извършвани от ензимната система за единица време. Найб. общ, със стойност k кат. за конкретни. субстрати в диапазона от 10 2 -10 3 s -1 . Типичните стойности на константата на Михаелис са в диапазона 10 -3 - 10 -4 M.

При високи концентрации на субстрата, когато това е, скоростта на p-tion не зависи от концентрацията на субстрата и достига постоянна стойност, наречена. Макс. скорост. Графично уравнението на Михаелис-Ментен е хипербола. Може да се линеаризира с помощта на метода на двойните реципрочни числа (методът Lineweaver-Burk), т.е. чрез изграждане на зависимостта на 1/v от 1/[S] 0, или други методи. Линейната форма на уравнение (1) има вида:

(2)

Позволява ви да определите графично стойностите K mи v max (фиг. 1).

Ориз. 1. Графика на линейната трансформация на уравнението на Михаелис - Ментен в двойни реципрочни числа (по Lineweaver - Burke).

Стойност K m >следователно равна числено на концентрацията на субстрата, при която скоростта на p-tion е равна K mчесто служи като мярка за афинитета на субстрата и ензима, но това е вярно само ако

Количества K m >и променят се в зависимост от стойностите на pH. Това се дължи на способността на групите от ензимната молекула, участващи в катализата, да променят състоянието си на йонизация и по този начин каталитично. ефективност. В най-простия случай промяната в рН води до протониране или депротониране на поне две йонизиращи се групи от ензима, участващ в катализа. Ако в този случай само една форма на комплекса ензим-субстрат (например ESH) от три възможни (ES, ESH и ESH 2) може да се превърне в продукт на разтвор, тогава се описва зависимостта на скоростта от pH от f-loy:

където f= 1 + / и е" = 1 + +K" b/>-Т. Наречен pH-функции на Michaelis и K a, K bи K" a, K" b ->групови йонизационни константи a и b, съответно. Безплатно ензим и ензим-субстратен комплекс. В lg координати - pH тази зависимост е показана на фиг. 2, а тангентите на наклона на допирателните към възходящия, pH-независимия и низходящия клон на кривата трябва да бъдат съответно +1, 0 и -1. От такава графика могат да се определят стойностите RK aгрупи, участващи в катализа.

Ориз. 2. Зависимост на катализатора константи от pH до логаритмични. координати.

Скоростта на ензимния p-tion не винаги подлежи на уравнение (1). Един от най-често срещаните случаи - участие в областта на алостеричните. ензими (вж ензимни регулатори)за to-rykh зависимостта на степента на насищане на ензима от [S] 0 е нехиперболична. характер (фиг. 3). Това явление се дължи на кооперативността на свързването на субстрата, т.е. когато свързването на субстрат към едно от местата на ензимната макромолекула увеличава (положителна кооперативност) или намалява (отрицателна кооперативност) афинитета към субстрата на друго място.

Ориз. H Зависимост на степента на насищане на ензима със субстрата от концентрацията на субстрата с положителна (I) и отрицателна (II) кооперативност, както и при негово отсъствие (III).

Престационарна кинетика.При бързо смесване на ензимни и субстратни разтвори във времеви интервал от 10 -6 -10 -1 s могат да се наблюдават преходни процеси, които предхождат образуването на стабилно стационарно състояние. В този предстационарен режим, когато се използва голям излишък от субстрата, диференциалната система. ur-tion, описващ кинетиката на процесите, е линеен. Решението на този тип система от линейни диференциали. ur-tion се дава от сумата от експоненциалните членове. И така, за кинетиката схема, представена по-горе, кинетиката на натрупване на продукта има формата:

къде аз ->, b и n ->функции на елементарни скоростни константи; -корени на съответната характеристика. ур-ция.

Реципрочното на , наречено. Характеристика време на процеса:

За р-ция, протичаща с участието на niintermediate. Comm., можете да получите характеристика. пъти.

Изследването на кинетиката на ензимния окръг в предстационарен режим ви позволява да получите представа за подробния механизъм на катализатора. цикъл и определяне на константите на скоростта на елементарните етапи на процеса.

Експериментално кинетиката на ензимния разтвор в предстационарния режим се изследва с помощта на метода на спряната струя (виж фиг. реактивни кинетични методи),позволяващо смесване на компонентите на дистрикта в рамките на 1 ms.

Кинетика на релаксация.С бърз възмущаващ ефект върху системата (промени в t-ry, налягане, електрически полета), времето, необходимо на системата да постигне ново равновесно или стационарно състояние, зависи от скоростта на процесите, които определят каталитиката. ензимен цикъл.

Системата от уравнения, описващи кинетиката на процеса, е линейна, ако изместването от равновесното положение е малко. Решението на системата води до зависимостите на концентрациите на компонентите разл. етапи на процеса под формата на сбор от експоненциални членове, чиито експоненти имат характер на времена на релаксация. Резултатът от изследването е спектърът от времената на релаксация, съответстващ на броя на интервалите. Comm., участващи в процеса. Времената на релаксация зависят от константите на скоростта на елементарните етапи на процесите.

Методи за релаксациякинетиката дава възможност да се определят константите на скоростта на отделните елементарни етапи на трансформация на междинните продукти. Методите за изследване на кинетиката на релаксация са различни. резолюция: ултразвукова абсорбция - 10 -6 -10 -10 s, температурен скок - 1O -4 -10 -6 s, електрически метод. импулс - 10 -4 -10 -6 s, скок на налягането - 10 -2 s. При изследването на кинетиката на ензимните p-ции приложението е намерено чрез метода на температурния скок.

Макрокинетика на ензимните процеси.Разработване на методи за получаване на хетерогенни катализатори чрез имобилизиране на ензими при разлагане. медии (вж Имобилизирани ензими) наложи анализ на кинетиката на процесите, като се вземе предвид масопреносът на субстрата. Теоретично и експериментално са изследвани закономерностите на кинетиката на p-ции, като се вземат предвид ефектите на дифузионния слой и за системи с интрадифузионни затруднения в разпределението на ензима вътре в носителя.

При условия, при които кинетиката на процеса се влияе от дифузионния трансфер на субстрата, каталитичен. ефективността на системата намалява. Коефициентът на ефективност е равен на съотношението на плътността на потока на продукта при условията на потока на ензимната област с дифузионно-редуцирана субстратна концентрация към потока, което би могло да се реализира при липса на дифузионни ограничения. В чисто дифузионната област, когато скоростта на процеса се определя от масопреноса на субстрата, коефициентът на ефективност за системи с външно инхибиране на дифузията е обратно пропорционален на модула на дифузия:

където дебелина на дифузионния слой, D - коефициент. дифузия на субстрата.

За системи с интрадифузионно забавяне в р-ции от първи ред

където е т- безразмерен модул (модул Thiele).

При анализ на кинетиката закономерности във ферментационните реактори широки теоретични. и експериментирайте. Разработени са "идеални" модели на реактори, проточен реактор (поточен реактор с идеално смесване), проточен реактор с идеално изместване и мембранен реактор.

Кинетика на полиензимните процеси.В тялото (клетката) ензимите не действат изолирано, а катализират веригите на трансформация на молекулите. R-ция в полиензимни системи с кинетични. гледните точки могат да се разглеждат като последователни. процеси, специфични характеристика на to-rykh са ензимите на всеки от етапите:

където , респ. макс, скорост на процеса и константа на Михаелис ири етап на областта, респ.

Важна характеристика на процеса е възможността за образуване на стабилно стационарно състояние. Условието за възникването му може да бъде неравенството > v 0 , където v 0 е скоростта на ограничителния етап, характеризиращ се с най-малката константа на скоростта и по този начин определя скоростта на цялата последователност. процес. В стационарно състояние концентрацията на метаболитите след лимитиращия етап е по-малка от константата на Михаелис на съответния ензим.

Специфичен група от полиензимни системи е съставена от системи, които осъществяват окисл.-възстанов. р-ция с участието на белтъчни електронни носители. Носителите формират специфични. структури, комплекси с детерминирана последователност на електронен трансфер. Кинетичен описанието на такива системи се разглежда като независима променлива на състоянието на вериги с декомп. степен на населеност на електрони.

Приложение. F. r. широко използван в изследователската практика за изследване на механизмите на действие на ензимите и ензимните системи. Практически значима област на ензимната наука е инженерна ензимология,оперира с концепциите на Ф. р. към. за оптимизация на биотехнолог. процеси.

букв.:Полторак О. М., Чухрай Е. С., Физически и химични основи на ензимната катализа, М., 1971; Березин И.В., Мартинек К., Основи на физикохимията на ензимната катализа, М., 1977; Варфоломеев С. Д., Зайцев С. В., Кинетични методи в биохимичните изследвания, М.. 1982. С. Д. Варфоломеев.

Химическа енциклопедия. - М.: Съветска енциклопедия. Изд. И. Л. Кнунянц. 1988 .

Вижте какво е "КИНЕТИКА НА ЕНЗИМНАТА РЕАКЦИЯ" в други речници:

каталитичен rtion цикличен. процес, състоящ се от множество елементарни дажби, чиито скорости се описват от действащия масов закон. Този закон има проста форма за идеални газови смеси, идеални р ровове и идеални повърхностни слоеве. Химическа енциклопедия

Кинетика на химичните реакции, учението за химичните процеси, законите на тяхното протичане във времето, скорости и механизми. Най-важните области на съвременната химия и химични ... ... са свързани с изучаването на кинетиката на химичните реакции. Голяма съветска енциклопедия

КИНЕТИКА ХИМИЧНА- (от гръцки. kinesis движение), катедра по теоретична химия, посветена на изучаването на законите на химията. реакции. Има няколко вида хим. взаимодействия и преди всичко да се разграничат реакциите, протичащи в хомогенна (хомогенна) среда от реакции, които ... ... Голяма медицинска енциклопедия

- (биокатализа), ускоряване на биохим. дажби с участието на протеинови макромолекули, наречени ензими (ензими). Ф. до. вид катализа, въпреки че терминът ферментация (ферментация) е познат от древни времена, когато не е имало понятие за химично. катализа. Първо… … Химическа енциклопедия

- (от латински re prefix, означаващо обратно действие, и actio действие), преобразуването на едни in in (първоначални съединения) в други (продукти на реакцията) с неизменност на ядрата на атомите (за разлика от ядрените реакции). Първоначални връзки в R. x. понякога се нарича ... ... Химическа енциклопедия

- (от лат. fermentum закваска) (ензими), протеини, които действат като катализатори в живите организми. Основен функции на F. за ускоряване на трансформацията в, влизайки в тялото и образувани по време на метаболизма (да обновява клетъчните структури, да го осигурява... Химическа енциклопедия

- (от гръцки pharmakon medicine и kinetikos привеждане в движение), изучава кинетика. модели на процеси, протичащи с лек. cfd в тялото. Основен фармакокинетични. процеси: абсорбция, разпределение, метаболизъм и екскреция (екскреция). ... ... Химическа енциклопедия

При t=36-38 0 ензимите имат най-висока активност. Тази температура се нарича температурен оптимум:

С увеличаване на t 0 до оптимума активността на ензимите се увеличава.

Високото t причинява денатурация на ензима.

Ниският t намалява активността на ензимите.

Промяната в t 0 води до нарушаване на връзките, които фиксират протеиновата структура на ензимите (третични, четвъртични), т.е. причинява денатурация.

Обратима денатурация се наблюдава при намаляване на t 0 . Това ви позволява да съхранявате ензими, телесни течности, кръв.

Повишаването на температурата необратимо нарушава протеиновата структура на ензима. Това свойство се използва при стерилизация на материали и инструменти.

Треската е защитно свойство на организма, т.к. има денатурация на ензимите на микроорганизмите и поради това е неуместно да се използват антипиретици.

Зависимостта на скоростта на реакцията от рН

На графиката тази зависимост изглежда като камбана. В горната част на кривата има рН оптимална точка, където ензимът има най-висока активност. pH влияе върху степента на йонизация на киселинни и основни групи. При различни стойности на рН активният център може да бъде в частично йонизирана или нейонизирана форма, което засяга третичната структура на активния център и образуването на ензимно-субстратния комплекс.

Ефект на pH.

Ензимите, както всички протеини, съдържат много положително и отрицателно инфектирани групи (-NH 2 , -COOH), които са част от аминокиселините arg, lys, asp и glu. Общата такса зависи от съотношението между тези групи. Зарядът на протеин-ензима се променя в зависимост от концентрацията на водородните йони в клетката, които неутрализират (потискат дисоциацията) на карбоксилната група:

и образуват положително заредени групи:

По този начин увеличаването на положителния заряд или намаляването на отрицателния заряд на повърхността на ензима се дължи на увеличаване на концентрацията на водородни йони.

Състоянието на протеинова молекула, в което общият заряд на протеина е 0, се нарича изоелектрично състояние.

Стойността на pH, при която зарядът на протеиновата молекула е 0, се нарича изоелектрична точка (IEP).

Повечето ензими са най-активни и стабилни около изоелектричната точка.

Резките колебания в рН насърчават денатурацията на протеина, т.е. намаляване на ензимната активност.

Стойността на рН, при която ензимът проявява максимална активност, се нарича рН оптимум, който е характерен за даден ензим, реагиращ със специфичен субстрат.

Вътреклетъчните ензими обикновено имат оптимално pH, съответстващо на неутрална среда (pH = 7), близко до нормалната стойност на pH за телесните течности. Има ензими, чието оптимално pH е в силно кисела и силно алкална среда.

Класификация на ензимите.

Има шест класа ензими:

1. Хидролази – ензими, които разграждат субстрата с участието на водни молекули.

2. Лиази - ензими, които разграждат молекулите на субстрата без участието на вода, като често се образуват продукти с ниско молекулно тегло - CO 2, NH 3, H 2 O.

3. Изомерази – ензими, които предизвикват изомерни трансформации в молекулата.

4. Ферази (трансферази) – ензими, които пренасят групи от една молекула в друга или от една позиция в друга в рамките на една молекула.

5. Оксидоредуктази - ензими, които катализират преноса на протони и електрони (т.е. редокс реакции).

6. Лигази (синтетази) – ензими, които катализират синтеза на големи молекули от по-малки.

Ензимна номенклатура.

Работното наименование на ензима се състои от името на субстрата, типа на катализираната реакция и окончанието -aza.

Систематичното име се състои от името на субстратите, името на типа на катализираната химическа трансформация и окончанието -aza.

Името на класа показва вида на химичната реакция, катализирана от ензими. Класовете са разделени на подкласове - уточнява действието на ензима, тъй като показва естеството на химичната група на субстрата, атакуван от ензима. Подкласът е разделен на подкласове. Подкласовете определят действието на ензима, уточнявайки естеството на атакуваната субстратна връзка или естеството на акцептора.

I. Оксидоредуктазите катализират редокс реакции. Оксидоредуктазите се наричат ​​още дехидрогенази или редуктази. Оксидоредуктазите пренасят протони и електрони. Оксидоредуктазите са разделени на подкласове:

1. Аеробни дехидрогенази - пренасят протони и електрони към кислород.

Коензимите на оксидоредуктазите са:

NAD - никотинамид аденин динуклеотид - съдържа витамин B 5 - никотинамид.

NADP - никотинамид аденин динуклеотид фосфат, съдържа витамин B 5.

FAD - флавин аденин динуклеотид, съдържа витамин B 2 - рибофлавин.

FMN - флавин мононуклеотид, съдържа витамин B 2 - рибофлавин.

Оксидоредуктазите катализират реакциите на дехидрогениране, т.е. елиминиране на водорода.

Оксидоредуктазите окисляват следните функционални групи:

OH, -C \u003d O, -NH2

Дехидрогеназните коензими свързват протони и електрони.

NAD-зависимите дехидрогенази окисляват следните функционални групи: алкохолна хидроксилна група (OH), алдехидна група (COH), аминогрупа (NH 2).

NAD-зависимите дехидрогенази катализират следните видове реакции:

1. Дехидрогениране на хидроксилни групи

| лактат дехидрогеназа |

COOH НАД + NADH + H + CH 3

лактат пируват

Млечна киселина

2. Дехидрогениране на алдехидни групи (дехидрогениране на глицералдехид - 3 - фосфат)

| + НАД + + H 3 RO 4 | + NADH + H +

CH 2 OPO 3 H 2 CH 2 OPO 3 H 2

Глицералдехид-3-фосфат 1,3-бифосфоглицеринова киселина

3. Дехидрогениране на аминогрупи

UNSD UNSD

CH 2 + НАД CH 2

| | + NADH + H +

CH 2 глутамат дехидрогеназа CH 2

Глутаминова киселина

FAD - зависимите дехидрогенази окисляват (дехидрогенират) следните функционални групи: елиминирането на водорода от групите -CH 2 - CH 2 - с образуването на двойна връзка.

UNSD UNSD

| FADH FADN 2 |

CH 2 сукцинат дехидрогеназа CH

UNSD UNSD

Сукцинат фумарат

2. Анаеробните дехидрогенази пренасят протони и електрони не към кислород, а към някакъв друг субстрат. Тези ензими се наричат ​​още оксигенази.

II. Трансферазите са ензими, които катализират прехвърлянето на различни групи от един субстрат към друг.

Подкласове на трансфераза:

1. Аминотрансферазите осъществяват прехвърлянето на аминогрупа от аминокиселина към кето киселина. Катализира реакцията на трансаминиране.

2. Метилтрансферазите катализират прехвърлянето на метилови групи (CH 3 -).

3. Фосфотрансферазите катализират прехвърлянето на остатък от фосфорна киселина. Подклас фосфотрансферази включва кинази, които използват АТФ като донор на фосфатен остатък.

III. Лиазите са ензими, които катализират разкъсването на C-O, C-C, C-N и други връзки, както и обратими реакции на разцепване на различни групи, без участието на вода.

1. Карбоксилаза - добавяне на карбоксилна група (CO 2).

2. Дехидратаза – отстраняването на водна молекула от субстрата.

3. Алдолази - разцепват C-C връзката.

4. Хидратази – водни ензими на двойна връзка.

IV. Изомеразите са ензими, които катализират трансформацията в рамките на една молекула.

Катализира реакциите на изомеризация. Подкласове: мутази, тавтомерази, рацемази, епимерази, изомерази.

V. Хидралазите са ензими, които катализират разкъсването на връзките в присъствието на вода.

VI. Лигазите (синтетазите) са ензими, които катализират обединяването на две молекули, използвайки енергията на АТФ фосфатната връзка.

Влияние на нискомолекулните вещества върху активността на ензимите.

Веществата с ниско молекулно тегло, които променят скоростта на ензимните реакции, са разделени на 2 групи:

1. Активатори – ускоряване на протичането на ензимна реакция.

2. Инхибитори – забавят протичането на ензимните реакции.

Активаторите са разделени на 2 групи:

1. Може да действа като активатор коензими или протетична група(предимно витамини).

Тази група се характеризира със същите модели, които са описани за взаимодействието на ензима и субстрата F+S и A+Ko се подчиняват на едни и същи модели

K m определя колко да се въведе Ko.

2. Активатори, които са връзка между F и S (ориентация на ензима и субстрата) и осигуряват взаимодействието на ензима и субстрата (F A S), взаимодействието на апоензима и кофактора Apof A Ko

Често това са йони Me-Co, Mn, Mg, Zn.

Значение на инхибирането на ензимната активност.

1. Инхибирането е в основата на действието на лекарства и токсични агенти.

2. Инхибирането е един от подходите за изследване на ензимното действие (например структурата на активния център).

Инхибирането е от 2 вида:

1. Необратима

2. Обратима

Необратимо инхибиране възниква, когато свързването на инхибитора с ензима е необратимо.

Например: това е действието на алкилиращи агенти (подацетамид), действащи необратимо върху тио групата ензими. Необратимостта се дължи на факта, че равновесието се измества надясно, към образуването на ковалентно производно на ензима:

F-S-H + J-CH 2 CONH 2 F-S-CH 2 -CONH 2 + HJ

Действието на токсичните органофосфорни съединения, които се наричат ​​нервни отрови, е необратимо, те инхибират ацетилхолинестераза, която участва в предаването на нервните импулси.

необратимо инхибиране

Много инхибитори се свързват необратимо с E или ES и тъй като това засяга Vmax, това инхибиране се счита за неконкурентно.

Инхибиторите от този тип често се свързват ковалентно с ензима или с комплекса ензим-субстрат, променяйки необратимо нативната конфигурация. Това обяснява токсичния ефект на Hg 2+, Pb 2+ и съединенията на арсена.

Действието на пеницилина се основава на необратимо инхибиране. Пеницилинът инхибира действието на един от ензимите, участващи в сглобяването на бактериалната клетъчна стена. Клетките, които нямат клетъчна стена, лесно се лизират.

Действието на аспирина се основава на ковалентната модификация на ензима. Аспиринът намалява скоростта на синтеза на простагландин, действайки като инхибитор на циклооксигеназния компонент на ендопероксид синтетазата. Смята се, че появата на болка, възпаление, температура е свързана с простагландините.

В случай на интоксикация, свързването на отровата или нейното изместване от ензимно-инхибиторния комплекс е възможно с помощта на реактиватори или антидоти. Те включват всички SH-съдържащи комплексони (цистеин, димеркаптопропанол), лимонена киселина.

Обратимото инхибиране е от 2 вида:

1. Състезателна

2. Неконкурентни

Обратимо конкурентно инхибиране - активността на ензима се възстановява след отстраняването на инхибитора чрез повишаване на концентрацията на субстрата.

Отличителна черта на конкурентния инхибитор е, че конкурентният инхибитор е подобен по структура на субстрата. Конкурентният инхибитор се конкурира със субстрата за активното място на ензима.

Пример: сукцинат дехидрогеназата катализира превръщането на сукцинат във фумарат. Конкурентен инхибитор на сукцинат дехидрогеназата е малоновата киселина, която съдържа една СН2 група по-малко от сукцината.

COOH COOH COOH

CH 2 CH CH 2

CH 2 CH COOH

| | малонова киселина

UNSD UNSD

Сукцинатът и малоновата киселина са структурни аналози и се конкурират за активното място на ензима. (Това е потвърждение, че активният сайт не е твърда формация, подходяща за субстрата, като "ключ-ключ".)

При конкурентно инхибиране степента на ензимно инхибиране не зависи от абсолютната концентрация на инхибитора, а от съотношението на инхибитора и субстрата, ако това съотношение е J:S=1:50, тогава активността на ензима се инхибира от 50%.

Действието на конкурентния инхибитор се отстранява чрез увеличаване на концентрацията на субстрата, тъй като афинитетът на ензима и субстрата е по-висок от афинитета на ензима и инхибитора.

Km F и S и Km F и J са различни и това се знае чрез начертаването на Michaelis-Menten и Lineever-Burk

Vmax - същото

K m се увеличава с инхибитора.

Действието на много химиотерапевтични средства се основава на конкурентно инхибиране. Например, сулфаниламидни препарати, използвани за лечение на заболявания, причинени от микробни инфекции. Сулфаниламидните препарати са структурно подобни на р-аминобензоената киселина. PABA е предшественик в микробиологичния синтез на фолиева киселина, от която коензимът е необходим за синтеза на нуклеинови киселини на микроорганизмите. При въвеждането на сулфаниламидни препарати се наблюдава инхибиране на ензима и смърт на микроорганизми.

Използването на флуороурацил, който се използва при лечението на рак, също се основава на конкурентно инхибиране.

Неконкурентно, обратимо инхибиране.

Действието на неконкурентния инхибитор не може да бъде елиминирано чрез увеличаване на концентрацията на субстрата.

Неконкурентен инхибитор несе свързва с активния сайт, той може да се свърже със свободния ензим или с FS комплекса, или и двете, но и двете форми на JF и JFS са неактивни.

K m - не се променя, т.к няма свързване на активно място.

Vmax - намалява.

Най-често срещаният тип неконкурентно инхибиране възниква под действието на реагенти, които обратимо свързват SH-групите на цис, разположени в каталитичния център или близо до него. Това са Cu 2+, Hg 2+, Ag + йони и техните производни с образуването на меркаптиди:

Ензимите, които изискват Ме йони за активиране, се инхибират по този начин от агенти, които свързват тези йони:

феро или фероцианид.

Регулиране на ензимната активност.

Използването на ензими във фармацията, медицината.

Видове регулиране на ензимната активност:

1. Алостерична модификация.

2. Активиране на зимогени.

3. Регулиране чрез химическа модификация.

Край на работата -

Тази тема принадлежи към:

Структура, свойства и функции на протеините

Изясняването на структурата на протеините е един от основните проблеми на съвременната биохимия .. Протеиновите молекули са високомолекулни съединения .. Повечето протеини имат ниво на организация на структурата на протеиновата молекула ..

Ако имате нужда от допълнителен материал по тази тема или не сте намерили това, което търсите, препоръчваме да използвате търсенето в нашата база данни с произведения:

Какво ще правим с получения материал:

Ако този материал се оказа полезен за вас, можете да го запишете на страницата си в социалните мрежи:

КУРСОВА РАБОТА

Кинетика на ензимните реакции

Въведение

Основата на живота на всеки организъм са химичните процеси. Почти всички реакции в живия организъм протичат с участието на естествени биокатализатори - ензими.

Берцелиус през 1835 г. за първи път предполага, че реакциите на живия организъм се осъществяват благодарение на нова сила, която той нарича "каталитична". Той обосновава тази идея главно с експериментално наблюдение: диастазата от картофи хидролизира нишестето по-бързо от сярната киселина. Още през 1878 г. Куне нарича вещество, което има каталитична сила в живия организъм, ензим.

Кинетиката на ензимното действие е клон на ензимното изследване, което изучава зависимостта на скоростта на реакцията, катализирана от ензими, от химическата природа и условията на взаимодействие на субстрата с ензима, както и от факторите на околната среда. С други думи, кинетиката на ензимите позволява да се разбере естеството на молекулярните механизми на действие на факторите, влияещи върху скоростта на ензимната катализа. Този раздел се формира на пресечната точка на такива науки като биохимия, физика и математика. Първият опит да се опишат математически ензимните реакции е направен от Дюкло през 1898 г.

Всъщност този раздел за изследване на ензимите е много важен в наше време, а именно за практическата медицина. Той дава на фармаколозите инструмент за промяна на клетъчния метаболизъм, огромен брой фармацевтични продукти и различни отрови - това са ензимни инхибитори.

Целта на тази работа е да разгледа въпроса за зависимостта на скоростта на реакцията от различни фактори, как скоростта на реакцията може да се контролира и как може да се определи.

1. Кинетика на Михаелис-Ментен

Предварителни експерименти за изследване на кинетиката на ензимните реакции показаха, че скоростта на реакцията, противно на теоретичните очаквания, не зависи от концентрацията на ензима (E) и субстрата (S) по същия начин, както в случая на конвенционален реакция от втори ред.

Браун и независимо от него Анри са първите, които излагат хипотеза за образуването на ензим-субстратен комплекс по време на реакцията. Тогава това предположение беше потвърдено от три експериментални факта:

а) папаинът образува неразтворимо съединение с фибрин (Wurtz, 1880);

б) инвертазният субстрат захароза може да предпази ензима от термична денатурация (O'Sullivan and Thompson, 1890);

в) доказано е, че ензимите са стереохимично специфични катализатори (Fischer, 1898-1899).

Те въведоха концепцията за максимална скорост и показаха това крива на насищане(т.е. зависимостта на скоростта на реакцията от концентрацията на субстрата) е равнобедрена хипербола. Те доказаха, че максималната наблюдавана скорост е една от асимптотите на кривата, а сегментът, отрязан по оста на абсцисата (в областта на нейните отрицателни стойности) от втората асимптота, т.е. константа в уравнението на скоростта, равна по абсолютна стойност на концентрацията на субстрата, необходима за постигане на половината от максималната скорост.

Michaelis и Menten предполагат, че скоростта на реакцията се определя от разпадането на ES комплекса, т.е. константа k 2 . Това е възможно само при условие, че k 2 е най-малката от константите на скоростта. В този случай, равновесието между ензим-субстратния комплекс, свободния ензим и субстрата се установява бързо в сравнение със скоростта на реакцията (бързо равновесие).

Началната скорост на реакцията може да се изрази със следната формула:

v = k2

Тъй като константата на дисоциация на комплекса ензим-субстрат е

K S = [E] [S] / \u003d k -1 / k 1

тогава концентрацията на свободния ензим може да се изрази като

[E]=K S / [S]

Общата концентрация на ензима в реакционната смес се определя по формулата

[E] t = [E] + [ES] = K S [ES] / [S] + [ES]

Реакцията достига максималната си скорост, когато концентрацията на субстрата е достатъчно висока, така че всички ензимни молекули да са под формата на ES комплекс (безкрайно голям излишък от субстрат). Съотношението на началната скорост към теоретично възможната максимална скорост е равно на съотношението [ES] към [E] t:

v / V max = / [E] t = / (K S / [S] + ) = 1 / (K S + [S] +1)

Това е класическото уравнение Михаелиси Ментен,който от публикуването си през 1913 г. е основен принцип на всички ензимни кинетични изследвания в продължение на десетилетия и, с някои ограничения, остава такъв и до днес.

По-късно беше показано, че първоначалното уравнение на Михаелис-Ментен има няколко ограничения. Справедливо е, т.е. описва правилно кинетиката на реакцията, катализирана от този ензим, само ако са изпълнени всички от следните ограничителни условия:

) образува се кинетично стабилен ензим-субстратен комплекс;

) константа K S е константата на дисоциация на комплекса ензим-субстрат: това е вярно само ако ;

) концентрацията на субстрата не се променя по време на реакцията, т.е. концентрацията на свободния субстрат е равна на първоначалната му концентрация;

) реакционният продукт бързо се отцепва от ензима, т.е. не се образува кинетично значимо количество от ES комплекса;

) вторият етап на реакцията е необратим; по-точно, ние вземаме предвид само началната скорост, когато обратната реакция (поради действителната липса на продукт) все още може да бъде пренебрегната;

) само една субстратна молекула се свързва с всяко активно място на ензима;

) за всички реагенти, техните концентрации могат да се използват вместо дейности.

Уравнението на Михаелис-Ментен служи като отправна точка за всяко количествено описание на действието на ензимите. Трябва да се подчертае, че кинетичното поведение на повечето ензими е много по-сложно, отколкото следва от идеализираната схема, лежаща в основата на уравнението на Михаелис-Ментен. При извеждането на това уравнение се приема, че има само един ензим-субстратен комплекс. Междувременно в действителност при повечето ензимни реакции се образуват поне два или три такива комплекса, възникващи в определена последователност.

Тук EZ обозначава комплекса, съответстващ на истинското преходно състояние, а EP означава комплекса между ензима и реакционния продукт. Може също да се посочи, че в повечето ензимни реакции участва повече от един субстрат и се образуват съответно два или повече продукта. При реакция с два субстрата, S 1 и S 2 , могат да се образуват три комплекса ензим-субстрат, а именно ES 1 , ES 2 и ES 1 S 2 . Ако реакцията произвежда два продукта, P 1 и P 2 , тогава може да има поне три допълнителни комплекса EP 1 , EP 2 и EP 1 P 2 . При такива реакции има много междинни стъпки, всяка от които се характеризира със собствена скоростна константа. Кинетичният анализ на ензимни реакции, включващи два или повече реагента, често е изключително сложен и изисква използването на електронни компютри. Въпреки това, когато се анализира кинетиката на всички ензимни реакции, отправната точка винаги е уравнението на Michaelis-Menten, обсъдено по-горе.

1.1 Естеството на константатаКв уравнението

уравнение кинетика на ензимна реакция

Вторият постулат гласи, че константата K S в уравнението е константата на дисоциация на комплекса ензим-субстрат.

Бригс и Халдейн доказаха през 1925 г., че оригиналното уравнение на Михаелис-Ментен е валидно само за , т.е. когато равновесието на елементарния етап E+S ES се установява много бързо в сравнение със скоростта на следващия етап. Следователно такива кинетични механизми (подчиняващи се на първоначалното условие на Михаелис-Ментен и имащи един бавен елементарен етап, по отношение на който бързо се установяват равновесия във всички други елементарни етапи) се наричат ​​удовлетворяващи предположението за "бързо равновесие". Ако обаче k 2 е сравнимо по порядък с k -1 , промяната в концентрацията на комплекса ензим-субстрат във времето може да се изрази със следното диференциално уравнение:

d / dt \u003d k 1 [E] [S] - k -1 - k 2

Тъй като разглеждаме началната скорост на реакция, т.е. в момента, когато обратната реакция все още не е настъпила и предстационарният етап вече е преминал, тогава поради излишъка на субстрата, количеството на образувания ензим-субстратен комплекс е равно на количеството на разградения (принципа на стационарност, или кинетиката на Бригс и Халдейн, или принципа на Боденщайн в химическата кинетика) и е вярно, че

d/dt=0

Замествайки това в диференциалното уравнение, получаваме израз за концентрацията на свободния ензим:

[E] \u003d (k -1 + k 2) / k 1 [S]

[E] T = [E] + = [(k -1 + k 2) / k -1 [S] + 1] =

= (k -1 + k 2 + k -1 [S]) / k 1 [S]

Уравнение на стационарно състояние:

K 1 [S] [E] T / (k -1 + k 2 + k 1 [S])

Защото v = k 2 , тогава получаваме това

v = k 1 k 2 [S] [E] T / (k -1 + k 2 + k 1 [S]) = k 2 [S] [E] T / [(k -1 + k 2) / k 1 + [S]]

В такъв случай

V max = k 2 [E] T

и е равна на максималната скорост, получена от уравнението на Михаелис-Ментен. Въпреки това, константата в знаменателя на уравнението на Михаелис-Ментен не е K S , тези. не константата на дисоциация на комплекса ензим-субстрат, а т.нар константа на Михаелис:

K m \u003d (k -1 + k 2) / k 1

K m е равно на K S само ако .

В случай, че константата в знаменателя на уравнението за скоростта се изразява с формулата

K k \u003d k 2 / k 1

и се нарича, според Ван Слайк, кинетична константа.

Уравнението за стационарно състояние може да се получи и от диференциалното уравнение, без да се приема, че d / dt = 0. Ако заместим стойността [E] = [E] T - в диференциалното уравнение, след трансформации получаваме

= (k 1 [S] [E] T - d / dt) / (k 1 [S] + k -1 + k 2)

За да се получи уравнението за стационарно състояние от това уравнение, то не трябва да е d / dt = 0. Достатъчно е неравенството d / dt<< k 1 [S] [E] T . Этим объясняется, почему можно достичь хорошего приближения в течение длительного времени при использовании принципа стационарности.

Диференцираното уравнение за стационарно състояние изглежда така:

d / dt \u003d T / (k 1 [S] + k -1 + k 2) 2] (d [S] / dt)

Този израз очевидно не е равен на 0.

1.2 Преобразуване на уравнението на Михаелис-Ментен

Оригиналното уравнение на Михаелис-Ментен е хиперболично уравнение, където една от константите (V max) е асимптотата на кривата. Друга константа (K m), чиято отрицателна стойност се определя от втората асимптота, е равна на концентрацията на субстрата, необходима за постигане на V max / 2. Това е лесно да се провери, тъй като ако

v=Vmax / 2, тогава

Vmax / 2 = Vmax [S] / (Km + [S])

V max / V max = 1 = 2 [S] / (K m + [S]) m + [S] = 2 [S], т.е. [S] = K m за v = V max /2.

Уравнението на Михаелис-Ментен може да бъде алгебрично трансформирано в други форми, които са по-удобни за графично представяне на експериментални данни. Една от най-често срещаните трансформации е просто да се приравнят реципрочните числа на лявата и дясната страна на уравнението

В резултат на трансформацията получаваме израза

който носи името Уравнения на Lineweaver-Burk. Съгласно това уравнение графиката, нанесена в координатите 1/[S] и 1/v, е права линия, чийто наклон е равен на K m /V max , а отсечката по оста y е еднаква до 1/V макс. Такава двойна реципрочна графика има предимството, че дава възможност да се определи по-точно V max; на крива, начертана в координати [S] и v, V max е асимптотична величина и се определя много по-малко точно. Сегментът, отрязан по оста x на графика на Lineweaver-Burk, е равен на -1/K m . От тази графика може да се извлече и ценна информация относно ензимното инхибиране.

Друга трансформация на уравнението на Michaelis-Menten е, че двете страни на уравнението Lineweaver-Burk се умножават по V max *v и след някои допълнителни трансформации получаваме

Съответният график в координатите v и v/[S] представлява с д 4, фиг. един]. Такава графика ( Диаграма на Иди-Хофсти) не само прави много лесно определянето на стойностите на V max и K m , но също така ви позволява да идентифицирате възможни отклонения от линейността, които не са открити в графика на Lineweaver-Burk.

Уравнението може да бъде линеализирано и в друга форма

[S] / v = K m / V max + [S] / V макс

В този случай трябва да се изгради зависимостта [S] / v от [S]. Наклонът на получената права линия е 1/V max; сегментите, отрязани по осите на ординатата и абсцисите, са равни на (K m / V max) и (- K m), съответно. Тази диаграма е кръстена на автора Диаграма на Хейнс.

Статистическият анализ показва, че методите на Edie-Hofstee и Haynes дават по-точни резултати от метода Lineweaver-Burk. Причината за това е, че в графиките на Edie - Hofstee и Haynes, както зависими, така и независими променливи са включени в стойностите, нанесени на двете координатни оси.

1.3 Ефект на концентрацията на субстрата върху кинетиката на реакцията

В много случаи условието за постоянна концентрация на субстрата не е изпълнено. От една страна, излишъкът от субстрата не се използва в in vitro реакцията с някои ензими поради често срещаното инхибиране на ензимната активност на субстрата. В този случай може да се използва само неговата оптимална концентрация и това не винаги осигурява излишъка от субстрата, необходим за изпълнение на кинетичните уравнения на механизмите, разгледани по-горе. Освен това в клетката in vivo излишъкът от субстрата, необходим за изпълнение на това условие, обикновено не се постига.

При ензимни реакции, при които субстратът не е в излишък и следователно концентрацията му се променя по време на реакцията, константата на дисоциация на комплекса ензим-субстрат е

K S = ([S] 0 - - [P]) [E] T - )/

([S] 0 - концентрация на субстрата при t = 0). В този случай началната скорост на реакцията (в стационарно състояние) се дава от

v= V max / (K m + )

където е концентрацията на субстрата в даден момент.

Възможно е обаче да се напише приблизително решение за два случая, когато [S] o = :

) ако това неравенство е изпълнено поради големи стойности на t, т.е. когато по време на реакцията се изразходва повече от 5% от първоначалната концентрация на субстрата;

) ако концентрацията на ензима не може да се пренебрегне в сравнение с концентрацията на субстрата и по този начин трябва да се вземе предвид концентрацията на комплекса ензим-субстрат.

Ако t е голямо и концентрацията е незначителна в сравнение с [S] 0 , тогава уравнението за константата на дисоциация на комплекса ензим-субстрат става следното:

K S = ([S] 0 - [P]) ([E] T - ) /

За стойността на концентрацията, която се променя по време на реакцията, стойността ([S] 0 + )/2 служи като задоволително приближение. Тъй като = [S] 0 - [P], средната скорост; може да се изрази като

Заместване на този израз и приблизителната стойност в

v= V max / (K m + ),

получаваме:

При сравняване на стойностите, изчислени въз основа на това приближение, със стойностите, получени от точното, интегрирано уравнение на Михаелис-Ментен, се оказва, че грешката при определяне на K m е 1 и 4% при изразходване на 30 и 50% от субстрата, съответно. Следователно грешката в това приближение е незначителна в сравнение с грешката на измерването.

Когато консумацията на субстрата не надвишава 5% от първоначалната концентрация, но концентрацията на ензима е толкова висока, че в сравнение с [S] 0 не може да бъде пренебрегната, константата на дисоциация на комплекса ензим-субстрат е равна да се:

K s = ([S] 0 - ) ([E] T - ) /

Неговото решение относно дава

От двете възможни решения може да се избере само отрицателното, тъй като само то удовлетворява началните условия: = 0 при [S] 0 = 0 или [E] T = 0. По аналогия с уравнението за съотношението v/V max, получихме първоначалното уравнение на скоростта. Квадратното уравнение, получено от уравнението на константата на дисоциация на комплекса ензим-субстрат, намерено точно по-горе, като се използват формулите v = k 2 и V max = k 2 [E] T, може да се сведе до следния вид:

[S] 0 V max / v = K s V max / (V max - v) + [E] T

Трябва да се вземат предвид два ограничаващи случая. В първия случай [S]<

v = (Vmax / Km) [S] = k[S]

Така получихме привидната реакция от първи ред и k=V max /K m - привидната кинетична константа от първи ред. Действителната му размерност е време -1, но е комбинация от константи на скорост от първи и втори ред на няколко елементарни етапа, т.е. k 1 k 2 [E] T /(k -1 + k 2) . При условия на привиден първи ред k е мярка за хода на реакцията.

Друг ограничаващ случай: [S] >> K m . Тук константата K m е незначително в сравнение с [S] и по този начин получаваме v = V max .

1.4 Образуване на кинетично стабилен комплекс ензим-продукт

Ако по време на реакцията се образува кинетично стабилен комплекс ензим-продукт, механизмът на реакцията е както следва:

Прилагайки предположението за стационарно състояние, можем да напишем диференциалните уравнения:

d / dt = k 1 [E] [S] + k -2 - (k -1 + k 2) = 0 / dt = k 2 - (k -2 + k 3) = 0

От тези уравнения следва, че

= [(k -2 + k 3) / k 2]

[E] = [(k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 k 2 [S]]

Тъй като v = k 3

и [E] T = [E] + + =

= [(k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 k 2 [S] + (k -2 + k 3) / k 2 + 1] =

= ( (k -2 + k 3) + k 1 k 2 [S]] / k 1 k 2 [S])

получаваме

K 1 k 2 [S] [E] T / (k -2 + k 3 + k 2)]= k 1 k 2 k 3 [S] [E] T / (k -2 + k 3 + k 2) ]=

= [E] T [S] / [(k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 (k -2 + k 3 + k 2) + [S]]

Това е

V max \u003d [E] Tm = (k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 (k -2 + k 3 + k 2)

В този случай вече е много трудно да се изчислят специфичните стойности на отделните константи на скоростта, тъй като само тяхното съотношение може да бъде директно измерено. Ситуацията става още по-сложна, когато механизмът на ензимната реакция стане по-сложен, когато в реакцията участват повече от два комплекса, тъй като броят на скоростните константи в уравнението, разбира се, е много по-голям и техните съотношения също са по-сложно.

Ситуацията обаче се опростява, ако след обратимата реакция на образуването на първия комплекс следващите елементарни стъпки са необратими. Важни представители на ензимите, които се подчиняват на този механизъм, са протеолитичните ензими и естеразите. Техният механизъм на реакция може да се запише по следния начин:

където ES` е ацил-ензимен междинен продукт, който се разлага при излагане на вода. Можем да пишем

V max \u003d k 2 k 3 [E] 0 / (k 2 + k 3) = k cat [E] 0m = k 3 (k -1 + k 2) / (k 2 + k 3) k 1 котка / K m = k 2 k 1 / (k -1 + k 2) \u003d k 2 / K m '

Константата на Михаелис на етапа на ацилиране е K m "K s. Колкото по-голямо е съотношението k cat / K m , толкова по-висока е специфичността на субстрата.

Определянето на константите е значително опростено, ако експериментът се проведе в присъствието на нуклеофилен агент (N), способен да се конкурира с вода. Тогава

k 3 \u003d k 3 ’ и P i (i = 1, 2, 3) са продукти.

vi = k котка, i [S] / (K m + [S]) котка, 1 = k 2 (k 3 + k 4 [N]) / (k 2 + k 3 + k 4 [N]) котка, 2 = k 2 k 3 / (k 2 + k 3 + k 4 [N]) котка, 3 = k 2 k 4 [N] / (k 2 + k 3 + k 4 [N]) m = K s ( k 3 + k 4 [N]) / (k 2 + k 3 + k 4 [N])

/v N = K s (k 3 + k 4 [N]) / k 2 k 3 [S] + (k 2 + k 3 + k 4 [N]) / k 2 k 3

Тъй като е известно, че K s / k 2 = K m / k cat и ако нуклеофилът отсъства, тогава

1/v = K s / k 2 [S] + (k 2 + k 3) / k 2 k 3

и за да определите константите, можете да използвате пресечната точка на линиите в координатите 1/v N (и 1/v) - 1/[S]. Две прави линии в двойни обратни координати се пресичат във втория квадрант. При липса на нуклеофил, точката на пресичане на линията с вертикалната ос се определя като 1/V max и 1/k cat , а с хоризонталната ос като -1/K m . Координатите на пресечната точка на две прави: -1/K s и 1/k 3 . Разстоянието между 1/V max и 1/k 3 е 1/k 2 .

1.5 Анализ на пълната кинетична крива на реакцията

Уравнението на Михаелис – Ментен в първоначалния си вид се отнася само до необратими реакции, т.е. до реакции, при които се взема предвид само началната скорост, а обратната реакция не се появява поради недостатъчно количество от продукта и не влияе върху скоростта на реакцията. В случай на необратима реакция, пълната кинетична крива може лесно да бъде анализирана (за произволен интервал от време t ), интегриране на оригиналното уравнение на Михаелис-Ментен. Следователно в този случай остава предположението, че в хода на реакцията се образува само един междинен комплекс ензим-субстрат. Тъй като за интервала от време t няма ограничения, концентрацията на субстрата в момента на анализа не може да бъде равна на първоначално въведената концентрация. Следователно е необходимо да се вземе предвид и промяната в [S] по време на реакцията. Нека S 0 е началната концентрация на субстрата, (S 0 - y ) - концентрация в момент t . След това, въз основа на оригиналното уравнение на Михаелис-Ментен (ако y е количеството преобразуван субстрат), можем да напишем

dy / dt \u003d V max (S 0 - y) / (K m + S 0 - y)

Като вземем реципрочните числа и разделим променливите, интегрираме по y между 0 и y (V max е обозначен като V):

(2,303 / t) lg = V / K m - (1 / K m) (y / t)

По този начин, начертавайки зависимостта на лявата страна на уравнението от y / t (координати на Фостър-Ниман) , получите права линия с наклон (-1/K m) , отсечен сегмент по оста y (V/K m) , а по абсцисната ос - отсечката V. Интегралното уравнение може да се линеализира и по различен начин:

t / 2,3031 lg = y / 2,303 V lg + K m / V

или t/y = 2,3031 K m lg / V y +1/V

Ако изучаваме обратима реакция, е необходимо да обърнем внимание на какъв интервал от време имаме работа. В момента на смесване на ензима със субстрата започва т. нар. предстационарна фаза с продължителност няколко микро- или милисекунди, през която се образуват ензим-субстратните комплекси, съответстващи на стационарното състояние. При изследването на обратими реакции през достатъчно дълги интервали от време тази фаза не играе съществена роля, тъй като в тази фаза реакцията не протича с пълна скорост в нито една от посоките.

За реакция, протичаща отляво надясно, комплексите ензим-субстрат, участващи в реакцията, достигат ограничаваща скоростта концентрация само в края на предстационарната фаза. Квазистационарно състояние, при които концентрациите на определящите скоростта комплекси ензим-субстрат се доближават до максималните стойности на концентрациите в стационарно състояние, продължава няколко десети от секундата или секундата. По време на тази фаза скоростта на образуване на продукта (или консумация на субстрат) е почти линейна във времето. Теоретично образуването на продукта все още не е настъпило тук, но на практика концентрацията му е толкова ниска, че скоростта на обратната реакция не влияе върху скоростта на директната. Тази линейна фаза се нарича начална скорост на реакцията и досега само я взехме предвид.

Реакцията отдясно наляво в следващата фаза също се ускорява поради постепенното увеличаване на концентрацията на продукта. (преходно състояние;наблюдаваната досега линейност във времето изчезва). Тази фаза продължава, докато скоростта на реакцията отляво надясно стане равна на скоростта на реакцията отдясно наляво. Това е държавата динамичен баланс,тъй като реакцията продължава и в двете посоки с еднаква скорост.

2. Фактори, от които зависи скоростта на ензимната реакция

.1 Зависимост на скоростта на ензимната реакция от температурата

С повишаване на температурата на средата скоростта на ензимната реакция се увеличава, достигайки максимум при някаква оптимална температура и след това пада до нула. За химичните реакции има правило, че с повишаване на температурата с 10 ° C скоростта на реакцията се увеличава два до три пъти. За ензимните реакции този температурен коефициент е по-нисък: за всеки 10°C скоростта на реакцията се увеличава с коефициент 2 или дори по-малко. Последващото намаляване на скоростта на реакцията до нула показва денатурация на ензимния блок. Оптималните температурни стойности за повечето ензими са в диапазона 20 - 40 0 ​​C. Термолабилността на ензимите е свързана с тяхната протеинова структура. Някои ензими вече са денатурирани при температура около 40 0 ​​С, но повечето от тях се инактивират при температури над 40 - 50 0 С. Някои ензими се инактивират от студ, т.е. при температури близки до 0°C настъпва денатурация.

Повишаването на телесната температура (треска) ускорява биохимичните реакции, катализирани от ензими. Лесно е да се изчисли, че повишаването на телесната температура с всеки градус увеличава скоростта на реакцията с около 20%. При високи температури от около 39-40°C е необходимо разточителното използване на ендогенни субстрати в клетките на болен организъм, за да се попълни приема им с храна. Освен това при температура от около 40°C някои от много термолабилните ензими могат да бъдат денатурирани, което нарушава естествения ход на биохимичните процеси.

Ниската температура причинява обратимо инактивиране на ензимите поради лека промяна в пространствената му структура, но достатъчна, за да наруши съответната конфигурация на активния център и молекулите на субстрата.

2.2 Зависимост на скоростта на реакцията от рН на средата

За повечето ензими има определена стойност на pH, при която тяхната активност е максимална; над и под тази стойност на рН активността на тези ензими намалява. Въпреки това, не във всички случаи кривите, описващи зависимостта на ензимната активност от pH, са с форма на камбана; понякога тази зависимост може да се изрази и директно. Зависимостта на скоростта на ензимната реакция от pH основно показва състоянието на функционалните групи на активния център на ензима. Промяната на pH на средата влияе върху йонизацията на киселинни и основни групи от аминокиселинни остатъци на активния център, които участват или в свързването на субстрата (в контактната зона), или в неговата трансформация (в каталитичната зона). Следователно, специфичният ефект на рН може да бъде причинен или от промяна в афинитета на субстрата към ензима, или от промяна в каталитичната активност на ензима, или и от двете.

Повечето субстрати имат киселинни или основни групи, така че pH влияе върху степента на йонизация на субстрата. Ензимът за предпочитане се свързва или с йонизираната, или с нейонизираната форма на субстрата. Очевидно при оптимално рН и двете функционални групи на активния център са в най-реактивно състояние, а субстратът е във форма, която е за предпочитане за свързване от тези групи на ензима.

При конструиране на криви, описващи зависимостта на ензимната активност от pH, измерванията при всички стойности на pH обикновено се извършват при условия на насищане на ензима със субстрата, тъй като стойността на K m за много ензими се променя с pH.

Кривата, характеризираща зависимостта на ензимната активност от pH, може да има особено проста форма в случаите, когато ензимът действа върху електростатично неутрални субстрати или субстрати, в които заредените групи не играят значителна роля в каталитичния акт. Пример за такива ензими е папаинът, както и инвертазата, която катализира хидролизата на неутрални молекули на захарозата и поддържа постоянна активност в диапазона на рН от 3,0-7,5.

Стойността на рН, съответстваща на максималната активност на ензима, не съвпада непременно със стойността на рН, характерна за нормалната вътреклетъчна среда на този ензим; последният може да бъде както над, така и под оптимума на pH. Това предполага, че ефектът на pH върху ензимната активност може да бъде един от факторите, отговорни за регулирането на ензимната активност в клетката. Тъй като клетката съдържа стотици ензими и всеки от тях реагира различно на промените в pH, стойността на pH вътре в клетката е може би един от важните елементи в сложната система за регулиране на клетъчния метаболизъм.

2.3 Определяне на количеството на ензима по неговата активност

) общата стехиометрия на катализираната реакция;

) възможната нужда от кофактори - в метални йони или коензими;

) зависимостта на ензимната активност от концентрациите на субстрата и кофактора, т.е. K m стойности както за субстрат, така и за кофактор;

) стойността на рН, съответстваща на максималната активност на ензима;

) температурният диапазон, при който ензимът е стабилен и запазва висока активност.

Освен това е необходимо да имате на ваше разположение някаква доста проста аналитична техника, която ви позволява да определите скоростта на изчезване на субстрата или скоростта на поява на реакционните продукти.

Когато е възможно, ензимният анализ се извършва при стандартни условия, които поддържат оптимално рН и поддържат концентрация на субстрата над концентрацията на насищане; в този случай началната скорост съответства на нулевия ред на реакцията по отношение на субстрата и е пропорционална само на концентрацията на ензима. За ензими, изискващи кофактори, метални йони или коензими, концентрацията на тези кофактори също трябва да надвишава концентрацията на насищане, така че концентрацията на ензима да бъде ограничаващ скоростта фактор. Като цяло, измерването на скоростта на образуване на реакционния продукт може да се извърши с по-голяма точност от измерването на скоростта на изчезване на субстрата, тъй като субстратът обикновено трябва да присъства в относително високи концентрации, за да се поддържа кинетика от нулев порядък. Скоростта на образуване на реакционния продукт (или продукти) може да бъде измерена чрез химични или спектрофотометрични методи. Вторият метод е по-удобен, тъй като ви позволява непрекъснато да записвате хода на реакцията върху акара на рекордера.

Съгласно международно споразумение, единица за ензимна активност е количеството ензим, способно да предизвика преобразуване на един микромол субстрат в минута при 25°C при оптимални условия. Специфична дейностензимът е броят на единиците ензимна активност на 1 mg протеин. Тази стойност се използва като критерий за чистотата на ензимния препарат; той се увеличава с пречистването на ензима и достига максималната си стойност за идеално чист препарат. Под брой оборотиразбират броя на субстратните молекули, подложени на трансформация за единица време на една молекула от ензима (или на един активен център) при условия, при които скоростта на реакцията е ограничена от концентрацията на ензима.

2.4 Ензимно активиране

Регулирането на ензимите може да се осъществи чрез взаимодействие с тях на различни биологични компоненти или чужди съединения (например лекарства и отрови), които обикновено се наричат модификаториили регулатори ензими.Под въздействието на модификатори върху ензима реакцията може да се ускори (активатори) или да се забави (инхибитори).

Активирането на ензимите се определя от ускоряването на биохимичните реакции, което настъпва след действието на модификатора. Една група активатори се състои от вещества, които засягат областта на активното място на ензима. Те включват ензимни кофактори и субстрати. Кофакторите (метални йони и коензими) са не само задължителни структурни елементи на комплексните ензими, но и по същество техните активатори.

Металните йони са доста специфични активатори. Често някои ензими изискват йони не на един, а на няколко метала. Например за Na + , K + -АТФаза, която транспортира едновалентни катиони през клетъчната мембрана, магнезиеви, натриеви и калиеви йони са необходими като активатори.

Активирането с помощта на метални йони се извършва по различни механизми. В някои ензими те са част от каталитичния сайт. В някои случаи металните йони улесняват свързването на субстрата с активния център на ензима, образувайки един вид мост. Често металът се комбинира не с ензима, а със субстрата, образувайки комплекс метал-субстрат, който е за предпочитане за действието на ензима.

Спецификата на участието на коензимите в свързването и катализата на субстрата обяснява активирането на ензимните реакции от тях. Активиращият ефект на кофакторите е особено забележим при действие върху ензим, който не е наситен с кофактори.

Субстратът също е активатор в известни граници на концентрация. След достигане на насищащи концентрации на субстрата, активността на ензима не се повишава. Субстратът повишава стабилността на ензима и улеснява образуването на желаната конформация на активното място на ензима.

Метални йони, коензими и техните прекурсори и активни аналози,

субстрати могат да се използват на практика като препарати, които активират ензими.

Активирането на някои ензими може да се извърши чрез модификация, която не засяга активния център на техните молекули. Възможни са няколко модификации:

1) активиране на неактивен предшественик - проензим,или зимоген. Например, превръщането на пепсиноген в пепсин ;

2) активиране чрез прикрепване на всяка специфична модифицираща група към ензимната молекула;

3) активиране чрез дисоциация на неактивен комплексен протеин - активен ензим.

2.5 Ензимно инхибиране

Има реагенти, които могат да взаимодействат повече или по-малко специфично с една или друга странична верига от протеини, което води до инхибиране на ензимната активност. Това явление прави възможно изследването на природата на аминокиселинните странични остатъци, участващи в тази ензимна реакция. На практика обаче трябва да се вземат предвид множество тънкости, които правят недвусмислената интерпретация на резултатите, получени със специфични инхибитори, доста трудна и често съмнителна. На първо място, за да бъде реакцията с инхибитор подходяща за изследване на естеството на страничните вериги, участващи в реакцията, тя трябва да отговаря на следните критерии:

) бъдете конкретни, т.е. инхибиторът трябва да блокира само желаните групи;

) инхибира активността на ензима и това инхибиране трябва да стане пълно с увеличаване на броя на модифицираните групи;

) реагентът не трябва да причинява неспецифична денатурация на протеина.

Има 2 групи инхибитори: обратимо и необратимо действие. Разделението се основава на критерия за възстановяване на ензимната активност след диализа или силно разреждане на ензимен разтвор с инхибитор.

Според механизма на действие се различават конкурентно, неконкурентно, неконкурентно, субстратно и алостерично инхибиране.

Конкурентно инхибиране

Конкурентното инхибиране е открито при изследването на инхибирането, причинено от аналози на субстрата. Това е инхибирането на ензимната реакция, причинена от свързването с активния център на ензима на инхибитор, подобен по структура на субстрата, и предотвратяване образуването на ензим-субстратен комплекс. При конкурентно инхибиране, инхибиторът и субстратът, тъй като са сходни по структура, се конкурират за активното място на ензима. Съединението от молекули, което е по-голямо, се свързва с активния център.

Такива идеи за механизма на инхибиране бяха потвърдени от експерименти върху кинетиката на реакциите на конкурентно инхибиране. По този начин беше показано, че в случай на конкурентно инхибиране, субстратният аналог не влияе върху скоростта на разлагане на вече образувания ензим-субстратен комплекс; когато се използва "безкрайно голям" излишък от субстрата, една и съща максимална скорост се получава както в присъствието, така и в отсъствието на инхибитор. Напротив, инхибиторът влияе върху стойността на константата на дисоциация и константата на Михаелис. От това можем да заключим, че инхибиторът реагира с протеинови групи, участващи по един или друг начин в свързването на субстрата, следователно, поради взаимодействието му с тези групи, силата на свързване на субстрата намалява (т.е. броят на ензимните молекули, способни да се свързват субстратът намалява) .

По-късно беше показано, че кинетично конкурентното инхибиране може да бъде причинено не само от аналози на субстрата, но и от други реагенти, чиято химическа структура е напълно различна от тази на субстрата. В тези случаи също се предполагаше, че този реагент взаимодейства с групата, отговорна за свързването на субстрата.

Теоретично има две възможности за конкурентно инхибиране:

1) свързващи и каталитични места на ензима се припокриват; инхибиторът се свързва с тях, но засяга само групите на свързващия център;

2) свързващият център и каталитичният център в ензимната молекула са пространствено изолирани; инхибиторът взаимодейства с мястото на свързване.

където I е инхибитор, а K I е константата на дисоциация на комплекса ензим-инхибитор.

Относителна скорост (съотношение на скоростта на ензимната реакция, измерена в присъствието на инхибитор (v i) , до максимална скорост) е равно на

v i / V = ​​/ [E] T

тъй като за общата концентрация на ензима е вярно

[E]T = [E] + +

тогава 1 / v i = (K s / V[S]) (1 + [I] / K I) + 1 / V

Очевидно, ако [I] = K I , тогава наклонът на правата линия става два пъти по-голям, отколкото при зависимостта на 1/v 0 от [S] (v 0 е скоростта на ензимната реакция при отсъствие на инхибитор).

Типът на инхибирането обикновено се определя графично. Конкурентното инхибиране се разпознава най-лесно чрез начертаване на графики на Lineweaver-Burk (т.е. графики в 1/v i и 1/[S]) при различни концентрации на инхибитор. При истинско конкурентно инхибиране се получава набор от прави линии, които се различават по тангенса на ъгъла на наклона и пресичат оста y (ос 1/v i) в един момент. При всяка концентрация на инхибитора е възможно да се използва толкова висока концентрация на субстрата, че активността на ензима да бъде максимална.

Пример за конкурентно инхибиране е ефектът на различни вещества върху активността на сукцинат дехидрогеназата. Този ензим е част от ензимната циклична система – цикъла на Кребс. Неговият естествен субстрат е сукцинат, а неговият конкурентен инхибитор е оксалоацетат, междинен продукт от същия цикъл на Кребс:

Подобен конкурентен инхибитор на сукцинат дехидрогеназата е малоновата киселина, която често се използва в биохимичните изследвания.

Действието на много фармакологични препарати, пестициди, използвани за унищожаване на селскостопански вредители, и химически бойни агенти се основава на принципа на конкурентното инхибиране.

Например, група антихолинестеразни лекарства, които включват производни на кватернерни амониеви бази и органофосфорни съединения, са конкурентни инхибитори на холинестеразния ензим по отношение на неговия субстрат ацетилхолин. Холинестеразата катализира хидролизата на ацетилхолин, медиатор на холинергичните системи (невромускулни синапси, парасимпатикова система и др.). Антихолинестеразните вещества се конкурират с ацетилхолина за активното място на ензима, свързват се с него и изключват каталитичната активност на ензима. Лекарства като прозерин, физостигмин, севин инхибират обратимо ензима, докато органофосфорните лекарства като армин, нибуфин, хлорофос, соман действат необратимо, като фосфорилират каталитичната група на ензима. В резултат на тяхното действие ацетилхолинът се натрупва в онези синапси, където е медиатор на нервното възбуждане, т.е. организмът е отровен от натрупания ацетилхолин. Действието на обратимите инхибитори постепенно изчезва, тъй като колкото повече ацетилхолин се натрупва, толкова по-бързо той измества инхибитора от активния център на холинестераза. Токсичността на необратимите инхибитори е несравнимо по-висока, поради което те се използват за борба с селскостопански вредители, домашни насекоми и гризачи (например хлорофос) и като химически бойни агенти (например зарин, зоман и др.).

Неконкурентно инхибиране

При неконкурентно инхибиране специфичен инхибитор не влияе на константата на дисоциация на ензимно-субстратния комплекс. От друга страна, максималната постижима скорост на реакция е по-ниска в присъствието на инхибитор, отколкото в негово отсъствие, дори при безкрайно голям излишък от субстрата. Наличието на инхибиране доказва, че инхибиторът се свързва с протеина. Инвариантността на константата на дисоциация както в присъствието, така и в отсъствието на инхибитора, от своя страна показва, че за разлика от субстрата, инхибиторът се свързва с друга група. От теоретична гледна точка механизмът на такова инхибиране може да се тълкува по различни начини.

а) Мястото на свързване и каталитичното място на ензима са различни. В този случай инхибиторът, свързан с каталитичния център, намалява активността на ензима и максимално постижимото
скорост, без да се засяга образуването на ензимно-субстратния комплекс.

b) Мястото на свързване и каталитичното място се припокриват
повърхността на ензима, а инхибиторът се свързва с други групи на протеина. Поради свързването на инхибитора с повърхността на ензима, информацията на протеина се променя и става неблагоприятна за осъществяване на катализа.

в) Инхибиторът не се свързва нито с каталитичното място, нито с мястото на свързване и по този начин не засяга конформацията на протеина. Въпреки това, той може локално да промени разпределението на заряда в област от повърхността на протеина. Инхибиране на активността може да настъпи и в този случай, ако например йонизацията на групи, необходими за проявата на активност, е невъзможна или ако, напротив, настъпи йонизация на групи, активни само в нейонизирана форма. Това явление се наблюдава главно при използване на силно киселинни или силно алкални реагенти.

Инхибиторът и субстратът не повлияват взаимното свързване с ензима, но ензимните комплекси, съдържащи инхибитора, са напълно неактивни. В този случай могат да се приемат следните елементарни етапи:

v i / V = ​​/ [E] T

[E] T = [E] + + +

/ v i = (K s / V [S]) (1 + [I] / K I) + (1 / V) (1 + [I] / K I)

Ако [I] = K I, наклоните на правите линии и ординатите на пресечната точка с вертикалната ос се удвояват в сравнение с 1/v 0 .

Неконкурентни инхибитори са например цианидите, които са силно свързани с фери желязото, което е част от каталитичния сайт на ензима хемин - цитохром оксидаза. Блокирането на този ензим изключва дихателната верига и клетката умира. Неконкурентните ензимни инхибитори включват йони на тежки метали и техните органични съединения. Поради това йони на тежки метали на живак, олово, кадмий, арсен и други са много токсични. Те блокират например SH-групите, включени в каталитичния сайт на ензима.

Неконкурентни инхибитори са цианидите, които са силно свързани с фери желязото, което е част от каталитичния сайт на хемичния ензим - цитохром оксидаза. Блокирането на този ензим изключва дихателната верига и клетката умира. Невъзможно е да се премахне действието на неконкурентния инхибитор с излишък от субстрата (както действието на конкурентен), а само с вещества, които свързват инхибитора - реактиватори.

Неконкурентните инхибитори се използват като фармакологични агенти, токсични вещества за борба с вредителите в селското стопанство и за военни цели. В медицината се използват препарати, съдържащи живак, арсен, бисмут, които неконкурентно инхибират ензимите в клетките на тялото или патогенните бактерии, което обуславя един или друг техен ефект. В случай на интоксикация е възможно свързването на отровата или нейното изместване от ензимно-инхибиторния комплекс с помощта на реактиватори. Те включват всички SH-съдържащи комплексони (цистеин, димеркаптопропанол), лимонена киселина, етилендиаминтетраоцетна киселина и др.

Неконкурентно инхибиране

Този тип инхибиране се нарича още антиконкурентно инхибиране в литературата. или свързано инхибиране , обаче терминът "неконкурентно инхибиране" е най-широко използваният. Характеристиката на този тип инхибиране е, че инхибиторът не може да се прикрепи към ензима, но се прикрепя към комплекса ензим-субстрат.

В случай на неконкурентно инхибиране, комплексът, съдържащ инхибитора, е неактивен:

v i / V = ​​/ [E]

[E]T = [E] + +

/ v i = Ks / V[S] + (1 / V) (1 + [I] / K I)

субстратно инхибиране

Субстратното инхибиране е инхибиране на ензимна реакция, причинена от излишък от субстрат. Такова инхибиране възниква поради образуването на ензим-субстратен комплекс, който не е в състояние да претърпи каталитични трансформации.Комплексът ES 2 е непродуктивен и прави ензимната молекула неактивна. Инхибирането на субстрата се причинява от излишък на субстрата, следователно, той се отстранява, когато концентрацията му намалее.

Алостерично инхибиране

Алостеричната регулация е характерна само за специална група ензими с кватернерна структура, които имат регулаторни центрове за свързване на алостерични ефектори. Отрицателните ефектори, които инхибират превръщането на субстрата в активното място на ензима, действат като алостерични инхибитори. Положителните алостерични ефектори, напротив, ускоряват ензимната реакция и затова се наричат ​​алостерични активатори. Алостеричните ефектори на ензимите са най-често различни метаболити, както и хормони, метални йони и коензими. В редки случаи молекулите на субстрата играят ролята на алостеричен ефектор на ензимите.

Механизмът на действие на алостеричните инхибитори върху ензима е да променят конформацията на активното място. Намаляването на скоростта на ензимната реакция е или следствие от повишаване на K m или намаляване на максималната скорост V max при същите концентрации на насищащ субстрат, т.е. ензимът е частично неактивен.

Алостеричните ензими се различават от другите ензими по своята специфична S-образна крива на скоростта на реакцията спрямо концентрацията на субстрата. Тази крива е подобна на кривата на насищане с кислород на хемоглобина; тя показва, че активните центрове на субединиците не функционират автономно, а съвместно, т.е. афинитетът на всеки следващ активен център към субстрата се определя от степента на насищане на предишните центрове. Координираната работа на центровете се определя от алостерични ефектори.

Алостеричната регулация се проявява под формата на инхибиране от крайния продукт на първия ензим във веригата. Структурата на крайния продукт след серия от трансформации на изходното вещество (субстрат) не е подобна на субстрата, така че крайният продукт може да действа върху първоначалния ензим на веригата само като алостеричен инхибитор (ефектор). Външно такова регулиране е подобно на регулирането чрез механизма за обратна връзка и ви позволява да контролирате изхода на крайния продукт, в случай на натрупване, работата на първия ензим във веригата спира. Например, аспартат карбамоилтрансфераза (ACTase) катализира първата от шестте реакции в синтеза на цитидин трифосфат (CTP). CTP е алостеричен инхибитор на AKTase. Следователно, когато CTP се натрупва, настъпва инхибиране на AKTase и по-нататъшният синтез на CTP спира. Открита е алостерична регулация на ензимите с помощта на хормони. Например, естрогените са алостеричен инхибитор на ензима глутамат дехидрогеназа, който катализира деаминирането на глутаминовата киселина.

Така дори най-простото кинетично уравнение за ензимна реакция съдържа няколко кинетични параметъра, всеки от които зависи от температурата и средата, в която протича реакцията.

Инхибиторите позволяват не само да се разбере същността на ензимната катализа, но и са един вид инструмент за изследване на ролята на отделните химични реакции, които могат да бъдат специално изключени с помощта на инхибитор на даден ензим.

3. Някои устройства, полезни за определяне на началните скорости на реакция

Много проблеми на ензимната кинетика водят до определяне на началните скорости на реакцията (v 0). Основното предимство на този метод е, че стойностите v0, определени в началния момент от време, ще дадат най-точно представяне на активността на изследваните ензими, тъй като натрупващите се реакционни продукти все още нямат време да упражняват инхибиращ ефект върху ензима и, в допълнение, реагиращата система е в състояние на стационарно равновесие.

В лабораторната практика обаче, когато се използват конвенционални спектрофотометрични, титриметрични или други техники за записване на хода на такива реакции, в най-добрия случай се губят до 15-20 секунди от първоначалното време за въвеждане на ензима в субстрата, смесване на реагиращите система, настройка на клетката и т.н. И това е неприемливо, тъй като в този случай допирателната се довежда до точката, където tg ά 2< tg ά 1 . Не компенсируется потеря начального времени и при математической обработке таких кривых при записи выхода v 0 на максимальный уровень (V). Кроме того, протекание реакций без постоянното смесване допълнително се усложнява от колебанията в обемните концентрации на реагентите.

Предложените по-долу прости устройства за спектрофотометър, pH метър и други подобни позволяват значително намаляване на източниците на посочените грешки при определяне на v 0 .

3.1 Устройство към спектрофотометъра

Устройството за спектрофотометъра се състои от дозатор 1, въртяща се тефлонова резба 2 (бъркалка) и фиксираща капачка 3.

Дозаторът е микропипета, единият край на която е оформен с игла 4, а другият - с уширител 5 (за да се предотврати навлизането на ензима в гумения накрайник 6).

Тефлоновото покритие 3, покриващо спектралната кювета 7, има два отвора: единият (8) в центъра на капака, вторият (9) над средата на пролуката между непрозрачната стена на кюветата 7 и светлинния лъч 10. Тефлон тръба 11 (вътрешен диаметър 1 -1,5 mm) е фиксирана в единия край в отвор 9, а другият - върху фиксиран перваз 12 пред ротора на двигателя 13. Вътре в тръбата се вкарва тефлонова резба 2 (дебелина на резбата 0,5-0,6 mm ). Единият край на конеца е фиксиран върху въртящия се ротор на двигателя 13, вторият - прекаран в кюветата 7 - е оформен под формата на спирала (за подобряване на смесването). Позицията на конеца се определя от фиксиращата капачка 3, независимо от разстоянието на двигателя, което е удобно при работа, изискваща честа смяна на кюветите.

Принцип на действие.Кварцовата кювета на спектрофотометъра 7 се пълни със субстрат 14 (около 1,5-2,0 ml), вмъкнат в термостатичния кюветодържач на спектрофотометъра, затворен с капак 3 с въртяща се тефлонова резба 2, който е потопен в субстрата14 и всички по-нататъшни операции се извършват вече в светлинния лъч на спектрофотометъра и се записват на рекордера.

В началото на работа субстратът се смесва и писалката на рекордера записва плоска хоризонтална (или „нула“) линия. Дозаторът (с ензима) се вкарва в отвор 8 (иглата се потапя в разтвора на субстрата 14), чрез бързо притискане на върха 6 ензимът (обикновено около 0,03-0,05 ml) се въвежда в субстрата и дозаторът се отстранява. Смесването на компонентите завършва за 2,5-3 s, а писалката на записващото устройство фиксира началото на реакцията, като отклонява кривата на оптичната плътност (ΔA) спрямо времето.

Такова устройство също така дава възможност да се вземат проби от реагиращата система за анализ; добавете инхибитори и активатори към системата; промяна на условията на реакцията (промяна на pH, йонна сила и т.н.), без да се нарушава регистрирането на хода на реакцията, което е много удобно, например, при изследване на разделянето н-NFF "киселинни" фосфатази, където се разцепват н-NFF се провежда при pH 5,0 (или pH 6-7), а активността на ензимите се определя от натрупването н-нитрофенолатни йони при pH 9,5-10,0.

Такова устройство е удобно и за извършване на спектрофотометрично титруване на ензими и др.

3.2 Устройство за pH метър

Устройството за pH метъра се състои от модифициран накрайник на проточния електрод 1, полумикроклетка 2, дозатор 3 и електронна схема за свързване на pH метъра към рекордера. В допълнение, устройството включва стандартен електрод на pH метър (4), капак на държача на клетка (5), термостатична поточна камера (6), разтвор на субстрат (7), пасивен магнит (8) и активен магнит ( 9).

Стандартният накрайник на проточния електрод на pH метъра (LPU-01) се заменя с тефлонова тръба 1 (вътрешен диаметър 1,3-1,5 mm), напълнена с азбестова нишка, предварително обработена с наситен разтвор на KCl. Плътността на пълнене на нишката се контролира така, че скоростта на потока на разтвора на KCl през тръбата да е близка до скоростта на потока на оригиналния немодифициран електрод. Тази смяна на накрайника позволява да се намали размерът на оригиналната работна клетка от 20–25 на 2 ml, което дава възможност да се управляват с минимални обеми (1,5 ml) разтвори на скъпи биохимични препарати.

Електронната схема за свързване на pH метър (LPU-01) към рекордера се състои от източник на захранване (DC батерия 12 V), променливо съпротивление на проводника R 1 (10 - 100 Ohm), което задава напрежение от 9 V на D809 ценеров диод според показанията на волтметъра, променливо съпротивление на проводника R 2 (15-150 Ohm), което регулира настройката на "нула" (референтна точка) на показанията на pH метъра на скалата на рекордера, и променливата съпротивление на проводника R 3 (35-500 Ohm), което регулира скалата на разширение (усилване) на показанията на pH скалата - измервателни уреди на рекордера. Веригата работи надеждно, докато напрежението на източника падне под 9 V.

Принцип на действие. 1,5 ml от субстрата се въвежда в клетката (стъклен цилиндър 1,7x2,4 cm) и клетката се фиксира върху фиксиращата капачка 5. Разбъркването 9 е включено и записващата писалка записва четна (основна) референтна линия . С помощта на дозатор 0,03 ml от ензимния разтвор се въвежда в субстрата и писалката на записващото устройство фиксира началото на реакцията, като отклонява кривата на pH спрямо времето (t).

Такова устройство не замества pH stat, но като се има предвид възможността за разширяване на скалата на pH метъра, ви позволява надеждно да записвате малки промени в pH 0,004-0,005.

3.3 Номограмни линийки, удобни за определяне на началната скорост

Значителна сложност при определянето на началната скорост в метода на допирателните е изчисляването на съотношенията на промените в концентрациите на реагентите (Δ[S]) за единица време (Δt), т.е. израз v 0 в M/min от условията, които

v 0 = lim Δ[S] / Δt, at, t 0.

На практика такава процедура обикновено се състои от три или четири отделни операции: допирателна се изтегля към началния участък от кривата на реакцията, след това броят на единиците от регистрираната стойност (оптична плътност, ъгъл на въртене и т.н.) за определена интервалът от време се отчита и това води до единица време и накрая се преизчисляват показанията на рекордера за промяната в концентрацията на реагента за 1 min (M/min). Предложените два вида номограмна линийка позволяват да се опрости тази процедура.

Правоъгълна линийка. v 0 е съотношението Δ[S]/Δt, т.е. tg ά, където ά е ъгълът на наклон на допирателната към оста на времето t. Същата допирателна е и хипотенузата на съответния правоъгълен триъгълник с катети [S] и t. Колкото по-голям е v 0, толкова по-стръмен е наклонът на допирателната. Следователно, ако се ограничим до определен интервал от време, например 1 минута, тогава ще получим серия от правоъгълни триъгълници с различни стойности на крака [S] (всъщност различни стойности на v 0) . Ако обаче двата крака са градуирани: хоризонтално - в референтни единици за време (1 мин) и вертикално - в единици за промяна в концентрациите на реагента, например в милимола (mM), и приложете получените сегменти в подходящ формат от прозрачен материал (плексиглас с дебелина около 2 мм) , тогава можете да получите удобна линийка за определяне на началните скорости на реакция. Всички числа и линии са отпечатани на обратната страна на линийката, за да се елиминират грешките в паралакса при определяне на v 0 .

Процедурата за определяне на v 0 в този случай се свежда до две прости операции: допирателна се изтегля към началния участък на кинетичната крива t 2 и комбинирайте нулевата точка на хоризонталния крак t на линийката с началото на допирателната, продължението на допирателната вече ще пресече концентрационната скала [S] в точката, която определя стойността на v 0 в M/min (когато кракът t е хоризонтален, не са необходими допълнителни операции.

Дъгова линия.Процедурата за определяне на v 0 може да бъде опростена до една операция, ако скалата на концентрацията е нанесена по дъга с определен радиус.

Права („основна“) линия 2 се нанася върху плоча от прозрачен материал (всички числа и линии се нанасят и на обратната страна на линийката) и от нулевата точка (t=0, min) на тази линия с радиус равен на дължината на крака t=1 min [ , начертайте дъга [S], отгоре надолу, по която е положена скалата на промените в концентрациите на реагента (например субстрат в mM).

Описаните типове линийки, уред за спектрофотометър и рН метър се използват от редица години за определяне на началните скорости на реакцията (v 0), при изследване на субстратната специфичност на ензимите, за спектрофотометрично титруване и др.

Заключение

В тази статия беше разгледан раздел от ензимологията, който изучава зависимостта на скоростта на химичните реакции, катализирани от ензими, от редица фактори на околната среда. За основатели на тази наука се смятат Михаелис и Ментен, които публикуват своята теория за общия механизъм ензимни реакции, получено уравнение, което се е превърнало в основен принцип на всички кинетични изследвания на ензимите, то служи като отправна точка за всяко количествено описание на действието на ензимите. Оригиналното уравнение на Михаелис-Ментен е хиперболично уравнение; Lineweaver и Burke допринесоха за кинетиката, като трансформираха уравнението на Michaelis-Menten и получиха графика на права линия, от която стойността на V max може да бъде най-точно определена.

С течение на времето промяната в скоростта на ензимната реакция в ензимната реакция при експериментални условия намалява. Намаляване на скоростта може да възникне поради редица фактори: намаляване на концентрацията на субстрата, повишаване на концентрацията на продукт, който може да има инхибиращ ефект, промени в pH на разтвора и промени в може да възникне температура на средата. Така за всеки 10°C повишаване на температурата скоростта на реакцията се удвоява или дори по-малко. Ниската температура обратимо инактивира ензимите. Зависимостта на скоростта на ензимната реакция от pH показва състоянието на функционалните групи на активния център на ензима. Всеки ензим реагира различно на промените в pH. Химичните реакции могат да бъдат спрени, като се въздейства върху тях с различни видове инхибиране. Първоначалната скорост на реакцията може да се определи бързо и точно с помощта на устройства като номограмни линийки, спектрофотометър и pH метър. Това позволява най-точно представяне на активността на изследваните ензими.

Всичко това се използва активно днес в медицинската практика.

Списък на използваните източници

1. Белясова Н.А. Биохимия и молекулярна биология. - Минск: Книжна къща, 2004. - 416 с., ил.

Келети Т. Основи на ензимната кинетика: Пер. от английски. - М.: Мир, 1990. -350 с., ил.

3. Knorre D.G. Биологична химия: Proc. за химически, биол. и мед. специалист. университети. - 3-то изд., преп. - М.: По-високо. училище 2002. - 479 с.: ил.

4. Крупяненко V.I. Векторен метод за представяне на ензимни реакции. - М.: Наука, 1990. - 144 с.

5. Ленингер А. Биохимия. Молекулни основи на структурата и функцията на клетката: Пер. от английски. - М.: Мир, 1974.

6. Строев Е.А. Биологична химия: Учебник по фармация. ин-тов и фармак. fak. пчелен мед. другар. - М.: Висше училище, 1986. - 479 с., ил.

Северин Е.С. биохимия. а. - 5-то изд. - М.: ГЕОТЪР - Медия, 2009. - 786 с., ил.

Този раздел от ензимологията изучава влиянието на различни фактори върху скоростта на ензимната реакция. Като се вземе предвид общото уравнение на ензимната катализа на обратимата реакция на трансформация на един субстрат в един продукт (1),

основните фактори, влияещи върху скоростта на ензимната реакция, трябва да бъдат посочени: концентрация на субстрата [S], концентрация на ензима [E] и концентрация на реакционния продукт [P].

Взаимодействието на някои ензими с техния субстрат може да се опише с хиперболична крива на зависимостта на скоростта на ензимната реакция V от концентрацията на субстрата [S] (фиг. 19):

Фиг. 19. Зависимост на скоростта на ензимната реакция от концентрацията на субстрата.

На тази крива могат да се разграничат три сегмента, които могат да се обяснят с позициите на механизма на взаимодействие на ензима със субстрата: OA е сегментът на право пропорционалната зависимост на V от [S], активните места на ензима постепенно се запълват със субстратни молекули с образуването на нестабилен комплекс ES; участък AB - криволинейна зависимост на V от [S], все още не е постигнато пълно насищане на активните центрове на ензима със субстратни молекули. ES комплексът преди достигане на преходно състояние е нестабилен, вероятността от обратна дисоциация към E и S все още е висока; участък BC - зависимостта се описва с уравнение от нулев порядък, секцията е успоредна на оста [S], постига се пълно насищане на активните ензими със субстратни молекули, V=V max .

Характерната форма на кривата се описва математически от уравнението на Бригс-Халдейн:

V=V max ● [S]/ Km + [S] (2),

където Km е константата на Michaelis-Menten, числено равна на концентрацията на субстрата, при която скоростта на ензимната реакция е равна на половината V max .

Колкото по-нисък е Km на ензима, толкова по-висок е афинитетът на ензима към субстрата, толкова по-бързо се достига преходното състояние за субстрата и той се превръща в продукт на реакцията. Търсенето на стойности на Km за всеки от субстратите на ензима с групова специфичност е важно за определяне на биологичната роля на този ензим в клетката.

За повечето ензими е невъзможно да се построи хиперболична крива (фиг. 19) В този случай се използва двойният реципрочен метод (Lineweaver-Burk), т.е. е нанесена графична зависимост на 1/[V] от 1/[S] (фиг. 20). Методът за конструиране на такива криви в експеримент е много удобен при изследване на ефекта на различни видове инхибитори върху активността на ензимите (вижте текста по-долу).

Фиг.20. График на 1/[V] срещу 1/[S] (метод Lineweaver-Burk),

където y гранична площ - , и x - гранична площ - , тангенсът на ъгъла α - .

Зависимост на скоростта на ензимната реакция V от концентрацията на ензима [E].

Тази графична зависимост (фиг. 21) се разглежда при оптимална температура и рН на околната среда, при концентрации на субстрата, които са значително по-високи от концентрацията на насищане на активните места на ензима.

Ориз. 21. Влияние на концентрацията на ензима върху скоростта на ензимната реакция.

Зависимост на скоростта на ензимната реакция от концентрацията на кофактора или коензима.За сложни ензими трябва да се има предвид, че дефицитът на коензимни форми на витамини при хиповитаминоза, нарушение на приема на метални йони в организма непременно водят до намаляване на концентрацията на съответните ензими, необходими за протичането на метаболитните процеси. процеси. Следователно трябва да се заключи, че активността на ензима е в пряка зависимост от концентрацията на кофактора или коензима.

Влияние на концентрацията на продуктите върху скоростта на ензимната реакция.За обратими реакции, протичащи в човешкото тяло, трябва да се има предвид, че продуктите от директната реакция могат да бъдат използвани от ензима като субстрати за обратната реакция. Следователно посоката на потока и моментът на достигане на V max зависят от съотношението на концентрациите на изходните субстрати и реакционните продукти. Например, активността на аланин аминотрансфераза, която катализира трансформацията:

Аланин + Алфа-кетоглутарат ↔ Пируват + Глутамат

зависи в клетката от съотношението на концентрациите:

[аланин + алфа-кетоглутарат] / [пируват + глутамат].

МЕХАНИЗЪМ НА ДЕЙСТВИЕ НА ЕНЗИМИ. ТЕОРИИ НА ЕНЗИМНИЯ КАТАЛИЗ

Ензимите, подобно на непротеиновите катализатори, увеличават скоростта на химическата реакция поради способността си да намаляват енергията на активиране на тази реакция. Енергията на активиране на ензимна реакция се изчислява като разликата между енергийната стойност в системата на протичащата реакция, която е достигнала преходното състояние, и енергията, определена в началото на реакцията (вижте графичната зависимост на фиг. 22).

Ориз. 22. Графична зависимост на енергийното състояние на химична реакция без ензим (1) и при наличие на ензим (2) от времето на реакцията.

Работите на В. Хенри и по-специално Л. Михаелис, М. Ментен по изучаването на механизма на моносубстратните обратими ензимни реакции позволяват да се постулира, че ензимът Е първо обратимо и относително бързо се комбинира със своя субстрат S, за да образува ензим-субстратен комплекс (ES):

E+S<=>ES (1)

Образуването на ES възниква поради водородни връзки, електростатични, хидрофобни взаимодействия, в някои случаи ковалентни, координационни връзки между страничните радикали на аминокиселинните остатъци на активния център и функционалните групи на субстрата. При комплексните ензими небелтъчната част на структурата може да изпълнява и функцията на контакт със субстрата.

След това комплексът ензим-субстрат се разпада във втора по-бавна обратима реакция, за да образува реакционния продукт Р и свободния ензим Е:

ES<=>EP<=>E + P (2)

Понастоящем, благодарение на работата на гореспоменатите учени, както и на Kaylin D., Chance B., Koshland D. (теорията на „индуцираното съответствие“), съществуват теоретични положения по четири основни точки в механизма на ензимно действие върху субстрата, което определя способността на ензимите да ускоряват химичните реакции.реакции:

1. Ориентация и близост . Ензимът е в състояние да свърже молекулата на субстрата по такъв начин, че връзката, атакувана от ензима, не само е разположена в непосредствена близост до каталитичната група, но също така е правилно ориентирана спрямо нея. Вероятността ES комплексът да достигне преходно състояние поради ориентация и подход се увеличава значително.

2. Стрес и напрежение : индуцирано прилягане. Прикрепването на субстрат може да причини конформационни промени в ензимната молекула, които водят до напрежение в структурата на активното място, а също и до известна степен да деформират свързания субстрат, като по този начин улесняват постигането на преходно състояние от ES комплекса. Между E и S молекулите съществува така нареченото индуцирано съответствие.

Ензимната кинетика изучава скоростта на реакциите, катализирани от ензими в зависимост от различни условия (концентрация, температура, pH и др.) на тяхното взаимодействие със субстрата.

Ензимите обаче са белтъчини, които са чувствителни към влиянието на различни външни влияния. Следователно при изследване на скоростта на ензимните реакции се вземат предвид главно концентрациите на реагентите и се опитват да се сведат до минимум влиянието на температурата, pH на средата, активаторите, инхибиторите и други фактори и се създават стандартни условия. Първо, това е оптималната стойност на pH на средата за този ензим. Второ, препоръчва се температурата да се поддържа на 25°C, когато е възможно. На трето място се постига пълно насищане на ензима със субстрата. Този момент е особено важен, тъй като при ниска концентрация на субстрата не всички ензимни молекули участват в реакцията (фиг. 6.5, а), което означава, че резултатът ще бъде далеч от максимално възможния. Най-високата мощност на катализираната реакция, при равни други условия, се постига, ако всяка ензимна молекула участва в трансформацията, т.е. при висока концентрация на комплекса ензим-субстрат (фиг. 6.5, v).Ако концентрацията на субстрата не осигурява пълно насищане на ензима (фиг. 6.5, б), тогава скоростта на протичащата реакция не достига максималната стойност.

Ориз. 65

а -при ниска концентрация на субстрата; 6 - с недостатъчна концентрация на субстрата; v -когато ензимът е напълно наситен със субстрата

Скоростта на ензимната реакция, измерена при горните условия, и пълното насищане на ензима със субстрата се нарича максимална скорост на ензимна реакция (V).

Скоростта на ензимната реакция, определена, когато ензимът не е напълно наситен със субстрата, се обозначава v.

Ензимната катализа може да бъде описана опростено със схемата

където F е ензим; S - субстрат; FS - ензим-субстратен комплекс.

Всеки етап от този процес се характеризира с определена скорост. Единицата за измерване на скоростта на ензимна реакция е броят на моловете от субстрата, превърнати в единица време(като скоростта на нормална реакция).

Взаимодействието на ензима със субстрата води до образуване на ензим-субстратен комплекс, но този процес е обратим. Скоростите на предните и обратните реакции зависят от концентрациите на реагентите и се описват със съответните уравнения:

Уравнението (6.3) е валидно при равновесие, тъй като скоростите на правата и обратната реакция са равни.

Замествайки скоростите на директните (6.1) и обратните (6.2) реакции в уравнение (6.3), получаваме равенството:

Състоянието на равновесие се характеризира със съответните равновесна константа K p,равно на съотношението на константите на директната и обратната реакция (6.5). Реципрочната стойност на равновесната константа се нарича субстратна константа K s ,или константата на дисоциация на комплекса ензим-субстрат:

От уравнение (6.6) става ясно, че субстратната константа намалява при висока концентрация на комплекса ензим-субстрат, т.е. с голяма стабилност. Следователно, субстратната константа характеризира афинитета на ензима и субстрата и съотношението на константите на скоростта за образуване и дисоциация на комплекса ензим-субстрат.

Феноменът на насищане на ензим със субстрат е изследван от Леонор Михаелис и Мод Мептен. Въз основа на математическата обработка на резултатите те извеждат уравнение (6.7), което получава своите имена, от които става ясно, че при висока концентрация на субстрата и ниска стойност на субстратната константа, скоростта на ензимната реакция се стреми до максимум. Това уравнение обаче е ограничено, тъй като не отчита всички параметри:

Ензимно-субстратният комплекс по време на реакцията може да претърпи трансформации в различни посоки:

• дисоциират в изходните вещества;
• се превръща в продукт, от който ензимът се отделя непроменен.

Следователно, за да се опише цялостният ефект на ензимния процес, концепцията константи на Михаелис K t,което изразява връзката на константите на скоростта и на трите реакции на ензимната катализа (6.8). Ако и двата члена се разделят на константата на скоростта на реакцията на образуване на комплекса ензим-субстрат, тогава ще се получи изразът (6.9):

Важно следствие следва от уравнение (6.9): константата на Михаелис винаги е по-голяма от константата на субстрата с k 2 /кв

Числено К те равна на такава концентрация на субстрата, при която скоростта на реакцията е половината от максималната възможна скорост и съответства на такова насищане на ензима със субстрата, както е на фиг. 6.5, б.Тъй като на практика не винаги е възможно да се постигне пълно насищане на ензима със субстрата, това е така К тизползвани за сравняване на кинетичните характеристики на ензимите.

Скоростта на ензимната реакция в случай на непълно насищане на ензима със субстрата (6.10) зависи от концентрацията на комплекса ензим-субстрат. Коефициентът на пропорционалност е реакционната константа за освобождаване на ензима и продукта, тъй като това променя концентрацията на комплекса ензим-субстрат:

След трансформации, като се вземат предвид зависимостите, представени по-горе, скоростта на ензимната реакция в случай на непълно насищане на ензима със субстрата се описва с уравнение (6.11), т.е. зависи от концентрациите на ензима, субстрата и техния афинитет Ks:

Графичната зависимост на скоростта на ензимната реакция от концентрацията на субстрата не е линейна. Както е очевидно от фиг. 6.6, с увеличаване на концентрацията на субстрата се наблюдава повишаване на активността на ензима. Въпреки това, когато се достигне максималното насищане на ензима със субстрата, скоростта на ензимната реакция става максимална. Следователно, факторът, ограничаващ скоростта на реакцията, е образуването на комплекс ензим-субстрат.

Практиката показва, че концентрациите на субстрати, като правило, се изразяват в стойности, много по-малки от единица (10 6 -10 3 mol). Доста трудно е да се оперира с такива количества в изчисленията. Следователно G. Lineweaver и D. Burke предложиха да се изрази графичната зависимост на скоростта на ензимната реакция не в преки координати, а в обратни. Те изхождат от предположението, че при равни стойности техните реципрочни числа също са равни:

Ориз. 6.6.

След преобразуването на израза (6.13) се получава израз, наречен Уравнение на Lineweaver-Burk (6.14):

Графичната зависимост на уравнението на Lineweaver-Burk е линейна (фиг. 6.7). Кинетичните характеристики на ензима се определят, както следва:

• сегментът, отрязан по оста y, е равен на 1/V;
• сегментът, отрязан по оста x, е -1 /K t.

Ориз. 6.7.

Смята се, че методът на Lineweaver - Burke ви позволява по-точно да определите максималната скорост на реакция, отколкото в директни координати. От тази графика може да се извлече и ценна информация относно ензимното инхибиране.

Има и други начини за трансформиране на уравнението на Михаелис-Ментен. Графичните зависимости се използват при изследване на влиянието на различни външни влияния върху ензимния процес.